岳龍，賀濤，張玲,韓樹峰

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)

?

三氧化二砷對人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63遷移、黏附能力的影響

岳龍1，賀濤2，張玲2,韓樹峰1

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)

目的觀察三氧化二砷對人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63遷移、黏附能力的影響。方法 常規(guī)培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，將其分為實(shí)驗(yàn)組(加入濃度為1.0 μmol/L的三氧化二砷)、陽性對照組(加入15 mg/L的5-FU)、陰性對照組(加入同體積的的培養(yǎng)液)。細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞同質(zhì)黏附能力,用層黏蛋白實(shí)驗(yàn)來觀察細(xì)胞的異質(zhì)黏附能力，用劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室法檢測細(xì)胞趨化遷移能力。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組在振搖時間20、40、60 min時的細(xì)胞聚集指數(shù)分別為0.24±0.030、0.46±0.060、0.59±0.070，陽性對照組分別為0.16±0.012、0.20±0.024、0.33±0.022，陰性對照組分別為0.14±0.011、0.18±0.015、0.22±0.023，實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組、陰性對照組相比，P均<0.05。實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)60、90 min時的OD值分別為0.144±0.007、0.141±0.013，陽性對照組分別為0.363±0.035、0.513±0.034，陰性對照組分別為0.387±0.026、0.461±0.024，實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組、陰性對照組相比，P均<0.05。實(shí)驗(yàn)組遷移距離、遷移面積及遷移速率分別為(192.3±16.7)μm、(91.9±9.1)×103μm2、(4.00±0.35)μm/h，陽性對照組分別為(301.6±23.8)μm、(161.9±12.9)×103μm2、(6.9±0.9)μm/h，陰性對照組分別為(362.0±27.8)μm、(242.5±21.2)×103μm2、(8.2±1.1)μm/h，實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組、陰性對照組相比，P均<0.05。實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組、陰性對照組遷移跨膜細(xì)胞數(shù)分別為(112±11)、(172±15)、(276±37)個，兩兩組間比較，P均<0.05。結(jié)論三氧化二砷在體外能顯著增加人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63同質(zhì)之間的黏附能力而抑制骨肉瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附能力，并且抑制骨肉瘤細(xì)胞的趨化遷移。

三氧化二砷；骨肉瘤；細(xì)胞遷移；細(xì)胞黏附

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，又稱成骨肉瘤，其以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征，占原發(fā)惡性骨腫瘤的20%，是骨骼系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，70%～80%的患者發(fā)病于青少年，年發(fā)病率為(1～3)/100萬。骨肉瘤常無典型臨床癥狀，容易與外傷或生長痛混淆，惡性程度高，早期極有可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。目前常采用綜合治療的方式，外科手術(shù)治療輔以術(shù)前后化療，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，而化療總體有效率僅為60%左右。因此，改善預(yù)后的關(guān)鍵除要早期診斷早期治療外，更重要的是尋找有效的治療措施。三氧化二砷已被研究證實(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡及細(xì)胞毒作用，最早運(yùn)用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病。近來許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究也證實(shí)，三氧化二砷對抑制骨肉瘤增殖及促進(jìn)骨肉瘤凋亡有一定的抑制作用。本研究觀察了三氧化二砷對人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63遷移、黏附的影響。

1　材料與方法

1.1材料人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購自上海中科院細(xì)胞庫；RPIM1640培養(yǎng)液干粉及小牛血清由河南省腫瘤醫(yī)院張玲教授饋贈(購自美國英駿生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室購自corning公司(美國)；三氧化二砷購自鄭州安賽生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，用含10%的小牛血清RPIM1640培養(yǎng)基(含100 mg/L青霉素及鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

