汪華兵，史春桃，于民，韓瑋，曹方，丁厚中

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 ，江蘇昆山215300)

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小腦鋅指結(jié)構(gòu)1基因轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響

汪華兵，史春桃，于民，韓瑋，曹方，丁厚中

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 ，江蘇昆山215300)

目的觀察小腦鋅指結(jié)構(gòu)1(ZIC1)基因轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。方法用攜帶ZIC1基因的慢病毒顆粒感染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，用空載慢病毒顆粒感染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞作為對(duì)照組。采用real-time PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞中的ZIC1 mRNA及蛋白，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。結(jié)果與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力減弱，G1期細(xì)胞阻滯，細(xì)胞凋亡率增加(P均<0.01)。結(jié)論轉(zhuǎn)染ZIC1基因可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

小腦鋅指結(jié)構(gòu)1基因；乳腺癌；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

乳腺癌的形成是多基因、多因素共同作用的結(jié)果。小腦鋅指結(jié)構(gòu)1(ZIC1)基因是一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[1]。目前，國內(nèi)外對(duì)ZIC1基因在乳腺癌形成中的作用鮮見報(bào)道。本課題組前期發(fā)現(xiàn)ZIC1基因表達(dá)與乳腺癌的惡性生物學(xué)行為呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)其可能參與了許多細(xì)胞內(nèi)事件，對(duì)抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[2]。為進(jìn)一步探討ZIC1基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究擬通過構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的ZIC1表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，觀察轉(zhuǎn)染ZIC1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM高糖、胎牛血清購自Gibco公司，ZIC1慢病毒質(zhì)粒由武漢巴菲爾公司構(gòu)建包裝，TRIzol購自Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker、Ex TaqTM購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)購自Fermentas公司，羊抗人ZIC1多克隆抗體購自Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，BCA蛋白測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液(中)購自碧云天生物技術(shù)研究所，ZIC1引物和GAPDH內(nèi)參引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2慢病毒載體pLV-ZIC1-PGK-Puro的構(gòu)建根據(jù)NCBI中ZIC1的基因序列(基因ID:7545)，合成含有ZIC1的質(zhì)粒，利用PCR法釣取ZIC1基因并進(jìn)行擴(kuò)增(1 344 bp)，在引物中引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，將載體質(zhì)粒pLVX-AcGFP1-N1和目的基因的EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，分別回收載體pLVX-AcGFP1-N1酶切大片段和目的基因酶切產(chǎn)物；將質(zhì)粒pLVX-AcGFP1-N1 EcoRⅠ+NotⅠ回收大片段與目的基因連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取若干菌落，進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)，PCR鑒定；對(duì)PCR鑒定陽性的菌落測(cè)序，得到構(gòu)建成功ZIC1重組質(zhì)粒。對(duì)其進(jìn)行病毒包裝，檢測(cè)滴度。

1.3慢病毒載體pLV-Zic1-PGK-Puro轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，按3×103個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞密度為50%時(shí)，用凝聚胺(polybrene，10 μg/mL)介導(dǎo)ZIC1慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，按試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染率達(dá)90%。傳代后，換用含有嘌呤霉素(8 μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基加壓篩選，得到穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆。同樣方法用空載慢病毒顆粒處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。

1.4細(xì)胞ZIC1 mRNA及蛋白檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參照，定量PCR分析ZIC1基因。ZIC1引物序列：上游為5′-AACAGCAGCGACCGCAAGAA-3′，下游為5′-TCGGGTTGTCTGTGGAGGGA-3′，內(nèi)參actin引物序列：上游為5′-AACAGCAGCGACCGCAAGAA-3′，下游為5′-TCGGGTTGTCTGTGGAGGGA-3′。real-time PCR按Quant SYBR Green PCR試劑盒說明書操作，實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min，結(jié)果分析ZIC1 mRNA相對(duì)含量采用2-ΔΔCt值表示。ZIC1蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞，按照細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒操作，提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，經(jīng)分光光度計(jì)定量，取50 μg蛋白上樣進(jìn)行12%PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(ZIC1，1∶200)稀釋，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜5、6次，5 min/次，用封閉液以1∶50 000稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。TBST充分洗滌PVDF膜5、6次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘，待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.5細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用MTT法。用0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，收集計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為4×104個(gè)/mL，96孔板每孔接入100 μL細(xì)胞懸液；在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入200 μL無菌PBS，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排，每個(gè)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，小心吸出孔內(nèi)液體，加入預(yù)先配置好混勻的含MTT的DMEM培養(yǎng)基100 μL(DMEM∶MTT=90 μL∶10 μL)，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，室溫低速振蕩10～15 min，使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定568 nm處各孔OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.6細(xì)胞周期檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。用0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min、5 min離心，去上清，PBS重懸潤洗2次，1 000 r/min、5 min離心，去上清，100 μL PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入700 μL預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%，4 ℃固定4 h以上，1 000 r/min、5 min離心，預(yù)冷PBS潤洗2次，加入100 μL RNaseA(50 μg/mL)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI(50 μg/mL)，4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。用0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min、5 min離心，去上清，加PBS重懸，用PBS將細(xì)胞潤洗2次，1 500 r/min、5 min離心，按照AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行，加入500 μL Binding Buffer，重懸細(xì)胞，5 μL AnnexinV-APC混勻后加入5 μL 7-AAD，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2　結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中ZIC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000、0.000，ZIC1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.068、0.000，兩者比較，P均<0.01。兩組細(xì)胞OD值比較見表1。兩組細(xì)胞周期比較見表2。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為24.35%±0.075 5%、7.42%±0.052 7%，兩組比較，P<0.01。

