張　磊， 周　艷， 閆姍姍， 解裕萍， 耿盼盼， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 昆明 650118)

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Adipsin腺病毒載體構(gòu)建及對2型糖尿病大鼠的治療作用

張磊， 周艷， 閆姍姍， 解裕萍， 耿盼盼， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 昆明 650118)

脂肪因子adipsin是由脂肪細(xì)胞分泌的一類細(xì)胞信號蛋白，其在刺激胰島素分泌、控制血糖中具有重要的調(diào)控作用。以重組腺病毒系統(tǒng)作為載體，將adipsin轉(zhuǎn)移至Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 2型糖尿病大鼠體內(nèi)，對大鼠進(jìn)行基因治療探索，為進(jìn)一步研究脂肪因子adipsin與代謝性疾病如2型糖尿病等之間相互作用機制提供了前期的基礎(chǔ)。首先，通過構(gòu)建攜帶adipsin的重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-CMV-adipsin，并在HEK293細(xì)胞中成功包裝出重組腺病毒Ad-adipsin；其次，通過PCR和Western blotting檢測ADIPSIN蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)；最后，測定重組腺病毒Ad-adipsin滴度，并通過尾靜脈注射的方式，將重組腺病毒Ad-adipsin導(dǎo)入2型糖尿病模型大鼠體內(nèi)，評價脂肪因子adipsin的基因治療作用。研究結(jié)果顯示， 2型糖尿病模型大鼠ZDF(fa/fa)的空腹血糖值(FPG)、空腹胰島素值(FINS)、血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)等與注射重組腺病毒Ad-lacZ的對照組相比有顯著下降(P<0.05)，并且胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)顯著降低(P<0.05)，以上結(jié)果表明，重組腺病毒Ad-adipsin可以有效改善2型糖尿病模型ZDF大鼠的糖、脂質(zhì)代謝紊亂，對大鼠2型糖尿病發(fā)生發(fā)展具有一定的保護(hù)效果。

adipsin；ZDF大鼠；2型糖尿病

糖尿病是威脅全球人類健康的重大非傳染性疾病之一，到2011年全球糖尿病人數(shù)已經(jīng)達(dá)到3.7億[1]，而中國18歲到79歲之間的糖尿病患者已達(dá)到9000萬[2]。在我國患病人群中90%為2型糖尿病[3]。2型糖尿病一個最主要特征就是由于胰島素缺乏和胰島素抵抗而引起的高血糖癥[4]。研究表明，胰島損傷的2型糖尿病患者血液中adipsin含量嚴(yán)重下降[5]，通過體外增加adipsin可以降低胰島素抵抗，改善胰島β細(xì)胞的狀況，而超出正常范圍的adipsin對健康的胰島β細(xì)胞卻沒有損傷[6]。ADIPSIN早在1987年就被發(fā)現(xiàn)是一種絲氨酸蛋白激酶，是最早發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，之后被證明與補體因子D是同一種物質(zhì)[7-8]，此后發(fā)現(xiàn)其在刺激胰島素分泌、控制血糖中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[9]。 因此，本文通過腺病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝重組腺病毒Ad-adipsin，并將其導(dǎo)入2型糖尿病大鼠模型中，進(jìn)行基因治療評價，以其改善2型糖尿病大鼠的癥狀體征，為研究adipsin在2型糖尿病中的保護(hù)效果及機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

SalⅠ、EcoRⅣ、PacⅠ等多種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，Lipofectamine 3000脂質(zhì)體均購自Thermo公司。質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。山羊抗大鼠Adipsin IgG購自Santa公司。引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。大鼠adipsin ELISA試劑盒購自CUSABIO公司。HEK293細(xì)胞及pAdEasy腺病毒包裝系統(tǒng)由本科室保存。

1.2動物模型

清潔級8周齡的雄性ZDF(fa/fa)大鼠10只，體重150～160 g；清潔級8周齡雄性ZL(fa/+)大鼠5只，體重150～160 g均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.3方法

