楊鷺生，李國平

（1.武夷學(xué)院教務(wù)處，福建武夷山354300；2.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

用BTB快速鑒定黃連木雌雄株方法初探

楊鷺生1，李國平2

（1.武夷學(xué)院教務(wù)處，福建武夷山354300；2.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

用溴麝香草酚蘭（BTB）的方法，對(duì)黃連木雌雄株進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明，黃連木雌株提取液在加入溴麝香草酚蘭（BTB）溶液3 h后，溶液顏色由黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚壑晏崛∫旱念伾€是保持原來的黃綠色，隨著時(shí)間的增加，雌株提取液褐變加深，雄株無明顯變化。說明用BTB溶液鑒定黃連木雌雄株，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，認(rèn)為可用此方法對(duì)黃連木幼苗的性別進(jìn)行初步鑒定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連木幼苗雌雄株的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。

黃連木；BTB溶液；顏色變化；性別鑒定

黃連木（Pistacia chinesis）為漆樹科植物，原產(chǎn)中國，生態(tài)適應(yīng)性極強(qiáng)，分布非常廣，是重要的荒山、荒灘造林樹種，是優(yōu)質(zhì)的用材樹種；同時(shí)黃連木葉繁茂而秀麗，樹冠開闊，秋天葉子顏色變成深紅色或橙黃色，故也是一種重要的木本觀葉植物。黃連木是雌雄異株植物，其種子富含油脂，含油量達(dá)40%左右，用種子油脂生產(chǎn)的生物柴油碳鏈長度集中在（C17～C19）之間，與普通柴油接近［1］，是一種極具開發(fā)前景的木本生物質(zhì)能源樹種。黃連木生產(chǎn)上主要以果實(shí)和種子為收獲對(duì)象，雄株只能作為授粉樹，栽培的經(jīng)濟(jì)效益較低，黃連木造林中更需要大量的雌株，因此對(duì)黃連木苗木的性別鑒定尤其是早期鑒定顯得尤為重要，對(duì)科學(xué)搭配雌雄株比例、提高栽培效益具有重要意義。

植物性別鑒定的研究，概括為形態(tài)學(xué)、生理生化、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等幾個(gè)方面［2-3］。形態(tài)學(xué)比較簡(jiǎn)單易行，但多數(shù)雌雄異株植物在幼苗期未表現(xiàn)出外部形態(tài)差異；細(xì)胞學(xué)是進(jìn)行雌雄株性別鑒定的重要方法之一，分子生物學(xué)技術(shù)是最近幾年來發(fā)展起來的鑒定植物雌雄株性別的新技術(shù)、新方法，具有相對(duì)準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高。理生化指標(biāo)用于雌雄株幼苗的鑒定，相對(duì)于形態(tài)學(xué)鑒定較為復(fù)雜，但結(jié)果較為可靠，不失為一種切實(shí)可行的雌雄株性別鑒定方法。許多研究結(jié)果表明，植物外部性狀的表現(xiàn)是體內(nèi)生理生化代謝的結(jié)果，依據(jù)個(gè)體在生理生化代謝上的某些差異可以達(dá)到早期鑒別性別的目的［4-6］。

溴麝香草酚藍(lán)（BTB）是一種酸堿指示劑。張雪明、龍程等人用溴麝香草酚藍(lán)法（簡(jiǎn)稱BTB法）成功地對(duì)黃瓜、楊梅、銀杏和石刁柏的雌、雄性別差異進(jìn)行了鑒別研究［7-10］。BTB的變色范圍為pH=6.0～7.6，酸性呈黃色，堿性呈藍(lán)色，中間經(jīng)過綠色，通過顏色的不同變化，鑒定出雌雄株。本研究通過提取出黃連木幼葉、花蕾、樹皮中浸提物，加入BTB溶液后根據(jù)顏色變化不同，確定其雌雄株?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

1　材料與方法

1.1材料

材料為黃連木的幼葉、花蕾、樹皮。黃連木的雄株從莆田市仙游縣黃尾鎮(zhèn)石井村取得，黃連木雌株從莆田市秀嶼區(qū)東莊石碼村取得。材料采集后立即放進(jìn)裝冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室置4℃冰箱中保存。

