葛嫣然，邵宏超，王福海

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2河北青縣人民醫(yī)院)

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雌激素皮下注射對兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的預(yù)防作用

葛嫣然1，邵宏超1，王福海2

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2河北青縣人民醫(yī)院)

目的觀察雌激素對兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的預(yù)防作用。方法55只雄性健康純種大耳白兔，將其隨機(jī)分為正常假手術(shù)組(5只)、缺血組(25只)、治療組(25只)。治療組皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d；缺血組給予等量生理鹽水皮下注射7 d。缺血組與治療組制備視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，正常假手術(shù)組僅進(jìn)行前房穿刺。觀察缺血組與治療組再灌注后3、6、12、24、72 h及正常假手術(shù)組視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)SABC法測算其視網(wǎng)膜組織中bax的陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果治療組再灌注后3、6、12、24、72 h視網(wǎng)膜水腫、細(xì)胞空泡變性等改變均較缺血組輕，視網(wǎng)膜bax陽性細(xì)胞數(shù)均較缺血組少(P均<0.05)。結(jié)論雌激素對兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有預(yù)防作用，其機(jī)制可能為下調(diào)bax表達(dá)。

視網(wǎng)膜；缺血再灌注損傷；苯甲酸雌二醇；bax蛋白；細(xì)胞凋亡

在臨床上，視網(wǎng)膜缺血損傷超過90 min，視網(wǎng)膜功能將永久受損。研究[1]發(fā)現(xiàn)，5～10 min的缺血后再灌注已可造成視網(wǎng)膜細(xì)胞的明顯凋亡。研究證明，凋亡是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式，而bax為重要的凋亡調(diào)控基因。雌激素可通過清除自由基、抗氧化、抗神經(jīng)凋亡減少缺血再灌注損傷，減少缺血性心腦血管病和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞的發(fā)生[2～4]。本實(shí)驗(yàn)通過建立兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，觀察了雌激素對兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的預(yù)防作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑55只健康純種大耳白兔，體質(zhì)量(3.0±0.2)kg，雄性，外眼及眼底檢查均正常，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)，bax抗體(武漢博士德生物工程公司)，SABC試劑盒(即用型)購自武漢博士德生物工程公司，HE染色試劑由本院病理教研室提供。

1.2兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型制備及雌激素用法實(shí)驗(yàn)分為正常假手術(shù)組(5只)、缺血組(25只)、治療組(25只)。治療組皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d。缺血組給予等量生理鹽水皮下注射7 d。缺血組與治療組采用升高眼內(nèi)壓方法制備視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，正常假手術(shù)組僅進(jìn)行前房穿刺。正常假手術(shù)組前房穿刺后即處死，缺血組與治療組在再灌注后3、6、12、24、72 h各處死5只兔，用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.3視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)觀察方法摘除兔眼球,置于4%多聚甲醛固定24 h,去除眼前節(jié)組織,后段眼環(huán)再固定4 h，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。切片HE染色，光鏡顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4視網(wǎng)膜bax蛋白檢測采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測兔視網(wǎng)膜bax蛋白，將切片常規(guī)脫蠟后熱修復(fù)抗原，滴加H2O2滅活內(nèi)源性酶,滴加山羊血清封閉液封閉。依次加入抗bax抗體(鼠抗兔IgG)、生物素化山羊抗鼠IgG、SABC、DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為蛋白陽性表達(dá)。在視網(wǎng)膜切片中央部位向兩側(cè)各取兩個(gè)連續(xù)不重疊的高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)，以平均數(shù)作為每張切片陽性細(xì)胞數(shù)。

2　結(jié)果

正常假手術(shù)組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜平滑完整，三層細(xì)胞分界清楚，節(jié)細(xì)胞呈單層排列，按細(xì)胞核大小分為兩類：一類大核淺染；另一類小核深染，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。內(nèi)、外核層細(xì)胞均呈多層排列，其厚度、染色均勻，細(xì)胞排列整齊緊密。缺血組缺血再灌注損傷后24 h可見各層細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙增大，神經(jīng)纖維層輕度腫脹；傷后24～72 h，視網(wǎng)膜水腫，部分細(xì)胞空泡樣變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少。治療組傷后24 h，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列稍顯疏松，細(xì)胞間隙略增大，傷后24～72 h，視網(wǎng)膜水腫相對較輕，少量細(xì)胞空泡變性等改變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量輕度減少。治療組視網(wǎng)膜在再灌注后3、6、12、24、72 h的病理改變均較缺血組明顯減輕。缺血組、治療組視網(wǎng)膜bax陽性細(xì)胞數(shù)比較結(jié)果見表1。

表1　缺血組、治療組視網(wǎng)膜bax陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)

注：與缺血組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05。

3　討論

雌激素是一類重要的類固醇激素，可促進(jìn)女性生殖器官成熟，維持女性特征和生殖系統(tǒng)活動(dòng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及骨組織中也發(fā)揮著重要作用，與視網(wǎng)膜血管生成調(diào)控、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷、眼底惡性腫瘤及老年性黃斑變性等眼部生理及病理過程有密切關(guān)聯(lián)[5]。Nonaka等[6]在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌激素可以減少白細(xì)胞在缺血視網(wǎng)膜內(nèi)聚集，從而減輕再灌注時(shí)神經(jīng)組織損傷。Zhou等[7]在繼發(fā)性青光眼的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過抑制細(xì)胞凋亡減少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維丟失。代艷等[8]發(fā)現(xiàn)雌激素可以減輕治療組視網(wǎng)膜內(nèi)層萎縮變性程度，使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。Russo等[9]在大鼠急性眼壓升高模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌激素可減少由高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。王建平等[10]在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇可以通過升高凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)，減少腦缺血再灌注損傷細(xì)胞的凋亡。

本研究采用HE染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)治療組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜病理改變均較缺血組明顯減輕，提示雌激素能夠減輕視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，對維持視網(wǎng)膜功能、保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞有重要的治療作用。bax是神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡的重要調(diào)節(jié)因子，基因位于染色體19q13.3-19q13.4，含有6個(gè)外顯子。研究表明，bax在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后表達(dá)增強(qiáng)，說明bax在神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)的繼發(fā)性死亡中起重要作用。通過對凋亡相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，bax、bcl-2、bcl-xs、bad、bag-1具有同源性，bax和bcl-2可以分別以同源二聚體存在，也可以形成異源二聚合體。bcl-2是一種抗氧化劑，它不能改變內(nèi)源性過氧化物產(chǎn)生的速度，但能完全阻止脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞免受H2O2等誘導(dǎo)的凋亡。本實(shí)驗(yàn)中缺血組及治療組視網(wǎng)膜中可見bax陽性細(xì)胞表達(dá)，缺血組bax陽性細(xì)胞在再灌注3 h即有表達(dá)，6 h已較顯著，24 h達(dá)到高峰，72 h仍有所表達(dá)；雌激素治療組陽性細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間較缺血組晚，且表達(dá)明顯低于缺血組。此研究結(jié)果表明，雌激素能抑制bax基因的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上可見，雌激素對兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有預(yù)防作用，其機(jī)制可能為下調(diào)bax表達(dá)。

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唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12140209A-47)。

邵宏超(E-mail: shaohongchao@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.016

R774.1

A

1002-266X(2016)23-0050-02

2015-10-29)