賀紅宇,朱永清,王自鵬,劉　培,詹　敏,曾曉丹,*

(1.四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所,四川成都 610066;2.四川省農業(yè)科學院,四川成都 610066)

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10種植物精油對圣女果中三種致病菌抑制效果的研究

賀紅宇1,朱永清1,王自鵬2,劉培1,詹敏1,曾曉丹1,*

(1.四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所,四川成都 610066;2.四川省農業(yè)科學院,四川成都 610066)

通過研究植物精油對圣女果致病菌的抑制效果,篩選出對圣女果有良好貯藏保鮮效果的植物精油。使用不同濃度的10種植物精油,采用體外熏蒸法和直接接觸法,篩選出對圣女果中三種致病菌具有較強抑制效果的精油,并研究其最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。結果顯示植物精油對三種致病菌的體外熏蒸法優(yōu)于直接接觸法;肉桂精油、山蒼子精油、丁香精油、牛至精油對白地霉菌的最低抑菌濃度分別為0.05×104、0.1×104、0.5×104、0.5×104μL/L,最低殺菌濃度分別為0.05×104、0.1×104、0.5×104、1.0×104μL/L;肉桂精油、丁香精油、牛至精油對赤霉菌的最低抑菌濃度分別為0.05×104、0.2×104、0.2×104μL/L,最低殺菌濃度分別為0.05×104、0.2×104、0.5×104μL/L;肉桂精油、丁香精油、牛至精油、山蒼子精油對毛霉菌的最低抑菌濃度分別為0.1×104、0.5×104、1.0×104、>1.0×104μL/L,最低殺菌濃度分別為0.1×104、0.5×104、>1.0×104、>1.0×104μL/L。肉桂精油、山蒼子精油、丁香精油、牛至精油對白地霉菌均有較好抑制作用;肉桂精油、丁香精油、牛至精油對赤霉菌具有良好的抑菌及殺菌作用;肉桂精油、丁香精油對毛霉菌有較好抑制作用,牛至精油對毛霉菌有一定的抑菌作用,但殺菌效果不明顯,山蒼子精油對毛霉菌的抑菌殺菌效果最差。

圣女果,致病菌，植物精油,抑制效果,最低抑菌濃度,最低殺菌濃度

圣女果(Cherry Tomato,Lycopersicon esculentum var.cerasiforme)又稱珍珠番茄、櫻桃番茄、小番茄,內含糖、有機酸、礦物質和多種維生素等營養(yǎng)成分,尤其含人體必需的VC,含量是普通番茄的1.7倍,是難得的“水果蔬菜”,且是人類膳食中番茄紅素的主要來源,深受人們的喜愛,同時因其具有延緩衰老、增強抵抗力、促進發(fā)育、抗癌、防癌等功效,被聯(lián)合國糧農組織列為優(yōu)先推廣的“四大水果”之一[1-3]。

圣女果在我國許多地區(qū)已大量種植,其成熟果皮較薄,含水量高,且屬于呼吸躍變型果實,自然采后在貯藏、運輸和銷售環(huán)節(jié)易受機械損傷、昆蟲侵害、物理化學傷害及微生物侵染,容易腐爛變質。其中,微生物侵染中的真菌致腐是導致水果采后損失的一個重要因素,從保鮮的角度出發(fā),控制真菌致腐的發(fā)生具有重要意義[4]。目前,圣女果的保鮮方法主要有化學試劑保鮮法、低溫保藏法、氣調保藏法、輻射保鮮法、涂膜保鮮法等[5-9]。然而,這些方法各有弊端:化學保鮮中的化學試劑因其致癌、致畸、毒性殘留、環(huán)境污染和易引起病菌耐受等消極作用,使得應用越來越多地受到限制[10];低溫貯藏能耗高,若操作不當還易導致果實冷害;氣調貯藏投資較大,且對氣體比例要求比較嚴格,穩(wěn)定性差;輻射保鮮對輻射使用計量要求非常嚴格,操作難度較大;涂膜保鮮法所選用的成膜材料多為親水性多糖或蛋白質類,使用該溶液進行涂膜常出現(xiàn)干燥時間長、易滋生微生物,且涂膜效果不穩(wěn)定,易受環(huán)境溫度、濕度的影響,難以形成均勻、穩(wěn)定、持久的被膜。出于對食品安全的擔憂,尋找來自自然界的天然保鮮劑是目前防治新鮮果蔬采后病害最有希望的方法之一。

