阿曼古麗·牙生，蘭希，伊慧霞，古麗扎爾·阿不都納斯?fàn)?，彭珊珊，馮寧，閆怡，李慧君，馬秀敏,

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，烏魯木齊 830011；2 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

?

沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的二級結(jié)構(gòu)及B、T細胞表位分析

阿曼古麗·牙生1，蘭希1，伊慧霞1，古麗扎爾·阿不都納斯?fàn)?，彭珊珊2，馮寧1，閆怡2，李慧君1，馬秀敏1,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，烏魯木齊 830011；2 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

目的分析沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的二級結(jié)構(gòu)及B、T細胞表位。方法采用計算機在線預(yù)測網(wǎng)站PSIPRED V3.3對沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和分析；采用BCEpred和ABCpred網(wǎng)絡(luò)軟件對沙眼衣原體主要外膜蛋白B細胞表位進行預(yù)測和分析；采用SYFPEITHI在線軟件對沙眼衣原體主要外膜蛋白的MHC-Ⅰ類HLA-A 0201限制性T細胞表位進行預(yù)測和分析。結(jié)果沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占32.49%、α螺旋結(jié)構(gòu)占41.62%、β-折疊結(jié)構(gòu)占19.80%。沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的B細胞表位氨基酸序列位點分別為41～50、92～101、51～60、306～315、260～269和160～169，MHC-Ⅰ類HLA-A 0201限制性T細胞表位氨基酸序列位點分別為201～209、379～387、3～11、126～134和177～185。結(jié)論沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、α螺旋結(jié)構(gòu)所占比例高，有6個B細胞表位和5個T細胞表位。

沙眼衣原體主要外膜蛋白；抗原表位；T細胞表位；B細胞表位

沙眼衣原體(Ct)是引起人類泌尿生殖道感染的重要病原體，可通過性傳播引起女性宮頸炎、男性尿道炎等疾病，會通過母嬰傳播造成新生兒包涵體性結(jié)膜炎等。Ct感染也與人類乳頭瘤病毒致宮頸癌、人類免疫缺陷病毒感染[1,2]、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征等疾病有關(guān)[3]。Ct感染病程隱匿且反復(fù)，治療困難。接種疫苗是預(yù)防和控制Ct感染最有效和經(jīng)濟的途徑，但使用Ct菌體的效果并不好,還會導(dǎo)致人體嚴(yán)重的病理性損傷[4]。因此，Ct優(yōu)勢表位的研究有很重要的價值。Ct主要外膜蛋白(MOMP)暴露于衣原體表面，占外膜總蛋白的60%以上，作為一種重要的免疫原能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，有很多抗原表位。本研究分析了沙眼衣原體主要外膜蛋白抗原的二級結(jié)構(gòu)及B、T細胞表位，為Ct感染診斷以及高效表位疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　分析方法

采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAA54554.1)檢索Ct MOMP抗原氨基酸序列，通過GenBank檢索出Ct MOMP的基因序列，經(jīng)過比對序列，確定需要的基因序列，用DNAman軟件來推算與之對應(yīng)的氨基酸序列。使用在線預(yù)測網(wǎng)站UCL-CS提供的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)PSIPRED V3.3(網(wǎng)站網(wǎng)址為http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipr-ed/)預(yù)測Ct MOMP抗原氨基酸的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。使用線預(yù)測網(wǎng)站BCEpred(網(wǎng)站網(wǎng)址為http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/)和ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)結(jié)合其中的參數(shù)(抗原性指數(shù)、β轉(zhuǎn)角、柔韌性參數(shù)、親水性參數(shù)、極性參數(shù)、表面可及性參數(shù))對Ct MOMP抗原蛋白的B細胞表位進行分析和預(yù)測，分值高于0.9判斷為抗原B細胞表位。使用線預(yù)測網(wǎng)站SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de)對Ct MOMP抗原蛋白MHC-Ⅰ類HLA-A 0201限制性T細胞表位進行預(yù)測，分值高于20判定為抗原T細胞表位。

