王曉龍,馮曉梅,隋　曉,席　璇,韓玉謙,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.青島大學(xué)生物系,山東青島 266071)

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超臨界CO2萃取脂質(zhì)對(duì)南極磷蝦肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響

王曉龍1,馮曉梅1,隋曉2,席璇1,韓玉謙1,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.青島大學(xué)生物系,山東青島 266071)

通過(guò)研究南極磷蝦肌原纖維蛋白經(jīng)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后的理化性質(zhì)變化特點(diǎn)及規(guī)律,為南極磷蝦深加工提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在15～25 MPa,35～55 ℃,2 h以及15 MPa,35 ℃,1～3 h的實(shí)驗(yàn)條件下,考察了經(jīng)過(guò)萃取脂質(zhì)后的肌原纖維蛋白的巰基數(shù)量、Ca2+-ATPase活性、表面疏水性變化并結(jié)合SDS-PAGE電泳,研究超臨界CO2萃取南極磷蝦脂質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響情況。結(jié)果表明,南極磷蝦肌原纖維蛋白總巰基數(shù)量和Ca2+-ATPase活性隨溫度、壓力和時(shí)間的增加而下降;表面疏水性隨溫度、壓力和時(shí)間的增加而上升;巰基數(shù)量與Ca2+-ATPase活性的下降主要發(fā)生在0～1 h內(nèi),而表面疏水性的上升主要發(fā)生在1～2 h內(nèi);SDS-PAGE電泳圖顯示經(jīng)過(guò)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后的蛋白條帶略有變淺,說(shuō)明超臨界萃取處理會(huì)使南極磷蝦肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,產(chǎn)生新的作用鍵。經(jīng)過(guò)超臨界萃取處理后,肌原纖維蛋白巰基的氧化、二硫鍵的生成和表面疏水性的提高以及其他作用鍵的形成均有利于改善蛋白的乳化和凝膠等功能性質(zhì),這對(duì)南極磷蝦的加工及利用有重要意義。

超臨界流體萃取,南極磷蝦,肌原纖維蛋白,理化性質(zhì),影響

南極磷蝦是一種生活在南極水域的甲殼類浮游生物,其生物資源量巨大,含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分豐富。南極磷蝦含有豐富的蛋白質(zhì),是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源[1]。同時(shí),南極磷蝦的脂肪含量也很可觀,脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸含量較高,富含磷脂型EPA、DHA,具有較好的醫(yī)藥保健功能[2]。此外,南極磷蝦還含有豐富的類胡蘿卜素、蝦青素和脂溶性維生素(如維生素A、維生素E)[2-3]。近年來(lái),南極磷蝦已經(jīng)成為食品、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一[4]。

目前南極磷蝦脂質(zhì)的提取主要采用的有機(jī)溶劑中通常含有氯仿和甲醇[5],但會(huì)產(chǎn)生有機(jī)溶劑,且用量大、殘留多,導(dǎo)致蛋白變性、失去部分功能性質(zhì)[6]等問(wèn)題。近年來(lái),超臨界CO2作為一種新興的技術(shù)受到人們的重視,CO2具有無(wú)毒、廉價(jià)、易得、臨界壓力和溫度都不太高等優(yōu)點(diǎn),有利于在溫和的條件下提取脂質(zhì)。許多油脂化工反應(yīng)都可以在超臨界CO2中進(jìn)行,關(guān)于超臨界流體在脂類萃取、分級(jí)方面的研究已有詳細(xì)的報(bào)道[7-8]。目前,超臨界CO2已用于磷蝦等海洋生物的脂質(zhì)萃取,Yamaguchi[9]等人采用超臨界CO2從南極磷蝦中萃取出脂質(zhì)并進(jìn)行了分析。

肌原纖維蛋白是肌肉蛋白質(zhì)的重要組成部分,在肉制品加工過(guò)程中,雖然肌漿蛋白和基質(zhì)蛋白也對(duì)肉制品的風(fēng)味等起到一定的作用,但是肌肉中主要起作用的蛋白是肌原纖維蛋白,肌原纖維蛋白的性質(zhì)是由肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出來(lái),蛋白與蛋白、蛋白和水之間的作用形成的肌原纖維蛋白凝膠,在溶液界面是肌原纖維蛋白的性質(zhì)改變,直接影響蛋白的感官性質(zhì)(肉制品的彈性、多汁性、口感等)[10]。