1.3三氧化二砷對人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63黏附的影響觀察①細(xì)胞同質(zhì)黏附能力檢測：采用細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)。將24孔板用1%BSA 4 ℃包被過夜。取對數(shù)期生長的人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，用HCMF(10 mmol/L HEPES、0.137 mol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、0.34 mmol/L Na2HPO4·12H2O、0.1% glucose)洗滌細(xì)胞兩次，0.05%胰蛋白酶消化。HCMF再次洗滌一次，使細(xì)胞懸浮在HCMF溶液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×105。按500 μL細(xì)胞懸液/孔加入到1% BSA包被好的24孔培養(yǎng)板，加入Ca2+使之終濃度為1 mmol/L，實(shí)驗(yàn)組加入1 mL濃度為1.0 μmol/L的三氧化二砷，陽性對照組加入1 mL濃度為15 mg/L的5-FU，陰性對照組加入1 mL的培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板放置在空氣振蕩器上，80 r/min分別振搖20、40、60 min后顯微鏡下統(tǒng)計(jì)聚集細(xì)胞數(shù)及單個細(xì)胞數(shù)。通過計(jì)算細(xì)胞聚集指數(shù)(AI)來衡量細(xì)胞黏附能力，AI=(N0-Nt)/N0，其中N0為聚集實(shí)驗(yàn)開始前統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)(包括單個細(xì)胞與聚集細(xì)胞)，Nt為特定時間后總細(xì)胞數(shù)(包括單個細(xì)胞與聚集細(xì)胞)，三組均獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。②細(xì)胞異質(zhì)黏附能力檢測：采用層黏蛋白實(shí)驗(yàn)。選用96孔培養(yǎng)板，三組細(xì)胞分別選用5個復(fù)孔，均用層黏連蛋白Ln進(jìn)行包被，胰酶消化骨肉瘤細(xì)胞，然后將骨肉瘤細(xì)胞等量加入每個孔，每個孔的細(xì)胞數(shù)為1×106個。在室溫、5%CO2條件下，實(shí)驗(yàn)組加入1 mL濃度為1.0 μmol/L的三氧化二砷，陽性對照組加入1 mL濃度為15 mg/L的5-FU，陰性對照組不做處理。靜置培養(yǎng)，30 min后各取出一孔，將未黏附的骨肉瘤細(xì)胞快速去除，用Cell Counting Kit-8試劑盒避光染色三組細(xì)胞，2 h后，分別計(jì)算在490 nm處三組各孔骨肉瘤細(xì)胞的OD值,然后在培養(yǎng)60 min和培養(yǎng)90 min時重復(fù)上述步驟。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.4三氧化二砷對人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63遷移的影響觀察 ①劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：取對數(shù)生長期的骨肉瘤細(xì)胞，胰酶消化，以細(xì)胞1×106每孔接種6孔板。在不含血清的DMEM中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入1 mL濃度為1.0 μmol/L的三氧化二砷，陽性對照組加入1 mL濃度為15 mg/L的5-FU，陰性對照組加入1 mL的培養(yǎng)液。用細(xì)胞刮刀于培養(yǎng)板底部劃出4條長500 μm、寬650 μm平行垂直的劃痕，48 h后拍照，Adobe Photoshop CS3分析其遷移距離、遷移面積及遷移速率。②Transwell小室檢測細(xì)胞趨化遷移：Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板，形成上下兩個小室。胰酶消化細(xì)胞，重懸于無血清0.5% BSA-DMEM培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)細(xì)胞為1×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上層小室，下層小室加胎牛血清培基作趨化因子。實(shí)驗(yàn)組在上層小室內(nèi)加入1 mL濃度為1.0 μmol/L的三氧化二砷，陽性對照組在上層小室內(nèi)加入1 mL濃度為15 mg/L的5-FU，陰性對照組不做處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將各組Transwell膜以甲醇固定，結(jié)晶紫染色。洗脫膜表面的細(xì)胞并用中性樹膠封閉于玻片中。鏡下觀察穿膜細(xì)胞并拍照，隨機(jī)選取5～8個視野計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果