1.3.1Adipsin的PCR擴增

取成年SD大鼠1只，取其腹腔皮下脂肪組織，液氮研磨后，提取組織RNA，采用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，Random primer 1 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 1 μL，10mM dNTP 2 μL，Reverse Transcriptase 1 μL，RNA模板11 μL。反應(yīng)條件為：25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。通過查詢大鼠adipsin的mRNA序列及酶切位點，合成擴增引物P1、P2(表1)，PCR方法擴增出adipsin基因片段，將擴增產(chǎn)物通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收大小為792 bp的片段。

表1 Adipsin PCR擴增引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-adipsin的構(gòu)建

將回收的adipsin基因片段和用于作為連接載體的pShuttle-CMV質(zhì)粒用相同的內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRⅣ進(jìn)行雙酶切，分別將酶切后的adipsin目的片段和7.5 kb大小的pShuttle-CMV載體進(jìn)行膠回收并測定濃度。切出相同的黏性末端后，用T4連接酶將adipsin和pShuttle-CMV按10∶1的濃度，16℃進(jìn)行過夜連接。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，用含有卡那霉素的LB瓊脂板進(jìn)行篩選含有pShuttle-CMV-asipsin質(zhì)粒的DH5α。抽提質(zhì)粒后用SalⅠ和EcoRⅣ做酶切鑒定，并擴增[10]。

1.3.3pAdEasy-CMV-adipsin腺病毒載體的構(gòu)建

將用于同源重組的pShuttle-CMV-adipsin用PmeⅠ酶切線性化處理，膠回收試劑盒純化后用CIAP進(jìn)行去磷酸化處理并再次純化回收。將線性化質(zhì)粒pShuttle-CMV-adipsin與Ad-BJ5183感受態(tài)細(xì)胞做低溫處理后，使用電轉(zhuǎn)杯混合后進(jìn)行電擊穿孔轉(zhuǎn)化，LB培養(yǎng)基孵育45 min后用含有氨芐抗性的LB瓊脂板進(jìn)行篩選含有重組腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-CMV-adipsin的Ad-BJ5183。將重組后的pAdEasy-CMV-adipsin質(zhì)粒用XL-10感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，用PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定并測序。

1.3.4Ad-adipsin的包裝、擴增和滴度測定

將用于轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為10%FBS，無雙抗的H-DMEM培養(yǎng)基下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁率接近80%時，使用PacⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒pAdEasy-CMV-adipsin，并用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，6 h后換為無雙抗的DMEM培養(yǎng)液。8 d后大部分細(xì)胞病變脫落，反復(fù)凍融細(xì)胞后4000 r/min收集上清，將收獲的病毒液再次反復(fù)感染HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒擴增[11]。使用Reed-Muench法測定重組腺病毒Ad-adipsin的感染滴度。

1.3.5Ad-adipsin基因鑒定與蛋白表達(dá)Western blotting鑒定

分別提取Ad-adipsin和Ad-LacZ的 基因組DNA作為模板，以adipsin的特異引物和腺病毒特異引物做PCR，鑒定傳代后的重組腺病毒adipsin穩(wěn)定性。Ad-adipsin感染HEK293細(xì)胞24 h后，用RIPA裂解細(xì)胞獲得蛋白收獲液，用感染Ad-lacZ的HEK293細(xì)胞蛋白液作為對照組，用山羊抗大鼠adipsin特異性抗體進(jìn)行Western blotting檢測ADIPSIN蛋白的表達(dá)，β-actin做內(nèi)參。

1.3.6動物模型制備、分組與治療

ZDF大鼠普通飼料飼養(yǎng)1周后，采用高脂高糖飼料連續(xù)喂養(yǎng)2周；ZL大鼠采用正常飼料喂養(yǎng)。2周后檢測空腹血糖，以空腹血糖≥7.8 mmol/L作為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。將模型制備成功的ZDF大鼠隨機分為治療組與對照組，每組5只。治療組和對照組分別尾靜脈注射重組腺病毒Ad-adipsin和Ad-lacZ，每只大鼠注射劑量為1 mL，濃度為107CCID 50/mL；一周后將重組腺病毒濃縮10倍，再次注射相同劑量的濃縮腺病毒。

