劉輝，劉宇飛，李向東，楊初蔚

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧大連 116023)

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Toll樣受體4抑制劑C34灌服對大鼠膿毒癥急性肺損傷的治療作用及其機(jī)制探討

劉輝，劉宇飛，李向東，楊初蔚

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧大連 116023)

目的觀察Toll樣受體4抑制劑C34對大鼠膿毒癥急性肺損傷的治療作用，并探討其可能機(jī)制。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組1、模型組1、C34治療組1和C34治療組2，每組10只。模型組1、C34治療組1、C34治療組2制備膿毒癥急性肺損傷模型，C34治療組1和C34治療組2于造模成功后1、8 h，分別予灌服1 mg/kg和2 mg/kg的C34治療。比較各組肺組織濕/干重，肺損傷病理評分，肺組織IκBα、p65、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)量，肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)量。結(jié)果與假手術(shù)組1相比，模型組1肺濕/干重、病理評分、p65蛋白、cleaved-caspase 3蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)高，IκBα蛋白表達(dá)低(P均<0.05)。與模型組1相比，C34治療組1、C34治療組2肺濕干重比、病理評分、p65蛋白、cleaved-caspase 3蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)低，IκBα蛋白表達(dá)高，且C34治療組2較C34治療組1變化明顯(P均<0.05)。結(jié)論C34灌服對大鼠膿毒癥急性肺損傷有治療作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Toll樣受體4抑制劑；C34;膿毒癥；肺損傷

膿毒癥肺損傷是導(dǎo)致危重膿毒癥患者死亡的重要原因[1,2]，但臨床尚缺乏特異性治療藥物。以往研究[3]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(TLR)4在膿毒癥所致肺損傷的病情發(fā)展中發(fā)揮重要作用，敲除TLR4基因或者靶向抑制TLR4的表達(dá)可以顯著減輕急性肺損傷的程度[4,5]。C34是TLR4的新型抑制劑[6]，本研究觀察了C34灌服對大鼠膿毒癥急性肺損傷的治療作用，并探討其可能機(jī)制，以期為臨床膿毒癥患者的治療提供新的思路和方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量220～240 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。cleaved-caspase 3、IκBα和β-actin的抗體購自美國cell signaling公司，p65和組蛋白3(H3)抗體購自美國Abcom公司，IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司，C34購自美國Tocris公司，核蛋白和總蛋白的提取試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)公司。

1.2膿毒癥急性肺損傷模型制備和C34用法膿毒癥急性肺損傷模型的建立采用大鼠盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)法。使用水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)將大鼠麻醉后，剔除腹部毛發(fā)，碘伏和乙醇消毒，沿前腹正中線作一長3 cm的切口，從腹腔中將盲腸取出，四號線于盲腸距離盲端1.5 cm處進(jìn)行結(jié)扎，然后采用18號針頭在盲腸結(jié)扎處遠(yuǎn)端穿刺兩次，擠出少許腸內(nèi)糞便后，回納盲腸入腹腔，逐層縫合關(guān)腹。手術(shù)完成后，腹腔注射生理鹽水以補充術(shù)中體液丟失，補充劑量為24 mL/kg。將大鼠放置在保溫毯上保溫至蘇醒，待其蘇醒后放于鼠籠中，自由進(jìn)食飲水。本研究分兩部分，在實驗一中，將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為假手術(shù)組1、模型組1、C34治療組1和C34治療組2，每組10只；在實驗二中，將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組2、模型組2、C34治療組3、C34治療組4，每組20只，所有大鼠術(shù)前禁食12 h。假手術(shù)組1、假手術(shù)組2僅作盲腸探查術(shù)處理，模型組1、模型組2、C34治療組1、C34治療組2、C34治療組3、C34治療組4制備膿毒癥急性肺損傷模型。C34治療組1和C34治療組2于造模成功后1、8 h，分別予灌服1 mg/kg和2 mg/kg的C34治療。實驗一于模型制備后24 h處死大鼠，取出肺組織,待測。C34治療組3、C34治療組4造模成功后1、24、48、72、96 h分別給予灌服1 mg/kg和2 mg/kg的C34治療，觀察各組大鼠5 d病死率。