肌原纖維蛋白在不同的環(huán)境和加工條件下,通常表現(xiàn)出不同的特性[11]。經(jīng)過(guò)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后的南極磷蝦肌原纖維蛋白會(huì)表現(xiàn)出一些特性,有利于在食品和工業(yè)中的進(jìn)一步利用。本文通過(guò)考察肌原纖維蛋白的巰基數(shù)量,Ca2+-ATPase活性,表面疏水性并結(jié)合SDS-PAGE電泳研究南極磷蝦肌原纖維蛋白經(jīng)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后的變化特點(diǎn)及規(guī)律,為南極磷蝦加工及利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南極磷蝦肉由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所提供,冷凍運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,-20 ℃冰箱保存,實(shí)驗(yàn)前解凍粉碎;正己烷、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、馬來(lái)酸、氯化鈉、三氯乙酸、鹽酸購(gòu)于國(guó)藥;尿素、乙二胺四乙酸(EDTA)、三磷酸腺苷二鈉、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)等試劑來(lái)自索萊寶,均為分析純。

SFE121-50-02超臨界萃取裝置江蘇南通華興石油儀器有限公司;粉碎機(jī)上海梅香儀器有限公司;乳化分散均質(zhì)機(jī)IKA T18 basic;JY-SCZ2+型雙垂直電泳槽北京六一生物科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;紫外分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司;F-4600熒光光譜儀Hitachi。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超臨界CO2萃取南極磷蝦脂質(zhì)20 g南極磷蝦肉放入到1 L的萃取釜中,萃取釜采用不銹鋼材質(zhì),溫度控制采用循環(huán)水浴,壓力由高壓泵打壓、調(diào)節(jié)閥控制,采用15～25 MPa的壓力,35～55 ℃的溫度,時(shí)間2 h以及15 MPa,35 ℃,1～3 h對(duì)南極磷蝦肉進(jìn)行萃取,用正己烷進(jìn)行收集,將油水混合物分層,取有機(jī)層40 ℃旋蒸得到南極磷蝦脂質(zhì)。經(jīng)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后的樣品存放在-80 ℃的冰箱中,待分析。

1.2.2南極磷蝦肌原纖維蛋白的提取肌原纖維蛋白的提取參考文獻(xiàn)[12],并稍作修改。取5 g處理后的南極磷蝦肉,加入40 mL pH7.0的Tris馬來(lái)酸緩沖液,均質(zhì)1 min,靜置1 h,4 ℃下6000×g離心10 min,重復(fù)三次。然后將8倍體積的含0.6 mol/L 氯化鈉的pH7.0的Tris馬來(lái)酸緩沖液加入到沉淀中,均質(zhì)1 min后放入到4 ℃冰箱靜置1 h,6000×g離心20 min,取上清液作為肌原纖維蛋白溶液。采用雙縮脲法對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定,用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的測(cè)定巰基數(shù)量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13-14],并稍作修改。肌原纖維蛋白溶液濃度調(diào)至2 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液,加入4.5 mL 0.2 mol Tris-HCI緩沖液(含8 mol/L尿素,2% SDS,10 mmol/L EDTA,pH6.8),取4 mL混合液,加入0.5 mL 0.1% DTNB-Tris-HCI緩沖液,40 ℃反應(yīng)20 min,在412 nm下測(cè)定吸光度。

巰基數(shù)量(mol/10000 g)=AD/BC

式中,A為吸光度,B為蛋白濃度mg/mL,C為分子吸光系數(shù),C=13600 L/mol·cm,D為稀釋倍數(shù),蛋白濃度為2 mg/mL。

1.2.4肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的測(cè)定Ca2+-ATPase活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13],并稍作修改。肌原纖維蛋白溶液調(diào)至2 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液,依次加入0.25 mL pH7.0的Tris馬來(lái)酸緩沖液、025 mL 0.1 mol/L CaCI2溶液,3.75 mL去離子水,0.25 mL 20 mmol/L ATP溶液,25 ℃反應(yīng)3 min,加入2.5 mL 15% TCA終止反應(yīng),反應(yīng)液6000 r/min離心5 min,取上清液采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定無(wú)機(jī)磷的含量。

