陽需求,陳劍鋒,鄭向南,謝友坪

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108)

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光照強(qiáng)度和氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞生長和細(xì)胞組成的影響

陽需求,陳劍鋒,鄭向南,謝友坪*

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108)

本研究考察了不同光照強(qiáng)度和氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞生長及其細(xì)胞組成的影響。結(jié)果表明,隨光照強(qiáng)度的增強(qiáng),小球藻生物量產(chǎn)率和碳水化合物含量可顯著提高,而蛋白質(zhì)含量和油脂含量則呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì);在光照強(qiáng)度為750 μmol·m-2·s-1時(shí),小球藻生物量產(chǎn)率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率達(dá)最大值,分別為935.6、509.8、256.0 mg·L-1·d-1;而光照強(qiáng)度為450 μmol·m-2·s-1時(shí),小球藻油脂產(chǎn)率達(dá)最大值,為105.0 mg·L-1·d-1。通過氮源匱乏培養(yǎng)來促進(jìn)小球藻碳水化合物和油脂含量的積累,發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)磪T乏培養(yǎng)時(shí)間分別為2 d和4 d時(shí),小球藻碳水化合物產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率可進(jìn)一步提高至471.1 mg·L-1·d-1和150.6 mg·L-1·d-1。

小球藻,光照強(qiáng)度,氮源匱乏,細(xì)胞組成

微藻具有培養(yǎng)簡單、生長周期短等優(yōu)勢(shì),因此,近年來使用微藻來生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品和能源產(chǎn)品逐漸成為研究熱點(diǎn)[1-2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在營養(yǎng)充足的光自養(yǎng)條件下,大多數(shù)藻種的藻細(xì)胞組成成分大都主要為蛋白質(zhì)(30%～50%)、碳水化合物(20%～40%)和油脂(8%～15%)[3]。其中,較高的蛋白質(zhì)含量使得藻體可用作健康食品和動(dòng)物飼料添加劑[4]。另外,由于微藻碳水化合物主要為淀粉和纖維素,且不含木質(zhì)素,因此很容易被水解為葡萄糖,進(jìn)而被用作微生物酒精發(fā)酵的碳源來源[5]。而微藻油脂的脂肪酸組成主要為十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸,十分適宜用作生物柴油的合成[6]。由此可見,微藻的應(yīng)用范圍十分廣泛,具有相當(dāng)大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

微藻光合碳的流向會(huì)隨環(huán)境以及培養(yǎng)條件的變化而改變,因此其細(xì)胞的生化組成,特別如蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物等往往會(huì)有所不同[3,7]。對(duì)于光自養(yǎng)培養(yǎng)微藻來說,光照強(qiáng)度不僅影響藻體細(xì)胞生長,而且對(duì)其細(xì)胞組成成分也有著顯著影響[7-10]。此外,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞需在氮源充足條件下才會(huì)積累蛋白質(zhì)含量[11],而碳水化合物或油脂含量則需在氮源匱乏條件下才會(huì)快速積累[7,9,12-14]。截至目前,已有較多文獻(xiàn)集中于微藻細(xì)胞單一成分(如蛋白質(zhì)、油脂或碳水化合物等)的生產(chǎn)研究,如考察光照強(qiáng)度、氮源種類及濃度和培養(yǎng)策略等的影響[8,11,15-18]。但對(duì)于微藻的規(guī)?；瘧?yīng)用,不應(yīng)只限于單一細(xì)胞成分的開發(fā)利用。為減少微藻細(xì)胞的開發(fā)利用成本,應(yīng)考慮對(duì)其進(jìn)行多組分綜合利用[19]。本實(shí)驗(yàn)以小球藻(ChlorellasorokinianaFACHB-275)為研究對(duì)象,考察光照強(qiáng)度和氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)其細(xì)胞生長和細(xì)胞組成的影響,旨在為微藻有效成分的開發(fā)利用提供重要參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

小球藻(ChlorellasorokinianaFACHB-275)購自中國科學(xué)院水生生物研究所;硝酸鈉、七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、氯化鈉等均為分析純,國藥集團(tuán)。

