沙聰 楊峻峰 胡偉 周東智

江蘇南通瑞慈醫(yī)院普外科 南通 226000

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EZH2在乳腺癌中的表達(dá)及與患者臨床病例特征關(guān)系

沙聰 楊峻峰 胡偉 周東智

江蘇南通瑞慈醫(yī)院普外科 南通 226000

目的 探討組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在人乳腺癌組織中的表達(dá)及與患者臨床病例特征和預(yù)后的關(guān)系。方法 選取2011-01-2015-02間南通瑞慈醫(yī)院普外科手術(shù)治療的乳腺癌患者88例和同期手術(shù)切除的良性乳腺病變24例患者為研究對(duì)象。采用免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌組織和良性病變組織中EZH2蛋白的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理學(xué)特征及生存期關(guān)系。結(jié)果 EZH2主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞核呈棕黃色顆粒。乳腺癌組織中EZH2陽性表達(dá)率為56.8%(50/88)，良性病變中表達(dá)率為20.8%(5/24)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌患者EZH2陽性表達(dá)與腫瘤大小(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)有關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，EZH2陽性和陰性乳腺癌患者3 a無疾病進(jìn)展生存率分別68.5%和84.1%，陰性患者高于陽性患者(P<0.05)。結(jié)論 EZH2在乳腺癌中表達(dá)高于乳腺良性病變組織，且陽性表達(dá)乳腺癌患者預(yù)后較差。

EZH2；乳腺癌；免疫組化；臨床病理特征；生存期

EZH2基因定位于人7染色體3帶5區(qū)，為多梳蛋白復(fù)合體PcG (Polycomb group)家族重要成員之一[1]。分子生物學(xué)研究顯示，EZH2蛋白是組蛋白甲基化重要的工具酶，能夠催化H3K27(組蛋白H3賴氨酸27位)甲基化，促進(jìn)多個(gè)癌基因的表達(dá)[2]。EZH2在肺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]和胃癌等多種實(shí)體腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)并與患者預(yù)后存在一定的關(guān)系。我們通過免疫組織化學(xué)方法檢測乳腺癌組織和乳腺良性病變組織中EZH2的表達(dá)，探討其在乳腺癌發(fā)生中的作用及與患者預(yù)后和臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011-01—2015-02間我科手術(shù)治療的乳腺癌患者88例和同期手術(shù)切除的良性病變24例作為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)確診為乳腺癌或良性乳腺病變者。術(shù)前未接受過新輔助放化療及生物治療。有完整的術(shù)后隨訪時(shí)間及生存時(shí)間數(shù)據(jù)。組織標(biāo)本獲取經(jīng)家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過放化療或生物治療者。合并其他惡性腫瘤者。術(shù)后無隨訪數(shù)據(jù)者。乳腺癌患者中位年齡51歲(26～79歲)，良性乳腺病變患者中位年齡38歲(22～76歲)，本組患者全部為女性。

1.2 EZH2蛋白表達(dá)檢測方法 將組織標(biāo)本切成5um左右的石蠟切片，然后對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化，置于二甲苯中浸泡10 min，無水乙醇浸泡5 min，然后將切片置于3% H2O2中，避光孵育15 min，進(jìn)行滅活內(nèi)源性過氧化物酶。然后進(jìn)行組織抗原修復(fù)，將切片放入加有0.01% mol/L枸櫞酸鈉的水浴鍋中至95 ℃，15 min。用100 μl 含10%的正常血清將滴在組織處，孵育1 h進(jìn)行封閉。加入一抗，4℃ 孵育過夜。然后加入二抗，室溫孵育1 h。然后對(duì)切片進(jìn)行顯色。封片，干燥后顯微鏡先觀察拍照，觀察表達(dá)水平。

1.3 陽性結(jié)果判定[5]每張切片選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)及EZH2陽性的細(xì)胞數(shù)。染色強(qiáng)強(qiáng)度：不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細(xì)胞所占的百分比：無著色為0分，陽性細(xì)胞上<25%為1分，陽性 25%～50%為2分，陽性細(xì)胞上>50%為3分，兩種積分相乘，>3分為陽性。

1.4 隨訪 患者通過定期住院、門診復(fù)查或電話方式進(jìn)行隨訪，將手術(shù)結(jié)束日期作為隨訪開始時(shí)間。隨訪結(jié)束時(shí)間為2015年2月。隨訪期間記錄患者疾病進(jìn)展或死亡事件發(fā)生的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件完成，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher精確檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier風(fēng)險(xiǎn)比例模型Log-rank 檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2在乳腺癌及良性乳腺組織中的表達(dá) EZH2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)。乳腺癌組織中EZH2陽性表達(dá)率為56.8%(50/88)，良性病變中表達(dá)率為20.8%(5/24)，兩者比較P<0.05。

(A:陰性；B:弱陽性；C：中度表達(dá)；D：強(qiáng)陽性)