Ca2+-ATPase活性(μmol Pi/mg·min)=m/t·M

式中,m為生成的無(wú)機(jī)磷含量(μmol),t為反應(yīng)時(shí)間(min),M表示肌原纖維蛋白的含量。

1.2.5肌原纖維蛋白表面疏水性的測(cè)定表面疏水性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[15],并稍作修改。蛋白溶液分別稀釋到0.125、0.25、0.5、1 mg/mL,分別取2 mL,加入10 μL含8 mmol/L ANS的pH7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液,暗反應(yīng)10 min,在激發(fā)波長(zhǎng)390,發(fā)射波長(zhǎng)470,狹縫5 nm的條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度,表面疏水性S0以熒光強(qiáng)度與蛋白濃度對(duì)應(yīng)曲線的斜率表示。

1.2.6肌原纖維蛋白SDS-PAGE的研究SDS-PAGE參考文獻(xiàn)[16],并稍作修改。肌原纖維蛋白溶液濃度調(diào)至4 mg/mL,采用濃縮膠濃度5%,分離膠濃度12%,上樣量為10 μL。電壓80 V,待染料前端跑到分離膠時(shí),加大電壓到120 V,直至電泳完成,電泳后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色,經(jīng)脫色后,進(jìn)行凝膠成像。

1.2.7數(shù)據(jù)處理每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次,采用平均值。使用SPSS19.0軟件(IBM公司,USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(Turkey HSD),對(duì)于每個(gè)參數(shù),計(jì)算其在95%的置信區(qū)間內(nèi)的顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1超臨界CO2萃取對(duì)肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的影響

萃取溫度和壓力對(duì)肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的影響如圖1,未經(jīng)超臨界萃取處理的樣品肌原纖維蛋白巰基數(shù)量為2.05×10-5mol/g。經(jīng)過(guò)萃取處理的樣品巰基數(shù)量隨溫度和壓力的升高而下降,在25 MPa、55 ℃達(dá)到最小值1.11×10-5mol/g,而在15 MPa、35 ℃的條件下具有最大值1.69×10-5mol/g。巰基數(shù)量的下降可能是由于肌原纖維蛋白在超臨界萃取脂質(zhì)過(guò)程中巰基基團(tuán)暴露,氧化聚集,形成了二硫鍵[17],隨著溫度和壓力的升高,蛋白進(jìn)一步發(fā)生了變性和展開(kāi),從而使巰基數(shù)量不斷下降。經(jīng)過(guò)處理的樣品巰基數(shù)量在15 MPa、35 ℃時(shí)具有最大值,說(shuō)明此條件下超臨界CO2對(duì)樣品肌原纖維蛋白的影響最小,因此研究萃取時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的影響選擇在15 MPa、35 ℃、1～3 h的條件下進(jìn)行。

圖1　萃取溫度和壓力對(duì)肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的影響Fig.1　Effect of temperature and pressure on sulphydryl content of myofibrillar proteins注:定義25 ℃時(shí)樣品的巰基數(shù)量為未處理樣品的巰基數(shù)量；圖3、5同。

萃取時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的影響如圖2,肌原纖維蛋白巰基數(shù)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),與未處理樣品相比,處理1、2、3 h的樣品巰基數(shù)量分別下降了13.7%,17.6%,20.5%。根據(jù)兩點(diǎn)之間的斜率進(jìn)行比較,可以發(fā)現(xiàn)巰基數(shù)量的下降主要發(fā)生在萃取過(guò)程的1 h內(nèi),說(shuō)明蛋白結(jié)構(gòu)的變化主要發(fā)生在萃取過(guò)程的開(kāi)始階段,從而使得巰基數(shù)量下降。這可能是由于在超臨界萃取過(guò)程中的1 h內(nèi)脂質(zhì)提取的量較高,大量的脂肪被除去,超臨界CO2與肌原纖維蛋白的接觸面積增大,CO2對(duì)蛋白的作用增強(qiáng),使得肌原纖維蛋白的大部分巰基暴露,更容易被氧化,從而導(dǎo)致巰基數(shù)量主要下降發(fā)生在萃取的1 h內(nèi)。

圖2　萃取時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白巰基數(shù)量的影響Fig.2　Effect of time on sulphydryl content of myofibrillar proteins注:相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(p>0.05),不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)；圖4、6同。