表1　兩組細(xì)胞OD值比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01。

表2　兩組細(xì)胞周期比較±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01。

3　討論

腫瘤的發(fā)生往往伴隨著癌基因的異常激活及抑癌基因的沉默。ZIC基因最早由Aruga等于1994年在成年的小鼠腦中發(fā)現(xiàn)，是一類編碼鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的基因，成員包括ZIC 1～5，均具有3個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)和編碼C末端的鋅指結(jié)構(gòu)域C2H2。ZIC1基因定位于人類3號(hào)染色體長臂2區(qū)4帶(3q24)，其cDNA全長3 100 bp，編碼477個(gè)氨基酸。ZIC1蛋白是重要的轉(zhuǎn)錄因子，可識(shí)別并結(jié)合富含GC序列的靶基因，組成相互作用的“復(fù)合體”，進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)C2H2型鋅指蛋白都含有一個(gè)連接相鄰鋅指的高度保守的街頭序列TG(Q/E)KP。該接頭序列單一位點(diǎn)的突變即可導(dǎo)致鋅指蛋白與DNA的結(jié)合穩(wěn)定性降低至1/20。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ZIC1基因在多種人類腫瘤中表達(dá)異常，如在胃癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肝癌[7]、子宮內(nèi)膜癌[8]、甲狀腺癌[9]中呈低表達(dá)，而在髓母細(xì)胞瘤[10]、腦膜瘤[10]、脂肪肉瘤[11]中呈高表達(dá)。ZIC1的不同表達(dá)差異可能與腫瘤的不同組織來源相關(guān)，但其具體的分子機(jī)制仍不明確。而Pourebrahim等[12]研究首先發(fā)現(xiàn)了ZIC1的異常表達(dá)可能受到DNA甲基化和組蛋白H3甲基化等表觀遺傳學(xué)調(diào)控，后在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等也有類似發(fā)現(xiàn)，這說明DNA甲基化可能是ZIC1基因調(diào)控的重要機(jī)制之一[6～8]。因此，明確ZIC家族基因在不同組織和系統(tǒng)(神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和間葉組織)腫瘤中的表達(dá)變化及其生物學(xué)功能，具有潛在的臨床診斷和治療價(jià)值[1]。

本研究為闡明ZIC1基因在乳腺癌中的作用，通過慢病毒質(zhì)粒載體將ZIC1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，并設(shè)以空質(zhì)粒為對(duì)照組，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ZIC1基因后，不但增強(qiáng)了目的基因的轉(zhuǎn)錄，也增強(qiáng)了蛋白的翻譯。本研究結(jié)果還顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞凋亡率增加。Gan等[6]在結(jié)腸癌中也有類似發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ZIC1基因后可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上可見，轉(zhuǎn)染ZIC1基因可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[1] 鐘菁，王良靜.Zic基因在腫瘤發(fā)生中的作用和分子調(diào)控[J].實(shí)用腫瘤雜志,2011,26(6):647-650.

[2] 李鵬飛，王杰鋒，曹方，等.ZIC1基因在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，25(1)：53-56.

[3] Aruga J. The role of Zic genes in neural development[J]. Mol Cell Neurosci, 2004,26(2):205-221.

[4] Wolfe SA, Nekludova L, Pabo CO. DNA recongnition by Cys2His2 zinc finger proteins[J]. Ann Rev Biophys Biomol Struc, 2000,29:183-212.

[5] Zhong J, Chen S, Xue M, et al. ZIC1 modulates cell-cycle distributions and cell migration through regulation of sonic hedgehog, PI(3)K and MAPK signaling pathways in gastric c-ancer[J]. BMC cancer, 2012,12:290.

[6] Gan LH, Chen S, Zhong J, et al. ZIC1 is downregulated through promoter hypermethylation, and functions as a tumor suppressor gene in colorectal cancer[J]. PLoS One, 2011,6(2):e16916.

[7] Wang YY, Jiang JX, Ma H, et al. Role of ZIC1 methylation in hepatocellular carcinoma and its clinical significance[J]. Tumour Biol, 2014,35(8):7429-7433.

[8] Wong YF, Cheung TH, Lo KW, et al. Identification of molecular markers and signaling pathway in endometrial cancer in Hong Kong Chinese women by genome-wide gene expression profiling[J]. Oncogene, 2007,26(13):1971-1982.

[9] Qiang W, Zhao Y, Yang Q, et al. ZIC1 is a putative tumor suppressor in thyroid cancer by modulating major signaling pathways and transcription factor FOXO3a[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014,99(7):E1163-1172.

[10] Aruga J, Nozaki Y, Hatayama M, et al. Expression of ZIC family genes in meningiomas and other brain tumors[J]. BMC Cancer, 2010,10:79.

[11] Brill E, Gobble R, Angeles C, et al. ZIC1 overexpression is oncogenic in liposarcoma[J]. Cancer Res, 2010,70(17):6891-6901.

[12] Pourebrahim R, Van Dam K, Bauters M, et al. ZIC1 gene expression is controlled by DNA and histone methylation in mesenchymal peoliferations[J]. FEBS Lett, 2007,581(26):5122-5126.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.012

R737.9

A

1002-266X(2016)23-0038-03

2015-11-09)