三組細(xì)胞振蕩不同時間后AI比較見表1。三組細(xì)胞孵育不同時間后OD值比較見表2。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于鏡下可見大量的細(xì)胞團(tuán)塊狀組織，陽性對照組可見少量的細(xì)胞團(tuán)塊組織，而陰性對照組可見大量散在的細(xì)胞及極少的小細(xì)胞團(tuán)塊。三組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移面積、遷移距離、遷移速率比較見表3。實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組、陰性對照組遷移跨膜細(xì)胞數(shù)分別為(112±11)、(172±15)、(276±37)個，兩兩組間比較，P均<0.05。

表1　振蕩不同時間后三組細(xì)胞AI比較( ±s)

注：與陽性對照組、陰性對照組相比，*P<0.05。

表2　孵育不同時間后三組細(xì)胞OD值比較±s)

注：與陽性對照組、陰性對照組相比，*P<0.05。

表3　　　　三組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移面積、遷移距離、遷移速率比較

注：與陽性對照組、陰性對照組相比，*P<0.05。

3　討論

骨肉瘤是兒童及青少年常發(fā)的惡性腫瘤，臨床常用抗癌藥物有阿霉素、順鉑和環(huán)磷酰胺等，常單用或合用。近年來新輔助化療的出現(xiàn)顯著提高了患者的生存率，但腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率仍較高，并很容易形成耐藥。因此，需要尋求新的單純應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用的化療藥物。三氧化二砷是無機(jī)劇毒品，既往研究[1]發(fā)現(xiàn)其治療急性早幼粒細(xì)胞白血病臨床效果顯著。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對惡性淋巴瘤、胃癌[2]、肝癌[3]、膽囊癌、肺癌[4]、宮頸癌[5]等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用。對尤文肉瘤[6]及轉(zhuǎn)移性骨腫瘤[7]也有明顯抑制作用。三氧化二砷抗腫瘤作用的機(jī)制可能主要有：①可能存在誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用[8]。三氧化二砷可能因自身的毒性作用作用于癌細(xì)胞自身的凋亡基因干擾或阻止了癌細(xì)胞的無限增殖途徑。目前研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制強(qiáng)度主要可能和其濃度有關(guān)。②抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性[9]。三氧化二砷作用于裸鼠移植性肝癌以及急性早幼粒細(xì)胞株后，腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性有不同程度的下降，且下降的程度和三氧化二砷的作用時間和濃度呈正相關(guān)。③抑制腫瘤血管生成[10]。④阻滯細(xì)胞周期[11]。三氧化二砷能將多種腫瘤細(xì)胞株阻滯在G1/S和G2/M期。⑤細(xì)胞毒作用[12]。三價(jià)砷具有很強(qiáng)的毒性，三價(jià)砷可能與細(xì)胞的某些抗氧化酶結(jié)合使其失去活性，影響細(xì)胞的DNA合成和修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。骨肉瘤早期極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移途徑主要有以下幾個步驟：①骨肉瘤細(xì)胞間黏附能力降低而骨肉瘤細(xì)胞與異質(zhì)間的黏附能力增強(qiáng)，瘤細(xì)胞與細(xì)胞外的某些基質(zhì)結(jié)合脫離原發(fā)部位。②脫離原發(fā)部位后，癌細(xì)胞分泌水解酶水解細(xì)胞外基質(zhì)，形成游離狀態(tài)。③游離的癌細(xì)胞黏附于組織細(xì)胞、淋巴液、血液進(jìn)入血管或淋巴管，進(jìn)而向全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究采用細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)及Ln黏附實(shí)驗(yàn)分別檢測了經(jīng)三氧化二砷作用后骨肉瘤同質(zhì)及異質(zhì)黏附能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)三氧化二砷作用后細(xì)胞同質(zhì)黏附能力顯著增加，而同Ln的黏附顯著降低，這說明了三氧化二砷抑制骨肉瘤侵襲的機(jī)制可能包括增加細(xì)胞同質(zhì)黏附而抑制其異質(zhì)黏附。細(xì)胞遷移能力與癌細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān)。本研究采用細(xì)胞劃痕法證明，細(xì)胞經(jīng)三氧化二砷作用后骨肉瘤細(xì)胞的遷移面積、遷移距離、遷移速率低于對照組。Transwell小室結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)三氧化二砷作用后骨肉瘤穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組。這說明三氧化二砷抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲的機(jī)制還可能包括抑制細(xì)胞的趨化遷移。