本實驗以天然植物精油為抑菌劑,通過研究其對自然腐爛圣女果中分離出的三株致病菌的體外抑菌能力,篩選出對圣女果貯藏保鮮有潛在效果的精油,為下一步以綠色、安全的方式開展圣女果保鮮工作提供一定的參考。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

肉桂精油、茶樹精油、薄荷精油、牛至精油、薰衣草精油、香茅精油、山蒼子精油、佛手柑精油、丁香精油江西省紅星化工有限公司；檸檬精油四川省安岳縣綠海源科技開發(fā)有限公司;XFQ-1、XFQ-2、XFQ-3菌均由本實驗室從自然腐爛的圣女果中分離純化所得,經18S rDNA鑒定分別為白地霉菌(Galactomycescandidum)、赤霉菌(Gibberellasp. strain)、毛霉菌(Mucorfragilis);馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、氯化鈉、無水乙醇、吐溫-80等試劑均為分析純。

JJ-CJ-1F超凈工作臺蘇州市金凈凈化設備科技有限公司;LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械;YXQ-LS-50SII立式壓刀蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;CP214電子天平奧豪斯儀器上海有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1精油對病原菌的體外熏蒸處理實驗參考馮武的濾紙片法[11]。用無菌打孔器在長有真菌(培養(yǎng)6 d)的平板上取直徑為5 mm的菌塊放入新制的PDA平板中央。將平板倒置,取直徑為5 mm的無菌濾紙片放在平板蓋中央,用移液器分別吸取1、2、3、4、5 μL精油于濾紙片上,重復6次,以濾紙片上不加精油的平板為對照,迅速用保鮮膜密封,于27 ℃培養(yǎng)7 d后觀察結果,用十字交叉法測量菌落生長直徑,通過以下公式計算出抑制率。

抑制率(%)=(C-T)/C×100

其中:C:對照菌落直徑(cm);T:不同濃度條件下菌落直徑(cm)。

1.2.2精油對病原菌的直接接觸抑制實驗參考徐龍的方法[12]。將一定體積的精油加入到已滅菌的PDA培養(yǎng)基(冷卻至50 ℃左右)中,使精油終濃度分別為100、200、300、400、500 μL/L,搖勻后倒入培養(yǎng)皿,每皿20 mL。用無菌打孔器取直徑為5 mm的病原菌菌塊接入平板中央,以不添加精油的培養(yǎng)基為對照。重復6次,保鮮膜密封后置于27 ℃溫度下培養(yǎng)7 d,用十字交叉法測量菌落生長直徑,并計算抑菌率。抑菌率計算公式同1.2.1。

1.2.3精油最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定在無菌條件下,培養(yǎng)皿中加入14 mL的PDA培養(yǎng)基,再吸取1 mL濃度分別為15×104、7.5×104、3×104、1.5×104、0.75×104μL/L的精油(通過1.2.1和1.2.2篩選出具有抑菌效果的精油),以不添加精油的培養(yǎng)基為對照,搖勻,重復6次。編號后吸取待測菌種的懸浮液100 μL(控制濃度為105～106CFU/mL)于培養(yǎng)基表面,涂布均勻,置于27 ℃下培養(yǎng)5 d,觀察有無菌落生長,若有記為陽性(+),表明該種精油無抑制作用;若無記為陰性(-),以完全沒有菌生長的最低濃度作為該精油的MIC[13]。將完全沒有菌生長的平皿用無菌打孔器取直徑為5 mm的餅轉接至空白PDA平板上,培養(yǎng)4 d若仍不長菌,則為MBC[14]。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和處理利用Microsoft Excel 2007實現(xiàn)。

2　結果與分析

2.110種植物精油的抑菌性

2.1.110種精油對XFQ-1菌的抑菌效果研究10種植物精油對XFQ-1菌的體外熏蒸抑制效果和直接接觸抑制效果見表1和表2。結果顯示,各種精油對XFQ-1菌均有不同程度的抑制效果,且隨著精油濃度的增加,其抑制率也逐漸增加;此外,大多數(shù)精油表現(xiàn)出體外熏蒸抑菌效果好于直接接觸法抑菌效果。由表1熏蒸處理結果可知,在1 μL低濃度熏蒸下,抑制效果較好的精油有肉桂精油、牛至精油、山蒼子精油,其抑制率均達95%以上,其次為香茅精油,抑制率達60%以上;從表2直接接觸處理結果可知,肉桂精油和山蒼子精油具有較強的抑制作用,在低濃度下抑制率均達90%以上,其次為香茅精油和牛至精油,在低濃度下抑制率達50%以上。