2　結(jié)果

2.1Ct MOMP抗原氨基酸序列及二級結(jié)構(gòu)Ct MOMP抗原氨基酸序列共393個，為MKKLLKSV-LVFAALSSASSLQALPVGNPAEPSLMIDGILWEGFGG-GDPCDPCTTWCDAISMRMGYYGDFVFDRVLQTDVN-KEFQMGAKPTTATGNAAAPSTCTARENPAYGRHMQ-DAEMFTNAAYMALNIWDRFDVFCTLGATSGYLKGN-SASFNLVGLFGDNENHATVSDSKLVPNMSLDQSVVE-LYTDTTFAWSAGARAALWECGCATLGASFQYAQSK-PKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYVGQEFPLDLKAGT-DGVTGTKDASIDYHEWQASLALSYRLNMFTPYIGVK-WSRASFDADTIRIAQPKSATTVFDVTTLNPTIAGAGD-VKASAEGQLGDTMQIVSLQLNKMKSRKSCGIAVGTT-IVDADKYAVTVETRLIDERAAHVNAQFRF。Ct MO-MP抗原蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占32.49%、α螺旋結(jié)構(gòu)占41.62%、β-折疊結(jié)構(gòu)占19.80%，抗原中各種結(jié)構(gòu)分布情況見圖1。

注：代表α螺旋，代表β-折疊，代表無規(guī)則卷曲。 Conf: confidence of prediction; pred: predicted secondary structure；AA:target sequence。

圖1Ct MOMP的二級結(jié)構(gòu)

2.2Ct MOMP抗原的B細胞表位由于網(wǎng)站限制，各參數(shù)結(jié)果分為兩段基因展示?？乖瑽細胞表位的氨基酸序列分別為EGFGGD-PCDPCTTWCDTGNAAAPSTCTARENPCTTWCDAISM-RMGYYGAQPKSATTVFDVTTLNTGTKDASIDYHEW-QASGDNENHATVSDSKLVP，位點分別為41～50、92～101、51～60、306～315、260～269和160～169，分值分別為0.94、0.91、0.91、0.91、0.91、0.91。

2.3Ct MOMP抗原的T細胞表位根據(jù)預(yù)測軟件得到Ct MOMP蛋白MHC-Ⅰ類HLA-A 0201限制性T細胞表位氨基酸序列分別為EGFGGDPCDPCT-TWCD、TGNAAAPSTCTARENPCTTWCDAISMRMGY-YGAQPKSATTVFDVTTLNTGTKDASIDYHEWQASG-DNENHATVSDSKLVP，位點分別為201～209、379～387、3～11、126～134和177～185，分值分別為29、25、23、23、21。

3　討論

Ct是引起人類泌尿生殖系統(tǒng)尤其是女性輸卵管炎癥的重要病原體，危害人體身心健康并影響患者生活質(zhì)量。目前對于Ct感染的主要治療手段是大劑量抗生素治療[5～7]，但Ct感染過程中已對人體造成了損害，因此當(dāng)前研究的重點在于Ct感染的預(yù)防。

表位疫苗是選擇抗原上抗原性最強的表位氨基酸序列制備而成的[8,9]。MOMP是Ct的外膜蛋白，存在于所有血清型中。MOMP不僅是一種重要的免疫原，也有著眾多保護性抗原和B細胞、T細胞表位[10,11]，因此本研究將MOMP作為目標(biāo)抗原即把MOMP抗原蛋白作為表位來研究表位疫苗。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)進行預(yù)測[12,13]，發(fā)現(xiàn)抗原蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占氨基酸總數(shù)的32.49%，α-螺旋結(jié)構(gòu)占41.62%，β-折疊結(jié)構(gòu)占19.80%，Ct MOMP重組蛋白中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例較大，因為這兩種結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，這兩種結(jié)構(gòu)易于形成表位區(qū)域，容易和抗體嵌和。免疫原性較強，就能夠刺激機體形成特異性的抗體，更有可能形成B細胞表位。本研究通過SYFPEITHI對MOMP抗原蛋白HLA-A0201 MHC-Ⅰ類HLA-A 0201限制性表位進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)201～209、379～387、3～11、126～134和177～185氨基酸序列是5個分值較高的區(qū)域，更有可能形成T細胞表位。

本研究通過生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)址對Ct的主要外膜蛋白MOMP抗原蛋白的二級結(jié)構(gòu)及T細胞表位、B細胞表位進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了免疫原性較強的6個B細胞表位和5個T細胞表位，為臨床Ct感染預(yù)防、診斷、治療提供了新的方向，也為研制高效Ct感染的疫苗奠定了基礎(chǔ)。

[1] Shew ML, Ermel AC, Weaver BA, et al. Association of Chlamydia trachomatis infection with redetection of human papillomavirus after apparent clearance[J]. J Infect Dis, 2013,208(9):1416-1421.

[2] Bhatla N, Puri K, Joseph E, et al. Association of Chlamydia trachomatis infection with human papillomavirus (HPV) & cervical intraepithelial neoplasia a pilot study[J]. Indian J Med Res, 2013,137(3):533-539.