AB104N電子天平德國Sartorius公司;UV-1700紫外分光光度計(jì)日本島津公司;Minibeadbeater-16細(xì)胞破碎儀美國Biospec公司;Vario EL III型元素分析儀德國Elementar公司;TGL-15B高速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;Fd-1-50真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RCT B S25型磁力攪拌器德國IKA公司;1 L光生物反應(yīng)器德國Schott Duran公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基為Modified Bristol’s Medium[7],培養(yǎng)基組成(g·L-1):NaCl 0.025,CaCl2·2H2O 0.025,NaNO30.750,MgSO4·7H2O 0.075,K2HPO40.075,KH2PO40.175,FeCl3·6H2O 0.005,微量元素1 mL。其中,微量元素組成(g·L-1):H3BO30.061,MnSO4·7H2O 0.169,ZnSO4·7H2O 0.287,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.00124,CuSO4·5H2O 0.0025。

使用1 L Schott Duran藍(lán)蓋瓶為光生物反應(yīng)器,瓶口用開有四個(gè)孔的橡膠塞密封,四個(gè)孔分別用于通氣、排氣、溫度測(cè)量和取樣。1 L光生物反應(yīng)器裝1 L培養(yǎng)液,接種控制藻體初始濃度為70 mg·L-1,將反應(yīng)器置于控溫磁力攪拌器上,控制攪拌速率400 r·min-1、溫度28 ℃,通入CO2濃度為2.5%的空氣-二氧化碳混合氣,通氣量0.2 VVM。

1.2.2光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞組成的影響使用熒光燈調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度分別為:75、150、300、450、600、750、900 μmol·m-2·s-1,進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng),每隔12 h取樣測(cè)定藻體生物量、氮源濃度和藻體細(xì)胞組成成分,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行。

1.2.3氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞生長及細(xì)胞組成的影響固定光照強(qiáng)度為750 μmol·m-2·s-1,進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng),每隔12 h取樣測(cè)定藻體生物量和氮源濃度。當(dāng)初始氮源濃度被耗盡時(shí),每隔24 h取樣測(cè)定藻體細(xì)胞組成成分,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行。

1.2.4藻體生物量測(cè)定待測(cè)藻液稀釋0～20倍后,于685 nm波長條件下測(cè)定吸光度(OD685 nm)。使用已稱重的醋酸纖維素膜(孔徑0.45 μm,直徑47 mm)過濾50 mL待測(cè)藻液,將過濾后的濾膜置于105 ℃烘箱中,烘干至恒重,計(jì)算過濾前后濾膜的干重,即得藻體細(xì)胞生物量。由于藻體生物量與其在特定波長下的吸光度存在線性關(guān)系,以O(shè)D685值為橫坐標(biāo),藻體生物量為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.255x-0.006(R2=0.997)。根據(jù)以下方程計(jì)算藻體生物量產(chǎn)率:

生物量產(chǎn)率(mg·L-1·d-1)=(t時(shí)刻藻體濃度-藻體初始濃度)/培養(yǎng)時(shí)間t

1.2.5氮源濃度測(cè)定由于硝酸根離子在220 nm波長處有最大的吸收值,因此采用紫外分光光度法測(cè)定培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度[20]。

1.2.6藻體細(xì)胞組成的測(cè)定采用Fuentes等[21]報(bào)道的元素分析法測(cè)定藻體蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取5 mg干藻體,使用元素分析儀測(cè)定藻體中的N元素含量,根據(jù)以下方程計(jì)算藻體蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)產(chǎn)率。

蛋白質(zhì)含量(%)=6.25×氮元素含量

蛋白質(zhì)產(chǎn)率(mg·L-1·d-1)=生物量產(chǎn)率×蛋白質(zhì)含量

藻體碳水化合物含量測(cè)定:準(zhǔn)確稱取15.0 mg干藻體,置于2 mL離心管中,加入1 mL 72% H2SO4和0.5 g研磨珠,使用bead-beater破碎7 min后,在30 ℃條件下水浴1 h。將混合液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,再加入17 mL蒸餾水稀釋至4% H2SO4,在121 ℃條件下滅菌20 min?；旌弦涸?000 r·min-1條件下離心2 min后,采用苯酚-硫酸法測(cè)定上清液中的碳水化合物含量。根據(jù)以下方程計(jì)算藻體碳水化合物產(chǎn)率。