2.2 EZH2表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征關(guān)系 乳腺癌患者EZH2陽性表達(dá)與腫瘤大小(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)有關(guān)，而與患者年齡(P>0.05)、月經(jīng)狀態(tài)(P>0.05)、組織類型(P>0.05)及臨床分期無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 EGFR蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性

2.3 EGFR蛋白與患者預(yù)后 Kaplan-Meier生存分析顯示，EZH2陽性和陰性乳腺癌患者3 a無疾病進(jìn)展生存率分別為68.5%和84.1%，陰性患者高于陽性患者(P<0.05)，圖2。

圖2 2組患者生存曲線

3 討論

乳腺癌(breast cancer)是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并且隨著年齡的增加發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[6]。近年來由于我國婦女普遍生育年齡較晚，且生育數(shù)量較少，同時(shí)由于不恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用激素等，乳腺癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。來自美國的流行病學(xué)研究顯示，乳腺癌在女性實(shí)體腫瘤中發(fā)病率為第一位，病死率為第二位，乳腺癌占到女性所有實(shí)體腫瘤的23%左右[7]。

乳腺癌的發(fā)病確切機(jī)制不詳，近年來的研究顯示[8]，乳腺癌組織中存在多個(gè)癌基因的激活過度表達(dá)與抑癌基因的失活有關(guān)。這種癌基因與抑癌基因的表達(dá)平衡紊亂可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

EZH2是由Hobert等采用酵母雙雜交系統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，是一個(gè)典型的癌基因。該基因編碼的蛋白能夠與其他蛋白構(gòu)成多梳蛋白復(fù)合體PcG。該復(fù)合體具有組蛋白修飾活性，能夠使組蛋白H3K27和或H3K9發(fā)生甲基化，進(jìn)而沉默基因組中多個(gè)抑癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。汪小霞等人[5]研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為59.0%，高于乳腺良性腫瘤組織。本組乳腺癌組織中EZH2的陽性表達(dá)率為56.8%，與汪小霞等人的報(bào)道基本一致，提示EZH2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。姚凡[11]及其同事采用免疫組織化學(xué)法檢測了105例乳腺癌中EZH2蛋白表達(dá)情況,并進(jìn)一步探討其與乳腺癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果認(rèn)為EZH2蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)明顯高于乳腺良性疾病,其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理組織學(xué)分級(jí)、ER表達(dá)及乳腺癌預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。本組中我們對(duì)EZH2對(duì)患者預(yù)后的影響做了分析，陽性患者3 a無疾病進(jìn)展生存率顯著低于陰性組，與姚凡等人的研究結(jié)論相似。因此，我們認(rèn)為EZH2基因的過度表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，上可通過檢測EZH2的表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)測。

[1] Bauge C, Bazille C, Girard N, et al. Histone methylases as novel drug targets: developing inhibitors of EZH2[J]. Future Med Chem, 2014,6(17):1 943-1 965.

[2] Chou RH, Chiu L, Yu YL, et al. The potential roles of EZH2 in regenerative medicine[J]. Cell Transplant, 2015,24(3):313-317.

[3] Poirier JT, Gardner EE, Connis N, et al. DNA methylation in small cell lung cancer defines distinct disease subtypes and correlates with high expression of EZH2[J]. Oncogene, 2015,34(48):5 869-5 878.

[4] Liu YL, Gao X, Jiang Y, et al. Expression and clinicopathological significance of EED, SUZ12 and EZH2 mRNA in colorectal cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2015,141(4):661-669.

[5] 汪小霞, 孟剛, 李麗, 等. 乳腺癌中EZH2和p53蛋白表達(dá)及其臨床意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2015,31(3):273-276.

[6] DeSantis C, Siegel R, Bandi P, et al. Breast cancer statistics, 2011[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(6):409-418.

[7] DeSantis C, Ma J, Bryan L, et al. Breast cancer statistics, 2013[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(1):52-62.

[8] Drukker CA, Schmidt MK, van Dalen T, et al. Gene expression classifiers in the prognosis of breast cancer [J]. Nederlands tijdschrift voor geneeskunde, 2014,158:7 001.

[9] Curry E, Green I, Chapman-Rothe N, et al. Dual EZH2 and EHMT2 histone methyltransferase inhibition increases biological efficacy in breast cancer cells[J]. Clin Epigenetics, 2015,7(1):84.

[10]Lee SR, Roh YG, Kim SK, et al. Activation of EZH2 and SUZ12 Regulated by E2F1 Predicts the Disease Progression and Aggressive Characteristics of Bladder Cancer[J]. Clinical cancer research, 2015,21(23):5 391-5 403.

[11]姚凡, 劉崇, 房月, 等. EZH2在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2013,25(2):143-146.

(收稿 2016-03-10)

楊峻峰，電話：051385969908

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