巰基氧化、巰基/二硫鍵交換等反應(yīng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵將對(duì)食品的功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。一方面,吸附于空氣-水界面或油-水界面的蛋白質(zhì)所形成的二硫鍵交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)于穩(wěn)定乳狀液和氣泡具有重要作用[18],乳液界面蛋白質(zhì)形成的分子間二硫鍵,增強(qiáng)吸附蛋白質(zhì)的表面粘彈性,增大乳液粘度[19]。另一方面,在凝膠結(jié)構(gòu)中蛋白分子間二硫鍵交聯(lián)具有增強(qiáng)凝膠彈性和強(qiáng)度的作用,肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白含有豐富的巰基,經(jīng)氧化劑誘導(dǎo)形成二硫鍵交聯(lián)增強(qiáng)了肉制品的凝膠性[20]。因此,巰基氧化,二硫鍵的生成有利于肌原纖維蛋白乳化性質(zhì)和凝膠性質(zhì)的提高。

2.2超臨界CO2萃取對(duì)肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

超臨界CO2萃取脂質(zhì)對(duì)肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響如圖3和圖4。未經(jīng)超臨界萃取處理的樣品Ca2+-ATPase活性為0.25 μmol Pi/mg·min,隨著溫度和壓力的升高,Ca2+-ATPase活性也呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì),與巰基數(shù)量相似,并在25 MPa,55 ℃的條件下達(dá)到最小值0.06 μmol Pi/mg·min,這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)氧化和巰基數(shù)量的下降與Ca2+-ATPase活性的喪失密切相關(guān)[21]。

圖3　萃取溫度和壓力對(duì)肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.3　Effect of temperatue and pressure on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins

圖4　萃取時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4　Effect of time on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins

Ca2+-ATPase活性是一個(gè)表征肌凝蛋白完整性的良好指標(biāo)[22],因?yàn)榧∧鞍椎那驙铑^部具有Ca2+-ATPase活性。Ca2+-ATPase活性是肌球蛋白的最主要特性,反映肌球蛋白的生化活性,與肌球蛋白的生物功能、凝膠形成有一定的關(guān)系。Ca2+-ATPase活性的下降可能是由于肌凝蛋白的球狀頭部構(gòu)象變化,發(fā)生聚合,以及蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用產(chǎn)生了重排[13]。位于肌凝蛋白頭部的巰基(SH1、SH2)對(duì)Ca2+-ATPase活性具有重要作用[23],這部分巰基的氧化會(huì)導(dǎo)致Ca2+-ATPase活性的下降。超臨界萃取脂質(zhì)過(guò)程中隨著溫度和壓力的升高,Ca2+-ATPase活性下降,說(shuō)明蛋白質(zhì)的頭部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,巰基暴露氧化,形成了二硫鍵,有利于改善蛋白質(zhì)的乳化和凝膠等功能性質(zhì)。

隨著時(shí)間的延長(zhǎng),肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性顯著下降,與未處理樣品相比,在經(jīng)過(guò)萃取1、2、3 h后分別下降了36%、44%、52%,與巰基數(shù)量受萃取時(shí)間影響類似,Ca2+-ATPase活性的下降主要發(fā)生在1 h內(nèi)。在本實(shí)驗(yàn)的條件范圍內(nèi),Ca2+-ATPase活性下降最大發(fā)生在25 MPa、55 ℃時(shí),此時(shí)相比未處理樣品,肌原纖維蛋白巰基數(shù)量下降了76%,這說(shuō)明經(jīng)過(guò)超臨界萃取處理后的肌凝蛋白大部分構(gòu)象發(fā)生了變化,但仍有部分保持一定的結(jié)構(gòu)和活性。肌凝蛋白對(duì)凝膠的形成具有重要作用,經(jīng)過(guò)超臨界萃取處理后Ca2+-ATPase活性下降,巰基氧化,生成了二硫鍵,可能會(huì)使其乳化和凝膠等功能性質(zhì)得到提高。

2.3超臨界CO2萃取對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖5　萃取溫度和壓力對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.5　Effect of temperature and pressure on surface hydrophobicity of myofibrillar proteins

ANS是一種有效的熒光探針,用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化[24]。萃取溫度和壓力對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖5,未經(jīng)超臨界萃取處理的樣品表面疏水性為62.39,隨著溫度和壓力的升高,肌原纖維蛋白的表面疏水性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),在25 MPa、55 ℃時(shí)表面疏水性達(dá)到最大值69.13。表面疏水性的增加說(shuō)明肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象在超臨界萃取脂質(zhì)過(guò)程中發(fā)生變化,導(dǎo)致疏水基團(tuán)變得更加暴露,結(jié)合了ANS[25]。Temelli[26]等人研究了超臨界CO2萃取大西洋鯖魚(yú)脂質(zhì)后蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的變化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后蛋白的系水能力有所增強(qiáng),說(shuō)明萃取脂質(zhì)使得蛋白質(zhì)表面結(jié)合部位發(fā)生變化,從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的疏水性。