碳水化合物產(chǎn)率(mg·L-1·d-1)=生物量產(chǎn)率×碳水化合物含量

采用Blight-Dyer法提取測(cè)定油脂含量[22],根據(jù)以下方程計(jì)算藻體油脂產(chǎn)率：

油脂產(chǎn)率(mg·L-1·d-1)=生物量產(chǎn)率×油脂含量

1.2.7數(shù)據(jù)處理與分析分別采用SPSS 20.0和Oringin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和圖形繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞生長和氮源消耗的影響

由圖1和圖2可知,在不同光照條件下,培養(yǎng)初期的藻體生物量濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸提高;當(dāng)初始氮源濃度耗盡后,藻體生物量濃度還可持續(xù)提高,但細(xì)胞生長速率呈現(xiàn)降低趨勢(shì),之后藻體細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期。分析原因可能是氮源耗盡后,小球藻開始利用自身蛋白為氮源繼續(xù)生長,但當(dāng)自身蛋白降低至不足以維持細(xì)胞正常生長時(shí),藻細(xì)胞開始進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)光照強(qiáng)度由75 μmol·m-2·s-1增大至300 μmol·m-2·s-1時(shí),小球藻的細(xì)胞生長速率和氮源消耗速率均明顯提高,初始氮源濃度分別在培養(yǎng)時(shí)間為4.5、2.8、2.3 d時(shí)耗盡;但進(jìn)一步增大光照強(qiáng)度時(shí),藻細(xì)胞生長速率和氮源消耗速率均提高不明顯。該結(jié)果表明,當(dāng)光照強(qiáng)度小于300 μmol·m-2·s-1時(shí),小球藻細(xì)胞處于光照限制條件;而當(dāng)光照強(qiáng)度為300～900 μmol·m-2·s-1時(shí),小球藻細(xì)胞處于光照飽和條件。Ho等[16]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量為20 mg·L-1時(shí),光照強(qiáng)度高于75 μmol·m-2·s-1就會(huì)對(duì)小球藻Chlorella vulgaris FSP-E生長產(chǎn)生抑制作用,而當(dāng)接種量為80～200 mg·L-1時(shí),其生物量產(chǎn)率均在450 μmol·m-2·s-1達(dá)最大值。Yeh等[7]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用LT5熒光燈培養(yǎng)小球藻Chlorella vulgaris ESP-31時(shí),其光飽和強(qiáng)度為9～32 W·m-2。這說明光照強(qiáng)度對(duì)微藻細(xì)胞生長的影響主要與藻種自身特性和培養(yǎng)條件相關(guān)。而在本實(shí)驗(yàn)所采用的培養(yǎng)條件范圍內(nèi),發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞生長未受抑制,說明該藻株可耐受較高的光照強(qiáng)度。

圖1　不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞生長的影響Fig.1　Effect of different light intensities on cell growth rate of Chlorella sorokiniana

圖2　不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻氮源消耗的影響Fig.2　Effect of different light intensities nitrogen consumption of Chlorella sorokiniana

2.2不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞組成的影響

對(duì)于不同的光照培養(yǎng)條件,均在氮源耗盡的初始時(shí)間點(diǎn),收集藻細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞組成成分分析,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,藻體細(xì)胞主要組成成分為蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物,這三者可占到總細(xì)胞組成的90%左右,但在不同光照培養(yǎng)條件下,這三者分別占總細(xì)胞重量的比例會(huì)有所不同。當(dāng)光照強(qiáng)度由75 μmol·m-2·s-1增大至900 μmol·m-2·s-1時(shí),蛋白質(zhì)和油脂含量分別由61.0%和13.9%下降至52.9%和8.2%,而碳水化合物含量由14.6%提高至29.3%。該結(jié)果表明,增大光照強(qiáng)度有利于小球藻碳水化合物的積累,但不利于積累蛋白質(zhì)和油脂。Guedes等[8]研究表明增大光照強(qiáng)度也會(huì)降低微藻Pavlovalutheri的油脂含量,主要原因?yàn)橛椭侨~綠體的重要組成成分,當(dāng)光照強(qiáng)度較高時(shí),微藻細(xì)胞就不需要較高的葉綠體活性來吸收光能量。Ho等[9]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)光照強(qiáng)度由60 μmol·m-2·s-1增大至420 μmol·m-2·s-1時(shí),也可明顯提高微藻ScenedesmusobliquusCNW-N的碳水化合物含量。但也有研究表明,增大光照強(qiáng)度是否會(huì)促進(jìn)藻細(xì)胞積累碳水化合物含量,主要是與微藻種類及其自身特性相關(guān),藻細(xì)胞積累碳水化合物與光照強(qiáng)度不存在一定的正相關(guān)性[10]。