試劑為0.1%mol/L BTB，0.2 mol/L磷酸二氫鈉，0.2mol/L磷酸氫二鈉，9.5%氨水，0.1 mol/L鹽酸。

1.2主要設(shè)備及儀器

TDL5臺(tái)式離心機(jī)（上海上榮生化儀器廠），HH-4水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠），722型分光光度計(jì)（北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司），pH計(jì)，電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（有限公司）等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

選取生長健壯的雌雄植株的葉、花蕾、樹皮各0.2 g，用流水沖洗后吸干水分，加4 mL 0.1mol/L pH為6.2的磷酸緩沖液，在冰浴中研磨，研磨要快速，防止褐變，研磨好后快速裝進(jìn)離心管中，蓋好，在室溫下浸提1 h，然后把提取液置于4 000 r/min的離心機(jī)中離心5 min，取上清液3 mL，加BTB溶液4～5滴，搖勻，置于30℃恒溫水浴鍋中保溫，每隔1 h記錄提取液的顏色變化，然后用722型分光光度計(jì)分別測(cè)定提取液在450、550、650 nm處的吸光值。

2　結(jié)果和分析

黃連木各部分提取液在加BTB后顏色變化情況見表1。黃連木的花蕾提取液滴入BTB溶液后顏色均變?yōu)辄S綠色。隨著時(shí)間的推移，黃連木雄株提取液逐漸由黃綠色變成淡黃色到黃色，雌株提取液的顏色黃綠色，2 h后開始出現(xiàn)褐變，3 h后完全變成褐色。

表1　黃連木各種提取液的顏色變化

黃連木的幼葉跟花蕾的提取液變化相似，滴入BTB溶液后顏色均變?yōu)辄S綠色。隨著時(shí)間的延長，黃連木雄株提取液逐漸由黃綠色—淡黃色—黃色的變化，雌株提取液的顏色黃綠色，2 h后開始出現(xiàn)褐變，3 h后完全變成褐色，實(shí)驗(yàn)過程明顯看到雌雄株顏色變化的差異。

黃連木的樹皮跟幼葉有所不同，滴入BTB溶液后顏色均變?yōu)辄S綠色。隨著時(shí)間的推移，黃連木雄株提取液的顏色逐漸變?yōu)辄S綠色—淡黃色—淡黃褐色，黃連木雌株提取液為黃綠色，2 h后開始出現(xiàn)褐變，3 h后完全變成褐色。6 h后，雌株提取液的顏色變化不明顯，雄株提取液呈淡黃褐色。

由圖1可以看出，黃連木雌雄株花蕾提取液隨著時(shí)間的增加吸光值都增大。雌株提取液在450 nm的的吸光值急劇增大，而雄株提取液的吸光值緩慢增加。雌株提取液吸光值的增加幅度大，雄株提取液增加梯度小，從雌雄提取液吸光度差異也顯示了彼此之間的不同。

圖1　黃連木雌雄株花蕾提取液吸光值的變化

從圖2得知，黃連木幼葉跟花蕾相似，黃連木雌株提取液在5～6 h的時(shí)波長為550 nm的吸光值增加幅度最大。雄株提取液的吸光值變化幅度非常小，這也可以做為鑒定雌雄株的一個(gè)參考。

圖2　黃連木雌雄株幼葉提取液吸光值的變化

從圖3可知，黃連木雌雄株樹皮的提取液跟幼葉、花蕾有所區(qū)別。雌株樹皮提取液在1～4 h波長為450 nm時(shí)增加幅度大，而后緩慢增加。

圖3　黃連木雌雄株樹皮提取液吸光值變化

根據(jù)圖1～3的曲線圖可知，黃連木雌雄株提取液隨著時(shí)間的增加吸光值都增大。剛開始時(shí)，吸光值差距不大，隨的時(shí)間的推移，差距變大。而黃連木的花蕾和樹皮的吸光值差距較大。黃連木提取液在波長550、650 nm時(shí)吸光值變化幅度非常小，而在波長450 nm時(shí)，雌雄株提取液的吸光值變化大。

3　結(jié)論

黃連木雌雄株提取液加入BTB溶液后，1～2 h顏色變化相似。3 h開始出現(xiàn)明顯變化，黃連木雌株提取液由淡黃色變褐色，隨著時(shí)間的增加而加深，雄株提取液由淡黃色變黃色，隨的時(shí)間增加但顏色變化不明顯，依舊是黃色。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在黃連木人工造林時(shí)，可以用BTB的方法測(cè)定幼苗各種提取液顏色變化以確定其雌雄，以便合理搭配人工黃連木林的雌雄株比例。