萃取時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖6,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白的表面疏水性升高,不同于巰基數(shù)量與Ca2+-ATPase活性,表面疏水性在1～2 h內(nèi)增加最多,這可能是由于1～2 h內(nèi)脂質(zhì)提取率最高,較高脂肪的去除量使蛋白表面結(jié)合部分發(fā)生較大的變化,從而使蛋白疏水性增加最多。

圖6　萃取時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.6　Effect of time on surfacehydrophobicity of myofibrillar proteins

疏水作用的增加,說(shuō)明了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化使疏水基團(tuán)出現(xiàn)在分子的表面,形成了疏水相互作用,減少了自由能,疏水作用參與了膠凝過(guò)程[27],并且疏水基團(tuán)在膠凝過(guò)程中起很重要的作用[28]。因此表面疏水性的增加有利于蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)的改善和提高。Smaeijma等則發(fā)現(xiàn)在肌球蛋白膠凝過(guò)程中,頭部的聚集與疏基有關(guān),而尾部的聚集主要是非共價(jià)鍵如氫鍵、疏水相互作用在起作用[29]。

2.4超臨界CO2萃取對(duì)肌原纖維蛋白SDS-PAGE影響

SDS-PAGE圖像顯示南極磷蝦肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈組成,各個(gè)蛋白的分子量大約分別為220、43、37、35、17～20 ku。隨著溫度和壓力的升高,肌原纖維各蛋白條帶逐漸變淺,可能是由于肌原纖維蛋白在脂質(zhì)萃取過(guò)程中受到超臨界CO2的影響,形成新的疏水鍵、氫鍵、二硫鍵,小分子量的蛋白發(fā)生聚集,形成了大分子量的蛋白。Temelli[26]在研究超臨界CO2萃取大西洋鯖魚(yú)脂質(zhì)后各分子量蛋白變化時(shí),發(fā)現(xiàn)分子量<100 ku的蛋白含量均有減少,>100 ku蛋白含量有所上升,其中以220 ku上升為主。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),肌原纖維蛋白的條帶略有變淺,這是因?yàn)榧≡w維蛋白在脂質(zhì)萃取過(guò)程中受到超臨界CO2的影響,發(fā)生了部分變性。本實(shí)驗(yàn)中肌原纖維各小分子蛋白條帶隨溫度和壓力的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)略有變淺,這與上述的研究結(jié)果一致,但未見(jiàn)高分子量蛋白條帶的形成,這可能是由于形成的高分子量蛋白較少,在電泳條帶中不明顯。經(jīng)過(guò)萃取處理后新形成的一些鍵對(duì)凝膠的形成具有重要的作用,氫鍵在水凝膠穩(wěn)定結(jié)合水方面發(fā)揮重要作用,蛋白分子表面極性氨基酸基團(tuán)的暴露,造成大量的水分子與其進(jìn)行鍵合。二硫鍵是巰基氧化形成的,有利于穩(wěn)定乳液和增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度,而疏水相互作用力則是一個(gè)熱動(dòng)力學(xué)事件,主要由于蛋白變性造成疏水位點(diǎn)暴露引起[30],疏水作用的增強(qiáng)有利于蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)的改善和提高。

圖7　15 MPa下不同時(shí)間和溫度的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳Fig.7　SDS-PAGE analysis of myofibrillar proteinsunder different time and temperatures of 15 MPa注:1,6為Marker;2,7為未處理樣品;3～5分別為15 MPa,35 ℃,1、2、3 h處理下的蛋白條帶,8～10分別為15 MPa,2 h,35、45、55 ℃處理下的蛋白條帶。

圖8　20 MPa和25 MPa 下不同溫度的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳Fig.8　SDS-PAGE analysis of myofibrillar proteinsunder different temperatures of 20 and 25 MPa注:1,6為Marker;2,7為未處理樣品;3～5分別為20 MPa,2 h,35、45、55 ℃處理下的蛋白條帶;8～10分別為25 MPa,2 h,35、45、55 ℃處理下的蛋白條帶。