1.3.7葡萄糖耐量試驗

大鼠自由給水并禁食12 h，在清醒狀態(tài)下以2 g/kg·BW腹腔注射25%葡萄糖溶液，在注射后0、5、15、30、60、90和120 min從尾靜脈采血，用羅氏血糖檢測試紙測出血糖值并記錄血糖變化。

1.3.8血清生化指標(biāo)檢測

注射重組腺病毒1周后，大鼠自由給水并禁食12 h，采用尾靜脈采血，采用羅氏血糖檢測試紙記錄空腹血糖值，血樣于低溫過夜后，3500 r/min離心20 min，將血清分離并分裝于EP管中，-80℃凍存待測。采用放免法檢測血清胰島素水平，ELISA試劑盒檢測血清adipsin水平，并檢測血清FBG、FINS、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.3.9統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1PCR獲取大鼠adipsin

圖 1 PCR結(jié)果Fig 1 The result of PCR

M：DL2000 DNA Maker; 1：大鼠adipsin

以逆轉(zhuǎn)錄后的大鼠脂肪組織cDNA為模板，以P1、P2為引物，PCR特異性擴增大鼠adipsin，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，顯示大小為792 bp的特異性條帶，該條帶為大鼠adipsin的特異擴增引物(圖1)。

2.2Ad-adipsin構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒酶切鑒定

用SalⅠ與EcoR Ⅳ雙酶切穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-adipsin，通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳后顯示，該穿梭質(zhì)粒被雙酶切切成2條帶，片段大小為7.5 kb和792 bp(圖2A)；pAdEsay-CMV-adipsin陽性質(zhì)粒通過PacⅠ酶切，電泳后顯示為2條帶，小片段為4.5 kb(圖2B)。所有的酶切結(jié)果符合理論預(yù)期，表明adipsin基因片段已經(jīng)成功插入到腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy中。

圖2 構(gòu)建的相關(guān)載體酶切鑒定結(jié)果Fig 2 The results of enzyme cutting related vectors

A:SalⅠ和EcoR Ⅳ雙酶切pShuttle-CMV-adipsin結(jié)果;B：PacⅠ酶切pAdEasy-CMV-adipsin結(jié)果。M：DL10 000 DNA Maker

2.3Ad-adipsin病毒形態(tài)觀察和滴度測定

將包裝成功的腺病毒收獲液進(jìn)行電鏡透射觀察，電鏡下負(fù)染病毒顆粒直徑約為70～90 nm，符合典型的腺病毒20面體對稱結(jié)構(gòu)(圖3)。病毒進(jìn)行反復(fù)擴增后，Reed-Muench法測定重組腺病毒滴度為106CCID 50/mL，經(jīng)過進(jìn)一步濃縮后已經(jīng)達(dá)到實驗要求(圖4)。

圖3 透射電鏡觀察腺病毒負(fù)染結(jié)果Fig 3 The morphology of recombinant adenovirus observed by electron microscope

2.4adipsin在重組腺病毒中表達(dá)基因鑒定和Western blotting鑒定

為進(jìn)一步確認(rèn)adipsin已經(jīng)成功包裝入腺病毒，提取Ad-adipsin的基因組DNA并將DNA作為模板，用adipsin特異性引物進(jìn)行擴增，Ad-adipsin能夠被擴增出大小為792 bp的條帶，而對照病毒Ad-lacZ未能擴增出特異性條帶，說明Ad-adipsin中穩(wěn)定存在adipsin(圖5)。Western blotting可以檢測出Ad-adipsin在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)adipsin蛋白，大小為27 ku(圖6)。