表1　10種植物精油對XFQ-1菌的體外熏蒸處理效果

表2　10種植物精油對XFQ-1菌的直接接觸抑制效果

綜合兩種處理方式的結果,可選擇肉桂精油、牛至精油、山蒼子精油、香茅精油繼續(xù)進行MIC和MBC的實驗。

2.1.210種植物精油對XFQ-2菌的抑菌效果研究10種植物精油對XFQ-2菌的體外熏蒸抑制效果和直接接觸抑制效果見表3和表4。結果顯示,熏蒸處理效果好于直接接觸處理。在體外熏蒸實驗中,只有肉桂精油、茶樹精油、牛至精油、山蒼子精油、佛手柑精油和丁香精油對XFQ-2菌有抑制作用,但在3 μL低濃度熏蒸下,表現(xiàn)出有較強抑制效果的精油只有肉桂精油、茶樹精油、牛至精油和丁香精油,抑制率均達50%以上。在直接接觸抑菌實驗中,只有肉桂精油、牛至精油、山蒼子精油和丁香精油對XFQ-2菌有抑制作用,且表現(xiàn)出較強抑制效果的有肉桂精油、牛至精油和丁香精油;而在設定的濃度內,無論是體外熏蒸處理還是直接接觸處理,薄荷精油、薰衣草精油、香茅精油、檸檬精油均無抑菌作用。

表3　10種植物精油對XFQ-2菌的體外熏蒸處理效果

表4　10種植物精油對XFQ-2菌的直接接觸抑制效果

綜合兩種處理方式的結果,可選擇肉桂精油、牛至精油、丁香精油進行進一步的MIC和MBC實驗。

2.1.310種植物精油對XFQ-3菌的抑菌效果10種植物精油對XFQ-3菌的體外熏蒸抑制效果和直接接觸抑制效果見表5和表6。結果顯示,各種精油對XFQ-3菌均有不同程度的抑制效果,且抑制率隨著精油濃度的增加而增大;此外,精油體外熏蒸效果好于直接接觸法。由表5熏蒸處理結果可知,在1 μL低濃度條件下熏蒸,抑制效果較好的精油有肉桂精油、牛至精油、香茅精油、山蒼子精油、佛手柑精油、丁香精油,抑制率均達88%以上,其次為茶樹精油,抑制率達70%以上。從表6直接接觸處理結果可知,肉桂精油、牛至精油、丁香精油具有較強的抑制作用,在精油濃度300 μL/L時,XFQ-3菌完全被抑制;其次為山蒼子精油,其抑制率達80%。

因此,綜合兩種處理方式的結果,可選擇肉桂精油、牛至精油、山蒼子精油、丁香精油繼續(xù)進行MIC和MBC的實驗。

表5　10種植物精油對XFQ-3菌的體外熏蒸處理效果

表6　10種植物精油對XFQ-3菌的直接接觸抑制效果

2.2植物精油的MIC和MBC

2.2.14種植物精油對XFQ-1菌的MIC和MBC經10種植物精油對XFQ-1菌的抑菌性評價,選用肉桂精油、牛至精油、山蒼子精油、丁香精油進行最低抑菌濃度實驗,結果見表7。肉桂精油對XFQ-1菌的抑制效果最好,在各濃度下,培養(yǎng)5 d,均未見菌生長,可完全抑菌,其最低抑菌濃度為0.05×104μL/L;山蒼子精油效果其次,在濃度大于0.1×104μL/L時,培養(yǎng)5 d,不見菌生長,由此可知,其最低抑菌濃度為0.1×104μL/L;牛至精油和丁香精油抑制效果最差,在濃度低于0.5×104μL/L培養(yǎng)5 d時,菌落能正常生長,因此,牛至精油和丁香精油的最低抑菌濃度均為0.5×104μL/L。