可見，三氧化二砷在體外能顯著增加人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63同質(zhì)之間的黏附能力而抑制骨肉瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附能力，并且抑制骨肉瘤細(xì)胞的趨化遷移。三氧化二砷在骨腫瘤的應(yīng)用越來越多，目前對四肢骨骼惡性腫瘤的治療方法主要是以新輔助化療為基礎(chǔ)的保肢手術(shù)，三氧化二砷應(yīng)用的各種劑型不斷涌現(xiàn)，作為一種化療藥的同時又是化療增敏劑，局部應(yīng)用于病灶清除后，配合全身化療，不僅能提高局部有效藥物濃度，還能減少化療藥物總劑量，降低毒副作用。

[1] Emi N. Arsenic trioxide as a therapeutic agent in APL[J]. Nihon Rinsho, 2007,65 Suppl 1:724-728.

[2] Liang XQ, Cao EH, Zhang Y, et al. P53-induced gene 11 (PIG11) involved in arsenic trioxide-induced apoptosis in human gastric cancer MGC-803 cells[J]. Oncol Rep, 2003,10(5):1265-1269.

[3] Lin CC, Hsu C, Hsu CH, et al. Arsenic trioxide in patients with hepatocellular carcinoma: a phase Ⅱ trial[J]. Invest New Drugs, 2007,25(1):77-84.

[4] Park JH, Kim EJ, Jang HY, et al. Combination treatment with arsenic trioxide and sulindac enhances apoptotic cell death in lung cancer cells via activation of oxidative stress and mitogen-activated protein kinases[J]. Oncol Rep, 2008,20(2):379-384.

[5] Kang YH, Lee SJ. Role of p38 MAPK and JNK in enhanced cervical cancer cell killing by the combination of arsenic trioxide and ionizing radiation[J]. Oncol Rep, 2008,20(3):637-643.

[6] Wang X, Wang G, Dong D, et al. Inhibition on LS-174T cell growth and activity of telomerase in vitro and in vivo by arsenic trioxide[J]. Exp Toxicol Pathol, 2008,60(6):481-488.

[7] Scholz C, Richter A, Lehmann M, et al. Arsenic trioxide induces regulated, death receptor-independent cell death through a Bcl-2-controlled pathway[J]. Oncogene, 2005,24(47):7031-7042.

[8] 杜彩文,林英城.三氧化二砷誘導(dǎo)人鼻咽低分化鱗癌裸鼠移植瘤細(xì)胞分化的研究[J].癌癥,2003,22(1):21-25.

[9] 袁坦,姜國忠,李宏云.三氧化二砷對肺癌細(xì)胞NCI-H520的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2014,31(6):1292-1293.

[10] 華海清,秦叔逵,王錦鴻,等.三氧化二砷抗腫瘤血管形成研究[J].世界華人消化雜志,2004,12(1):27-31.

[11] Kim JH, Kim JH, Yu YS, et al. Antitumor activity of arsenic trioxide on retinoblastoma: cell differentiation and apoptosis depending on arsenic trioxide concentration[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009,50(4):1819-1823.

[12] Pettersson HM, Pietras A, Munksgaard PM, et al. Arsenic trioxide is highly cytotoxic to small cell lung carcinoma cells[J]. Mol Cancer Ther, 2009,8(1):160-170.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.015

R738.0

A

1002-266X(2016)23-0047-03

2015-12-25)