圖4 病毒滴度測定結(jié)果Fig 4 The result of virus infectivity titre

圖5 Ad-adipsin基因鑒定Fig 5 The gene identification of Ad-adipsin

M：DL5000 DNA Maker; 1:Ad-lacZ腺病毒特異性基因；2：Ad-lacZ adipsin空白對照;3：Ad-adipsin腺病毒特異性基因;4：Ad-adipsin基因

圖6 Western blotting檢測adipsin表達(dá)情況Fig 6 The expression of adipsin protein detected by Western Blotting

1：Ad-lacZ感染HEK293細(xì)胞；2：Ad-adipsin感染HEK293細(xì)胞

2.5Ad-adipsin治療ZDF大鼠效果評價

2.5.1血清adipsin含量變化

通過用ELISA測定大鼠血清adipsin含量，與ZL正常對照組比較，ZDF模型組大鼠血清含量要明顯降低(P<0.05)，經(jīng)過Ad-adipsin治療后的大鼠血清adipsin含量要顯著高于ZDF模型組(P<0.05)，Ad-lacZ對照組與ZDF模型組沒有差異，結(jié)果表明經(jīng)過Ad-adipsin治療后，可以提高血清中adipsin的含量(表2)。

組別數(shù)量Adipsin(μg/mL)ZL正常對照組554.2±4.87ZDF模型組523.90±2.29*Ad-adipsin治療組543.46±2.14**Ad-LacZ對照組523.8±1.53^

與ZL正常對照組比較,*:P<0.05;與ZDF模型組比較,**:P<0.05

2.5.2葡萄糖耐量試驗結(jié)果

與ZL正常對照組相比，ZDF模型組的空腹血糖值大于7.8 mmol/L，在腹腔注射葡糖糖后5 min至10 min時血糖值達(dá)到最高，顯著高于ZL對照組(P<0.05)。并且到120 min時仍然保持在大于7.8 mmol/L水平上。而ZDF治療組空腹血糖與ZDF模型組相比已經(jīng)有顯著下降(P<0.05)，在腹腔注射葡萄糖后5 min時血糖值達(dá)到最高，在10 min時已經(jīng)開始下降，明顯低于ZDF對照組并且在120 min時也明顯低于ZDF模型組(P<0.05)。結(jié)果證明經(jīng)過Ad-adipsin治療后，2型糖尿病大鼠模型糖耐受狀況有明顯改善(圖7)。

圖7 葡萄糖耐量試驗血糖變化Fig 7 The variation tendency of blood glucose through glucose resistance assay

2.5.3血清生化指標(biāo)檢測

與ZL正常對照組比較，ZDF模型組大鼠的空腹血糖值(FPG)、空腹胰島素值(FINS)、血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)等各項指標(biāo)顯著升高(P<0.05)；與ZDF模型組比較，Ad-adipsin治療組的各項指標(biāo)均有明顯下降(P<0.05)，并且胰島素抵抗系數(shù)(HOMA-IR)明顯下降(P<0.05)，Ad-lacZ對照組與ZDF模型組沒有差異。結(jié)果表明，增加大鼠血清adipsin含量可以改善2型糖尿病大鼠的糖脂代謝，對2型糖尿病有治療作用。adipsin對模型大鼠生化指標(biāo)的影響見表3。

組別nFPGmmol/LFINSmU/LHOMA-IRTCmmol/LTGmmol/LHDLmmol/LLDLmmol/LZL對照組55.23±0.2119.24±2.731.49±0.131.58±0.350.67±0.261.04±0.220.49±0.13ZDF模型組515.56±1.29*39.36±5.11*3.29±0.08*7.89±0.36*8.55±0.41*2.34±0.23*4.16±0.29*Ad-adipsin治療組513.42±1.30**29.48±4.06**2.85±0.07*6.12±0.19**5.88±0.18**1.68±0.11**2.75±0.26*Ad-lacZ對照組516.13±0.7137.3±3.393.28±0.137.86±0.298.08±0.132.21±0.154.23±0.39