將完全沒有菌生長的菌餅轉接至新的PDA平板上,在27 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d,觀察其是否長菌,結果如表8。從肉桂精油平板上取下的菌餅在PDA培養(yǎng)基中均沒有長菌,由此可見,肉桂精油對XFQ-1菌有很好的殺菌效果,其最低殺菌濃度為0.05×104μL/L;從山蒼子精油和丁香精油平板上取下的菌餅在PDA培養(yǎng)基中也沒有菌生長,可見山蒼子精油和丁香精油對XFQ-1菌的最低殺菌濃度分別為0.1×104、0.5×104μL/L;濃度為0.5×104μL/L的牛至精油平板上的菌餅,轉接至新的PDA培養(yǎng)基中,4 d后長菌,因此牛至精油對XFQ-1菌的最低殺菌濃度為1.0×104μL/L。

表7　植物精油對XFQ-1菌的最低抑菌濃度

注:“+”表示長菌,“-”表示未長菌,表8～表12同。

表8　植物精油對XFQ-1菌的最低殺菌濃度

2.2.23種植物精油對XFQ-2菌的MIC和MBC經3種植物精油對XFQ-2菌的抑菌性評價,選用肉桂精油、牛至精油、丁香精油進行最低抑菌濃度實驗,結果見表9。肉桂精油對XFQ-2菌的抑制效果最好,在各濃度下,培養(yǎng)5 d,均不見菌生長,可完全抑菌,其MIC為0.05×104μL/L;牛至精油和丁香精油效果次之,在培養(yǎng)5 d時,濃度低于0.2×104μL/L的培養(yǎng)基中均有菌落生長,因此,牛至精油和丁香精油的MIC均為0.2×104μL/L。

表9　植物精油對XFQ-2菌的最低抑菌濃度

將完全沒有菌生長的菌餅轉接至新的PDA平板上,在27 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d,觀察是否長菌,結果如表10所示。從肉桂精油平板上取下的菌餅在PDA培養(yǎng)基中均未見菌生長,由此可見,肉桂精油對XFQ-2菌具有較好的殺菌效果,其MBC為0.05×104μL/L;從丁香精油平板上取下的菌餅在PDA培養(yǎng)基中也沒有菌生長,可見其MBC為0.2×104μL/L;濃度為0.2×104μL/L的牛至精油平板上的菌餅,轉接至新的PDA培養(yǎng)基中,4 d后長菌,因此牛至精油對XFQ-2菌的MBC為0.5×104μL/L。

表10　植物精油對XFQ-2菌的最低殺菌濃度

2.2.34種植物精油對XFQ-3菌的MIC和MBC經10種植物精油對XFQ-3菌的抑菌性評價,選用肉桂精油、牛至精油、山蒼子精油、丁香精油進行最低抑菌濃度實驗,結果見表11。肉桂精油對XFQ-3菌的抑制效果較好,在濃度大于0.1×104μL/L時,培養(yǎng)5 d,均沒有菌生長,其MIC為0.1×104μL/L;丁香精油效果其次,在濃度大于0.5×104μL/L時,培養(yǎng)5 d,未見菌生長,因此,其MIC為0.5×104μL/L;牛至精油對XFQ-3菌具有一定的抑制效果,在培養(yǎng)5 d時,濃度低于1.0×104μL/L的培養(yǎng)基中均有菌落生長,由此可知,牛至精油的MIC為1.0×104μL/L;山蒼子精油的抑菌效果最差,在各精油濃度下均長菌,可見其MIC大于1.0×104μL/L。

表11　植物精油對XFQ-3菌的最低抑菌濃度

將完全沒有菌生長的菌餅轉接至新的PDA平板上,在27 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d,觀察是否長菌,結果如表12所示。從肉桂精油平板上取下的菌餅在PDA培養(yǎng)基中均未見菌生長,可見肉桂精油對XFQ-3菌具有較好的殺菌效果,其MBC為0.1×104μL/L;丁香精油對XFQ-3菌具有一定的殺菌效果,當精油濃度高于0.5×104μL/L時,XFQ-3菌未生長,因此,丁香精油對XFQ-3菌的MBC為0.5×104μL/L;牛至精油和山蒼子精油對XFQ-3菌的殺菌能力較差,取出的菌餅在PDA培養(yǎng)基上均長菌,由此可知,其MBC大于1.0×104μL/L。