[3] Gerard HC, Stanich JA, Whittum-Hudson JA, et al. Patients with Chlamydia-associated arthritis have ocular (trachoma), not genital, serovars of C. trachomatis in synovial tissue[J]. Microbial Pathog, 2010,48(2):62-68.

[4]Cokkinos DV, Kolovou G, Manoussakis M, et al. Myocardial involvement in a patient with Chlamydia trachomatis infection[J]. J Card Fail, 2008,14(4):351-353.

[5] Zhang H, Zhou Z, Chen J, et al. Lack of long-lasting hydrosalpinx in A/J mice correlates with rapid but transient chlamydial ascension and neutrophil recruitment in the oviduct following intravaginal inoculation with Chlamydia muridarum[J]. Infect Immun, 2014,82(7):2688-2696.

[6] Schautteet K, Stuyven E, Beeckman DS, et al. Protection of pigs against Chlamydia trachomatis challenge by administration of a MOMP-based DNA vaccine in the vaginal mucosa[J]. Vaccine, 2011,29(7):1399-1407

[7] Kollipara A, Wan C, Rawlinson G, et al. Antigenic specificity of a monovalent versus polyvalent MOMP based Chlamydia pecorum vaccine in koalas (Phascolarctos cinereus)[J]. Vaccine, 2013,31(8):1217-1223.

[8] Virginio VG, Taroco L, Ramos AL, et al. Effects of protoscoleces and AgB from Echinococcus granulosus on human neutrophils: possible implications on the parasite′s immune evasion mechanisms[J]. Parasitol Res, 2007,100(5):935-942.

[9] Schuler MM, D?nnes P, Nastke MD, et al. SNEP: SNP-derived epitope prediction program for minor H antigens[J]. Immunogenetics, 2005,57(11):816-820.

[10] Dixit S, Singh SR, Yilma AN, et al. Poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol) nanoparticles provide sustained delivery of a Chlamydia trachomatis recombinant MOMP peptide and potentiate systemic adaptive immune responses in mice[J]. Nanomedicine, 2014,10(6):1311-1321.

[11] Farris CM, Morrison SG, Morrison RP. CD4+T cells and antibody are required for optimal major outer membrane protein vaccine-induced immunity to Chlamydia muridarum genital infection[J]. Infect Immun, 2010,78(10):4374-4383.

[12]Chen J, Gong WC, Li WS, et al. Identification ofImmunedominant linear B-cell epitopes within the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis[J]. Acta Biochimica Et Bionphysica Sinica, 2010，42(11):771-778.

[13]Chen J, Gong W, Liu JX, et al. Protective immunity against Chlamydia trachomatis genital infection induced by a vaccine based on the major outer membrane multi-epitope human papilloma virus major capsid prote in[J]. Vaccine, 2011,29(15):2672-2678.

Secondary structure and B-, T-cell epitope analysis of major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis

AmanguliYasheng1,XILan,YIHuixia,AbudunasierGulizhaer,PENGShanshan,FENGNing,YANYi,LIHuijun,MAXiumin

(1TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830011,China)

ObjectiveTo analyze the secondary structure and B, T-cell epitope analysis of major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis (Ct MOMP). MethodsThis study was based on the prediction and analysis of the secondary structure using PSIPRED V3.3 and B cell epitopes using BCEpred and ABCPred software and T cell epitopes using SYFPEITHI software for the Ct MOMP antigen protein . ResultsIn the secondary structure of Ct MOMP, random coil accounted for 32.49%, α-helix structure accounted for 41.62%, β-folding structure accounted for 19.80%. The amino acid sequences of Ct MOMP B-cell epitopes were the 41-50, 92-101, 51-60, 306-315, 260-269 and 160-169.The amino acid sequences of restrictive T-cell epitopes in MHC-I type of HLA-A 0201 were 201-209, 379-387, 3-11, 126-134 and 177-185.Conclusion There is no random coil in the secondary structure of Ct MOMP, the proportion of α-helix structure is high in secondary structure of Ct MOMP, and there are 6 B-cell epitopes and 5 T-cell epitopes.

Chlamydia trachomatis, major outer membrane protein; antigenic epitope; T-cell epitope; B-cell epitope

新疆維吾爾族自治區(qū)科研基金資助項目(2015211C035)；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)科研基金資助項目(2013ZRZD15)。

阿曼古麗·牙生(1969-)，女，主任技師，主要從事病原微生物研究。E-mail： 1664257726@qq.com

簡介：馬秀敏(1968-)，女，主任技師，教授，主要從事病原微生物研究。E-mail： maxiumin2010@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.006

R392

A

1002-266X(2016)23-0020-03

2015-12-30)