1.3肺組織濕/干重計算將大鼠左肺兩葉取出后，迅速用吸水紙吸干肺表面水分和血液，電子天平稱濕重，置入80 ℃烘箱內(nèi)烘24 h后，再稱重獲得干重，用計算所得肺組織濕/干重來評價肺組織的水腫程度。

1.4肺組織病理學(xué)檢查取右肺下葉置于組織專用包埋盒后立即置入4%多聚甲醛溶液中固定，用作病理HE染色。肺組織的病理損傷程度由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評估，對每張切片隨機(jī)選擇8個高倍視野(×400)進(jìn)行觀察，顯微鏡下急性肺損傷判定標(biāo)準(zhǔn)為中性粒細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫、出血、透明膜形成、壞死和充血。肺損傷嚴(yán)重度評分標(biāo)準(zhǔn)[7]：正常為0分；極輕度(<25%)為1分；輕度(25%～50%)為2分；中度(50%～75%)為3分；重度(>75%)為4分。將兩位病理科醫(yī)生統(tǒng)計后的平均分后作為大鼠肺損傷的最終病理評分。

1.5肺組織IκBα、p65和cleaved-caspase 3蛋白檢測采用免疫印跡法。右肺中葉核蛋白和總蛋白的提取分別采用核蛋白提取試劑盒和總蛋白提取試劑盒，提取的核蛋白用于p65和H3的檢測，提取的總蛋白用于cleaved-caspase 3、IκBα和β-actin的檢測，將提取的蛋白上清液按4∶1比例加入5×loading buffer沸水中煮10 min。每孔加入35 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%牛奶封閉室溫下1 h，一抗稀釋液(均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，二抗稀釋液室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加顯影液，顯影并使用膠片曝光，Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.6肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測肺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2　結(jié)果

假手術(shù)組1、模型組1、C34治療組1和C34治療組2肺濕/干重分別為4.5±1.1、8.3±3.1、7.1±2.8、5.2±2.1，病理評分分別為(0.10±0.01)、(3.90±0.20)、(2.70±0.11)、(1.20±0.09)分，假手術(shù)組1、C34治療組1、C34治療組2與模型組1相比，C34治療組1與C34治療組2相比，P均<0.05。各組肺組織IκBα、P65、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)比較見表1。各組肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較見表2。假手術(shù)組2、模型組2、C34治療組3、C34治療組4大鼠5 d病死率分別為5%、65%、50%、30%，假手術(shù)組2、C34治療組3、C34治療組4與模型組2相比，C34治療組3與C34治療組4相比，P均<0.05。

表1　　　　各組肺組織IκBα、p65、Cleaved-caspase 3

注：與模型組1相比，#P<0.05；與C34治療組1相比，&P<0.05。

3　討論

TLR4是一種跨膜蛋白，在結(jié)構(gòu)上由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成，TLR4信號通路向下游傳導(dǎo)主要包括MyD88非依賴性和MyD88依賴性兩條信號通路，前者不依賴于MyD88蛋白的激活作用，主要通過IRF-3和延遲的NF-κB反應(yīng)；后者主要通過MyD88的激活，NF-κB從而快速反應(yīng)，NF-κB激活后可以調(diào)控下游促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6等的表達(dá)[8]。以往大量研究[9～11]表明，TLR4在膿毒癥肺損傷的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，TLR4可以成為膿毒癥治療的藥物作用靶點。然而，盡管一些TLR4的靶向抑制劑如瑞沙拖維已經(jīng)進(jìn)入到膿毒癥的臨床三期實驗，但最終結(jié)果仍以失敗告終[12]。因此本研究探討了TLR4的新型抑制劑C34灌服在膿毒癥肺損傷大鼠模型中的治療作用及可能機(jī)制，以期為其進(jìn)入臨床試驗打下堅實的理論基礎(chǔ)。