Ai-Nehari[31]研究南極磷蝦經(jīng)超臨界CO2萃取脂質(zhì)后消化酶電泳條帶的變化后發(fā)現(xiàn),未經(jīng)處理的樣品蛋白條帶與超臨界CO2萃取脂質(zhì)后的蛋白條帶基本一致,認(rèn)為超臨界萃取脂質(zhì)過(guò)程中蛋白沒(méi)有變性。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有所不同,本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)超臨界萃取處理后的蛋白條帶雖與原樣相比基本一致,但略有變淺,造成這種不同的原因可能是由于本實(shí)驗(yàn)采用的原料是新鮮的南極磷蝦,水分含量高于上述研究采用的干燥的磷蝦,大量水分的存在可能會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生更大的變化。蛋白條帶的變淺說(shuō)明蛋白在超臨界萃取過(guò)程中發(fā)生了部分變性,超臨界萃取處理會(huì)使南極磷蝦肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,生成新的疏水鍵、氫鍵、二硫鍵,從而提高蛋白的乳化和凝膠等功能性質(zhì),這對(duì)南極磷蝦的加工及利用有重要意義。

3　結(jié)論

本文通過(guò)研究超臨界萃取脂質(zhì)后南極磷蝦肌原纖維理化性質(zhì)的變化,為南極磷蝦加工利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)超臨界萃取脂質(zhì)處理后,南極磷蝦蛋白的巰基數(shù)量和Ca2+-ATPase活性均有所下降,在25 MPa、55 ℃達(dá)到最小值。表面疏水性有所升高,也在25 MPa、55 ℃達(dá)到最大值。巰基數(shù)量和與Ca2+-ATPase活性的下降主要發(fā)生在0～1 h內(nèi),而表面疏水性的上升主要發(fā)生在1～2 h內(nèi)。SDS-PAGE電泳圖顯示超臨界萃取脂質(zhì)后的蛋白條帶有所變淺,說(shuō)明超臨界萃取會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,產(chǎn)生新的作用鍵。巰基氧化、二硫鍵的生成,表面疏水性的升高以及其他作用鍵的形成有利于改善蛋白的乳化和凝膠性質(zhì),說(shuō)明經(jīng)過(guò)超臨界萃取處理后的南極磷蝦肌原纖維蛋白乳化和凝膠等功能性質(zhì)會(huì)得到改善,有利于南極磷蝦的進(jìn)一步加工和利用。

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Effect of supercritical CO2extraction of oil on physicochemical properties of myofibrillar proteins inEuphausiaSuperba

WANG Xiao-long1,FENG Xiao-mei1,SUI Xiao2,XI Xuan1,HAN Yu-qian1,*

(1.Food Department,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Biology Department of Qingdao University,Qingdao 266071,China)

Physicochemical properties of myofibrillar proteins inEuphausiaSuperbawas investigated following extraction of oil with supercritical CO2in order to provide basic information for food process. The lipids ofEuphausiaSuperbawas extracted at 15～25 MPa,35～55 ℃,2 h and 15 MPa,35 ℃,1～3 h. Sulphydryl content,Ca2+-ATPase activity,surface hydrophobicity and SDS-PAGE pattern were measured after extraction to study the changes in myofibrillar proteins . Total sulphydryl content and Ca2+-ATPase activity decreased with pressure,temperature and time while surface hydrophobicity increased after extraction. The changes in total sulphydryl content and Ca2+-ATPase activity mainly occurred during the first hour,however,surface hydrophobicity increased most at 1～2 h. SDS-PAGE pattern showed there were slight changes in protein bands,which indicated the structure of myofibrillar proteins varied after supercritical CO2extraction,thus some new bonds formed. After supercritical CO2extraction,the oxidized sulphydryl groups,formed disulfide bonds,increase in surface hydrophobicity and formation of some new bonds all improved the emulsifying and gel properties of proteins,which was very important to the application of theEuphausiaSuperba.

supercritical fluids extraction;EuphausiaSuperba;myofibrillar proteins;physicochemical properties;effect

2016-03-08

王曉龍(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品質(zhì)量與安全控制,E-mail:wangxiaolong0109@163.com。

韓玉謙(1962-),男,教授,研究方向:超/亞臨界流體萃取技術(shù)的應(yīng)用,E-mail:hanyuqian@ouc.edu.cn。

TS254.4

A

1002-0306(2016)18-0116-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.014