黃連木提取液在波長550、650 nm時(shí)吸光值變化幅度非常小，不利于雌雄株的對(duì)比，而在波長450 nm時(shí)，雌雄株提取液的吸光值變化大，且雌雄株提取液的吸光值不同，黃連木雌株提取液的吸光值都比雄株提取液大，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為黃連木幼苗雌雄株鑒別的參考。

用BTB法鑒定黃連木雌雄株，此方法較為快速、簡(jiǎn)單且有效，在生產(chǎn)中容易掌握，為黃連木幼苗的性別初步鑒定提供了依據(jù)，但這種方法并不能從遺傳上揭示雌雄株的差異，所以，此方法只能作為黃連木幼苗雌雄株鑒定的一種輔助手段，其可靠性有待在生產(chǎn)實(shí)際中進(jìn)一步觀察。

［1］段劼，陳婧，馬履一，等.木本油料樹種中國黃連木研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，17（6）：171-177.

［2］李瑞麗，盧龍斗，高武軍，等.雌雄異株植物性別鑒定的研究進(jìn)展［J］.廣西植物，2006，26（4）：387-391.

［3］尹立輝，詹亞光，李彩華，等.植物雌雄株性別鑒定研究方法的評(píng)價(jià)［J］.植物研究，2003，23（1）：123-128.

［4］張淑蘭，王華慶.銀杏性別的早期鑒定［J］.生物學(xué)雜志，1994，58（2）：25.

［5］許良政.銀杏雌雄株性別早期鑒別［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，1996（4）：16.

［6］陳學(xué)好.黃瓜花性別分化的生理學(xué)研究［D］.揚(yáng)州：江蘇農(nóng)學(xué)院，2001.

［7］龍程，潘瑞熾.用溴麝香草酚藍(lán)鑒定石刁柏雌雄株［J］.植物生理學(xué)通訊，1991，27（3）：204-205.

［8］張雪明.利用溴麝香草酚藍(lán)鑒定楊梅和銀杏的雌雄性別［M］.武漢：中國植物生理學(xué)會(huì)第五次全國會(huì)議論文摘要，1990：228-229.

［9］龍程，潘瑞熾.影響溴麝香草酚藍(lán)法鑒定石刁柏性別的幾種因子［J］.植物生理學(xué)通訊，1992，28（2）：439-441.

［10］陳學(xué)好，陳艷萍，曹碚生，等.黃瓜雌雄株性別苗期化學(xué)鑒別方法［J］.中國蔬菜，2002，（4）：4-6.

（責(zé)任編輯：華偉平）

Preliminary Study on the Rapid Sex Identification of Pistacia Chinesis Female and Male Plants by Bromothymol Blue

YANG Lusheng1，LIGuoping2
（1.Office of Teaching Affairs，Wuyi University，Wuyishan，F(xiàn)ujian 354300；2.College of Ecology and Resource Engineering，WuyiUniversity，Wuyishan，F(xiàn)ujian 354300）

The identification of male and female plants of Pistacia chinensis was investigated by using bromothymol blue（BTB）method.Results showed that the solution color of extracts from female plants turned from kelly into brown 3 h after added in BTB solution，while the the solution color from male plants had no significant changes，maintaining the original yellow-green.As time increased，the solution color of female plants enhanced，while the the solution color ofmale plants had no changes.It was believed that the BTB staining method could be used to preliminary identify themale and female plants of Pistacia chinesis.The researchmight provide a scientific basis for the sex identification of Pistacia chinesis.

Pistacia chinesis；BTB solution；color change；sex identification

Q945.4

A文章標(biāo)號(hào)：1674-2109（2016）06-0007-03

2015-01-01

福建省科技廳戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)項(xiàng)目（2014N0030）；福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2013N2009）；福建省林業(yè)廳科學(xué)研究項(xiàng)目（閩林科［2013］5號(hào)）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201410397006）；福建省科技廳項(xiàng)目（2016S0059）。

楊鷺生（1964-），女，漢族，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物生物技術(shù)研究。