圖3　不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞組成的影響Fig.3　Effect of different light intensities on cell composition of Chlorella sorokiniana

2.3不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻生物量產(chǎn)率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率的影響

對(duì)于不同的光照培養(yǎng)條件,均在氮源耗盡的初始時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物量產(chǎn)率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4和圖5所示。由圖4和圖5可知,當(dāng)光照強(qiáng)度由75 μmol·m-2·s-1增大至900 μmol·m-2·s-1時(shí),小球藻生物量產(chǎn)率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。雖然隨光照強(qiáng)度的增大,藻體蛋白質(zhì)和油脂含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì),但由于生物量產(chǎn)量的明顯提高,也使得其各自產(chǎn)率可在一定程度上有所提高。其中,當(dāng)光照強(qiáng)度為750 μmol·m-2·s-1時(shí),生物量產(chǎn)率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率達(dá)最大值,分別為935.6、509.8、256.0 mg·L-1·d-1。而當(dāng)光照強(qiáng)度為450 μmol·m-2·s-1時(shí),油脂產(chǎn)率達(dá)最大值,為105.0 mg·L-1·d-1。

圖4　不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻生物量產(chǎn)率和蛋白質(zhì)產(chǎn)率的影響Fig.4　Effect of different light intensities on biomass productivity and protein productivity of Chlorella sorokiniana

表1　光自養(yǎng)條件下小球藻C. sorokiniana FACHB-275的生物量產(chǎn)率、碳水化合物產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率與文獻(xiàn)結(jié)果的比較

圖5　不同光照強(qiáng)度對(duì)小球藻生物量產(chǎn)率和蛋白質(zhì)產(chǎn)率的影響Fig.5　Effect of different light intensities on biomass productivity and proteinproductivity of Chlorella sorokiniana

2.4氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞組成的影響

在光照強(qiáng)度為750 μmol·m-2·s-1條件下,考察了氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞組成的影響,結(jié)果如圖6所示。對(duì)于不同的氮源匱乏培養(yǎng)時(shí)間,其藻細(xì)胞組成成分也都主要為蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物,同時(shí)這三者所占比例隨培養(yǎng)時(shí)間不同而呈現(xiàn)明顯變化。小球藻的蛋白質(zhì)含量由54.5%下降至18.5%;油脂含量由8.5%上升至27.9%,相比氮源匱乏培養(yǎng)前提高了89%;而碳水化合物含量則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),在氮源匱乏培養(yǎng)2 d(即總培養(yǎng)時(shí)間為4 d)時(shí)達(dá)最大值,為59.1%,相比氮源匱乏培養(yǎng)前提高了84%。

圖6　氮源匱乏培養(yǎng)對(duì)小球藻細(xì)胞生長和細(xì)胞組成的影響Fig.6　Effect of nitrogen deprivation on cell growth and cell composition of Chlorella sorokiniana