表12　植物精油對XFQ-3菌的最低殺菌濃度

3　結論

不同精油對圣女果3種病原真菌的抑菌殺菌效果不同,且相同精油對不同病原真菌的抑菌能力也存在差異。對于白地霉菌(XFQ-1),肉桂精油的抑菌殺菌能力最強,其MIC和MBC均為0.05×104μL/L;山蒼子精油次之,MIC和MBC均為0.1×104μL/L;牛至精油抑菌殺菌效果最差,其MIC為0.5×104μL/L,MBC為1.0×104μL/L。對于赤霉菌(XFQ-2),肉桂精油的抑菌殺菌效果最好,MIC和MBC均為0.05×104μL/L;丁香精油次之,MIC和MBC均為0.2×104μL/L;牛至精油抑菌能力和丁香精油相當,MIC為0.2×104μL/L,但殺菌能力最差,MBC為0.5×104μL/L。對于毛霉菌(XFQ-3),肉桂精油的MIC和MBC均為0.1×104μL/L,有較強的抑菌殺菌能力;丁香精油效果一般,其MIC和MBC均為0.5×104μL/L,牛至精油的抑菌能力較差,MIC為1.0×104μL/L,MBC大于1.0×104μL/L;山蒼子精油的抑菌殺菌能力最差,其MIC和MBC均大于1.0×104μL/L。

實驗得到不同精油在不同濃度下對三種病原菌的抑制效果,初步確定了不同精油對三種病原菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度,但應用到圣女果鮮果上的具體效果還有待進一步研究。

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Inhibitory effects of ten plant essential oils on three pathogens of cherry tomatoes

HE Hong-yu1,ZHU Yong-qing1,WANG Zi-peng2,LIU Pei1,ZHAN Min1,ZENG Xiao-dan1,*

(1.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;2.Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China)

The aim of the study was to investigate inhibitory effects of plant essential oil on pathogens in the cherry tomatoes . In addition,the plant essential oil that had good fresh-keeping effect was selected. In this study,the fumigation method and direct contact method were used to select the essential oils which had inhibitory effects on three pathogens of cherry tomatoes. Moreover,the minimal inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of essential oils were determined. The minimal inhibitory concentrations of cinnamon essential oil,litsea cubeba oil,clove essential oil and oregano essential oil againstGalactomycescandidumwere 0.05×104,0.1×104,0.5×104μL/L and 0.5×104μL/L respectively. The minimum bactericidal concentration were 0.05×104,0.1×104,0.5×104μL/L and 1.0×104μL/L respectively. The minimal inhibitory concentrations of cinnamon essential oil,clove essential oil and oregano essential oil againstGibberellasp. strain were 0.05×104,0.2×104μL/L and 0.2×104μL/L respectively. The minimum bactericidal concentration were 0.05×104,0.2×104μL/L and 0.5×104μL/L respectively. The minimal inhibitory concentrations of cinnamon essential oil,clove essential oil,oregano essential oil and litsea cubeba oil againstMucorfragiliswere 0.1×104,0.5×104,1.0×104μL/L and greater than 1.0×104μL/L respectively. The minimum bactericidal concentration were 0.1×104,0.5×104μL/L,greater than 1.0×104μL/L,greater than 1.0×104μL/L respectively. Cinnamon essential oil,litsea cubeba oil,clove essential oil and oregano essential oil had good inhibitory effect againstGalactomycescandidum. Cinnamon essential oil,clove essential oil and oregano essential oil had high inhibitory activity againstGibberellasp. strain. Cinnamon essential oil and clove essential oil had good inhibitory effect againstMucorfragilis,butoregano essential oil had not obvious inhibitory effect and litsea cubeba oil had little inhibitory effect againstMucorfragilis.

cherry tomato;pathogenic bacteria;essential oil;inhibitory effect;minimal inhibitory concentration;minimum bactericidal concentration

2016-02-22

賀紅宇(1987-)，女，碩士，助理研究員，主要從事果蔬保鮮與采后生理方面的研究，E-mail:hehongyu2010@163.com。

曾曉丹(1981-)，男，副研究員，主要從事果蔬貯藏保鮮與包裝方面的研究，E-mail:zxd_saas@aliyun.com。

成都市科技惠民技術研發(fā)項目(2015-HM01-00250-SF)；四川省財政創(chuàng)新能力提升工程(2014CXSF-039)；四川省財政創(chuàng)新能力提升工程(2016GXTZ-009)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)18-0153-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.021