與對照組比較，*：P<0.05;與模型組比較，**：P<0.05

3　討論

ADIPSIN是一種絲氨酸蛋白激酶，主要由脂肪組織合成并釋放到血液中，后證明與補體因子D是同一種物質(zhì)，除了參與補體循環(huán)外，adipsin在維持胰島β細(xì)胞健康，維持胰島素正常水平分泌和降低胰島素抵抗上有著積極的意義。

本研究選用的是人腺病毒5型載體，是一種具有復(fù)制缺陷特點的病毒載體，并且具有感染細(xì)胞范圍廣、攜帶外源基因容量大、對機體無嚴(yán)重致病性等優(yōu)點，因此適合做基因治療的載體[12-13]。首先將adipsin基因片段插入到pShuttle-CMV載體中，通過同源重組的方法獲得了pAdEasy-adipsin重組腺病毒質(zhì)粒。酶切鑒定結(jié)果及測序結(jié)果表明該重組腺病毒載體含有adipsin基因片段且順序完全正確。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染7 d后細(xì)胞開始聚集病變。連續(xù)傳代后獲得大量具有穩(wěn)定感染性的重組腺病毒Ad-adipsin，傳至第7代后病毒滴度達(dá)到106CCID 50/mL，已達(dá)到實驗需求。通過Western blotting證明，重組腺病毒Ad-adipsin在HEK293細(xì)胞中表達(dá)了ADIPSIN蛋白。

本研究中選用的ZDF大鼠作為2型糖尿病治療模型，它是一種自發(fā)性糖尿病模型，該大鼠經(jīng)過高脂高糖飼料喂養(yǎng)2周后就會出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖等符合人2型糖尿病的癥狀，并且有著癥狀持續(xù)時間長、造模過程時間短等優(yōu)勢[14-15]。

研究結(jié)果表明與ZL對照組相比，ZDF模型組大鼠的血清中FBG、FINS、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平明顯升高，而adipsin含量降低、胰島素抵抗指數(shù)升高，符合2型糖尿病癥狀。經(jīng)過Ad-adipsin治療后，治療組大鼠血清adipsin水平有明顯的回升，而FBG、TC、TG等顯著降低改善，并且胰島素抵抗指數(shù)的降低，說明重組腺病毒Ad-adipsin可以改善實驗性2型糖尿病大鼠糖代謝和脂質(zhì)代謝的紊亂。

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Construction of adenovirus vector containing adipsin and its therapy on 2 type diabetes rat model

ZHANG Lei, ZHOU Yan, YAN Shan-shan, XIE Yu-ping,GENG Pan-pan， SUN Mao-sheng, LI Hong-jun

(Yunnan Key Laboratory for Infectious Disease Major Vaccine Development, Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China)

s Adipsin is one of the most abundant and specifically expressed adipose proteins and plays pivotal roles in energy homeostasis and systemic metabolism as a circulating factor linking fat cells and obesity to β cell function. To evaluate whether treatment withadipsincould prevent the metabolic abnormalities associated with diabetes and obesity, we examined the effects of overexpression of adenoviral-mediated adipsin (Ad-adipsin) in hyperlipidemic type 2 diabetic rats. Type 2 diabetic rats (n=5) were administered intravenously with Ad-adipsin. Overexpression of adipsin significantly reduced serum resistin, fasting blood glucose (FPG) levels, fasting insulin value(FINS), total serum cholest(TC), triglyceride(TG), and low density lipoprotein(LDL) on the 7th day after treatment (P<0.05). In addition, glucose tolerance and insulin sensitivity were markedly increased (P<0.05). These results indicated that the treatment with Ad-adipsin improves glucose and fat metabolism in type 2 diabetic rats.

adipsin; ZDF rat; type 2 diabetes

2015-12-03；

2015-12-29

云南省科技計劃項目(2014BC008)；協(xié)和青年基金資助和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助(33320140082)

張磊，碩士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：635565654@qq.com

李鴻鈞，研究員，長期從事干細(xì)胞及分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail：lihj6912@hotmail.com

Q785

A

2095-1736(2016)05-0058-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.058