分析原因主要是在氮源匱乏條件下,小球藻開始利用自身蛋白為氮源以維持細(xì)胞正常生長需求,同時(shí)引起其代謝轉(zhuǎn)向非含氮儲(chǔ)能物質(zhì)的合成(如油脂和碳水化合物),以適應(yīng)外界條件的變化[13]。此外,有研究表明,淀粉為大多數(shù)微藻主要的儲(chǔ)能碳水化合物,并且其合成和油脂合成共用相同的前體物質(zhì)[12]。而對(duì)于大多數(shù)微藻來說(特別是綠藻),在營養(yǎng)缺乏的初始階段主要是合成淀粉來作為儲(chǔ)能物質(zhì),而只有當(dāng)營養(yǎng)源(特別是氮源)缺乏較長時(shí)間時(shí),藻細(xì)胞才會(huì)由淀粉合成轉(zhuǎn)變?yōu)楦邇?chǔ)能物質(zhì)油脂的合成[12-13]。因此,可發(fā)現(xiàn)在氮源匱乏條件下,小球藻達(dá)最高碳水化合物產(chǎn)率(471.1 mg·L-1·d-1)和油脂產(chǎn)率(150.6 mg·L-1·d-1)的時(shí)間點(diǎn)會(huì)有所不同,分別在氮源匱乏培養(yǎng)2 d和4 d時(shí)。由表1可知,當(dāng)固定氮源匱乏培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí),小球藻生物量產(chǎn)率(797.1 mg·L-1·d-1)和碳水化合物產(chǎn)率(471.1 mg·L-1·d-1)優(yōu)于大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果,同時(shí)其油脂產(chǎn)率(104.4 mg·L-1·d-1)也相對(duì)較好。因此,通過此方法小球藻可同時(shí)用于碳水化合物和油脂的生產(chǎn)。

3　結(jié)論

隨光照強(qiáng)度的增強(qiáng),小球藻生物量產(chǎn)率和碳水化合物含量可明顯提高,而蛋白質(zhì)含量和油脂含量則呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì);小球藻生物量產(chǎn)率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率在光照強(qiáng)度為750 μmol·m-2·s-1時(shí)達(dá)最大值,而油脂產(chǎn)率則在光照強(qiáng)度為450 μmol·m-2·s-1時(shí)達(dá)最大值。通過氮源匱乏培養(yǎng)可明顯促進(jìn)小球藻碳水化合物和油脂含量的積累,發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)磪T乏培養(yǎng)時(shí)間分別為2 d和4 d時(shí),小球藻碳水化合物產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率可分別達(dá)最大值,相比氮源匱乏培養(yǎng)前,分別提高了84%和89%。而當(dāng)固定氮源匱乏培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí),小球藻的生物量產(chǎn)率、碳水化合物產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率優(yōu)于大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。本研究可為利用小球藻同時(shí)生產(chǎn)碳水化合物和油脂提供一定的參考依據(jù)。

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Effects of light intensity and nitrogen limitation on cell growth and cell composition ofChlorellasorokiniana

YANG Xu-qiu,CHEN Jian-feng,ZHENG Xiang-nan,XIE You-ping*

(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

The effects of light intensity and nitrogen limitation on cell growth and cell composition ofChlorellasorokinianawas investigated in this study. The results showed that a high light intensity could significantly improve biomass productivity and carbohydrate content ofChlorellasorokiniana,but caused a slight decrease in lipid content and protein content. The highest biomass productivity(935.6 mg·L-1·d-1),protein productivity(509.8 mg·L-1·d-1)and carbohydrate productivity(256.0 mg·L-1·d-1)were achieved at a light intensity of 750 μmol·m-2·s-1,while the highest lipid productivity(105.0 mg·L-1·d-1)was obtained at a light intensity of 450 μmol·m-2·s-1. Moreover,nitrogen deprivation was employed to trigger the accumulation of lipid and carbohydrate. It was found that under nitrogen deprivation for 2 days and 4 days,the carbohydrate productivity and lipid productivity ofChlorellasorokinianacould be further increase to 471.1 mg·L-1·d-1and 150.6 mg·L-1·d-1,respectively.

Chlorellasorokiniana;light intensity;nitrogen deprivation;cell composition

2016-04-14

陽需求(1994-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：2434949390@qq.com。

謝友坪(1986-)，男，助理研究員，研究方向：生物化工，E-mail：ypxie@fzu.edu.cn。

福建省青年科技人才創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2016J05077)；福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015-G-69)；福州大學(xué)校人才基金項(xiàng)目(XRC-1464)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0246-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.038