表2　各組肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較

注：與模型組相比，#P<0.05；與C34治療組1相比，&P<0.05。

最新研究[6,13]發(fā)現(xiàn)，C34在小鼠體內(nèi)有顯著的抗炎作用，但其在膿毒癥大鼠肺組織損傷中的作用目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/kg C34可以顯著改善肺組織的病理損害程度，且2 mg/kg C34可以更進(jìn)一步改善肺組織的病理損害程度，表明C34對肺組織的保護(hù)作用呈劑量依賴性。TLR4激活后通過胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)控NF-κB的活性。NF-κB是機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在靜息狀態(tài)下，NF-κB p65主要與抑制性亞單位IκBα結(jié)合存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，IκBα發(fā)生泛素化降解，喪失對p65的束縛能力，脫離IκBα束縛的p65由胞質(zhì)轉(zhuǎn)到胞核，并與特定的靶基因序列結(jié)合，調(diào)節(jié)大量炎癥因子的產(chǎn)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，C34可以有效增加IκBα的表達(dá)量，顯著減少膿毒癥大鼠肺組織核內(nèi)NF-κB p65蛋白和凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白cleaved-caspase 3蛋白的表達(dá)，這可能是C34有效減少肺組織損傷的機(jī)制之一。此外，在證實C34可以抑制p65的核內(nèi)轉(zhuǎn)位后，本研究進(jìn)一步探討了C34對受NF-κB調(diào)控的炎癥因子IL-6、IL-β和TNF-α表達(dá)的影響，結(jié)果表明C34可以顯著抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。炎癥因子是引起肺泡上皮和毛細(xì)血管屏障損傷進(jìn)而導(dǎo)致肺水腫及透明膜形成的主導(dǎo)機(jī)制，本研究進(jìn)一步探討了C34對肺水腫的改善作用，發(fā)現(xiàn)C34可以顯著減輕肺組織的水腫程度，且呈劑量依賴性。綜合以上研究，我們推測C34可能通過抑制NF-κB信號通路，從而進(jìn)一步下調(diào)下游相關(guān)炎癥因子的表達(dá)來發(fā)揮肺組織的保護(hù)作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)C34治療大鼠的生存率較模型組顯著升高，且2 mg/kg的C34治療高于1 mg/kg的C34治療，提示C34可能具有良好的臨床應(yīng)用價值，未來需要在臨床一期實驗中進(jìn)一步去驗證。

綜上所述，C34灌服對大鼠膿毒癥急性肺損傷有治療作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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Effects of Toll-like receptor 4 inhibitor C34 on sepsis-induced lung injury of rats

LIUHui,LIUYufei,LIXiangdong,YANGChuwei

(TheSecondHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116023,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Toll-like receptor 4 inhibitor C34 on sepsis-induced acute lung injury (ALI) in rats, and to explore its possible mechanisms. MethodsMale SD rats were randomly divided into four groups, 10 in each group: the sham group 1, model group 1, C34 treatment groups 1 and 2. The sepsis-induced acute lung injury models were established in the model group 1, C34 treatment groups 1 and 2. Rats in the C34 treatment groups 1 and 2 were respectively treated with 1 mg/kg C34 and 2 mg/kg C34 at 1 h and 8 h after successful modeling. The lung wet/dry weight (W/D) ratio and pathologic scores were compared as well as the protein expression of IκBα, p65 and cleaved-caspase 3 and the expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Results Compared with the sham group 1, the lung W/D ratio, the pathological scores, the protein expression of p65, cleaved-caspase 3, TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased, and the protein expression of IκBα was decreased in the model group 1 (allP<0.05). Compared with the model group 1, the lung W/D ratio, the pathological scores, the protein expression of p65, Cleaved-caspase 3, TNF-α, IL-1β and IL-6 were decreased, and the protein expression of IκBα was increased in the C34 treatment group 1 and C34 treatment group 2, meanwhile, the changes in the C34 treatment group 2 were more significant as compared with those of the C34 treatment group 1 (allP<0.05).ConclusionC34 has therapeutic effect on sepsis-induced ALI rats, and this effect can be attributed to C34 ability of inhibiting NF-κB-mediated inflammatory response.

sepsis; lung injury； Toll-like receptor

遼寧省優(yōu)秀人才培育項目(2014023018)。

楊初蔚(E-mail： esquire@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.014

R563

A

1002-266X(2016)23-0000-00

2015-12-09)