王　萍，郝文艷，曹麗華，沈開元，代小麗，李海艷，梁賢威，石德順*，李湘萍*

(1.廣西大學(xué)，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001)

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ssc-miR-148a啟動子克隆及其特征分析

王萍1，郝文艷1，曹麗華1，沈開元1，代小麗1，李海艷1，梁賢威2，石德順1*，李湘萍1*

(1.廣西大學(xué)，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001)

為研究豬miR-148a(ssc-miR-148a)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，對其啟動子進(jìn)行了克隆及分析。本試驗(yàn)首先設(shè)計特異性PCR擴(kuò)增引物，分別得到ssc-miR-148a前體上游3個片段，并將其連接到熒光素酶報告載體pGL3-Basic上。通過生物信息學(xué)方法，在線分析ssc-miR-148a啟動子大概區(qū)域、甲基化部位和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。將重組報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分析啟動子活性。采用不同濃度堿性成纖維生長因子(bFGF)處理豬成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)染有重組報告質(zhì)粒的豬成纖維細(xì)胞，檢測ssc-miR-148a和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的表達(dá)，及其對啟動子活性的影響。結(jié)果顯示，克隆得到的ssc-miR-148a啟動子區(qū)2 043 bp片段具有啟動子活性，該序列存在5個CpG島、Sp1及AP2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 0、5和10 ng·mL-1濃度bFGF處理豬成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)染重組報告質(zhì)粒的豬成纖維細(xì)胞后，ssc-miR-148a表達(dá)均顯著下降(P<0.05)，DNMT1 mRNA顯著增加(P<0.05)。啟動子活性均顯著下降(P<0.05)，5和10 ng·mL-1濃度間無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，ssc-miR-148a啟動子位于前體上游2 043 bp片段內(nèi)，啟動子區(qū)域有轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)受bFGF的調(diào)控。

ssc-miR-148a；啟動子；克?。籦FGF；DNMT1

miRNA是一類調(diào)控真核生物基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長約22個堿基。miRNA的功能是參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，主要通過與目的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物反向互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)[1]；或是通過加速靶標(biāo)mRNA 3′端poly(A)的脫腺苷酸化，導(dǎo)致整個mRNA迅速降解[2]。根據(jù)在染色體上的位置不同，miRNA可分為3類：基因間miRNA、內(nèi)含子miRNA和位于反義鏈miRNA。基因間和反義鏈miRNA具有獨(dú)立的啟動子，基因內(nèi)miRNA和宿主基因共用啟動子[3-4]?，F(xiàn)認(rèn)為miRNA由RNA聚合酶II和RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄而來，且大部分由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA的表達(dá)受增強(qiáng)子和激素的調(diào)控[7-8]。miRNA自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是研究其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的第一步，它對了解miRNA的生物學(xué)功能具有重要作用。

miR-148/152家族包括3個成員miR-148a、miR-148b和miR-152。其中miR-148a屬于基因間miRNA，具有獨(dú)立的啟動子。miR-148/152家族在許多腫瘤發(fā)生和正常器官的生長、發(fā)育和胚胎發(fā)育過程中都有表達(dá)，說明其在這些過程中具有重要作用[9]。miR-148a/152家族參與調(diào)控的靶基因涉及增殖(DNMT1[10-11]、P27[12]、CDC25B[13])、分化(ACVR1[14])和凋亡(Bcl2[15])。其中，DNMT1受miR-148/152的調(diào)控在人類的一些疾病中已被證實(shí)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡[10]、膽管癌[11]、肝癌[16]、急性淋巴細(xì)胞白血病[17]、子宮內(nèi)膜癌[18]等。DNA甲基化的機(jī)制是依賴DNMTs使CpG島雙核苷酸胞嘧啶的5號碳原子發(fā)生甲基化，DNMT1是維持性DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，作用是對新生的DNA鏈進(jìn)行甲基化。在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-148a表達(dá)異常，主要是由于其啟動子區(qū)異常的高甲基化引起的。A.K.Zhu等證實(shí)，胃癌細(xì)胞中miR-148a啟動子區(qū)DNA高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。沉默miR-148a后，降低其對DNMT1的抑制，進(jìn)而導(dǎo)致DNMT1的過表達(dá)[19]。這些研究表明可能存在一個新的miR-148/152-DNMT1循環(huán)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明，miR-148a的表達(dá)受激素調(diào)控，S.F.Tao等試驗(yàn)證實(shí)，胃癌細(xì)胞中E2通過GPER抑制miR-148a的表達(dá)，可能是通過GPER/EGFR/ERK信號通路影響核轉(zhuǎn)錄因子EGR-1的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)miR-148a的表達(dá)[20]。大家畜的miR-148a啟動子區(qū)是否含有高CpG位點(diǎn)，其表達(dá)是否受激素調(diào)控，調(diào)控miR-148a的表達(dá)是否影響DNMT1的表達(dá)等問題尚不清楚。

本試驗(yàn)以豬卵巢為材料擴(kuò)增ssc-miR-148a啟動子，并通過生物信息學(xué)方法分析其啟動子區(qū)內(nèi)的甲基化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，同時分析了bFGF對miR-148a表達(dá)和啟動子活性的影響，以及對DNMT1表達(dá)的影響。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡述ssc-miR-148a的表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1．1試驗(yàn)材料啟動子克隆材料為三元雜種豬卵巢基因組(來自南寧魯班路屠宰場)。pMD18-T克隆試劑盒來自TaKaRa公司；pGL3-Basic、pGL3-promoter、pRL-TK克隆載體為Promega公司產(chǎn)品。293T細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自存。

1.1.2酶與試劑Taq酶、dNTPs、Supercoiled DNA ladder Marker、DNA Marker、T4 DNA ligase、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)均購自大連TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Hind Ⅲ購自Fermentas公司；瓊脂糖(BIOWEST AGAROSE)為進(jìn)口分裝產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根公司；去內(nèi)毒素提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1啟動子克隆取約20 mg豬卵巢組織，通過酚/氯仿抽提的方法提取總DNA。從UCSC數(shù)據(jù)庫中下載得到ssc-miR-148a前體上游3 000 bp序列，采用oligo 6設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，擴(kuò)增3段不同長度的啟動子片段。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板1.0 μL、LA Taq 0.25 μL、GC Buffer I 10 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(表1)各0.5 μL、ddH2O 5.75 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，并對目的條帶膠回收，使其與pMD-18T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑菌后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。Cracking法快速鑒定重組質(zhì)粒，并用天根普通質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，將含目的片段的重組質(zhì)粒寄送華大公司測序。

表1ssc-miR-148a啟動子克隆及qRT-PCR引物

Table 1Oligonucleotides primers used in ssc-miR-148a promotor clone and qRT-PCR

引物名稱Primername(ForR)正向和反向引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature用途ApplicationmiR-148a-0.6KFCTCGAGGTGGAGCGGAGAGAAGAGG60啟動子克隆miR-148a-1KFCTCGAGGGAACCTGCTGACTTGACAC60啟動子克隆miR-148a-2KFCTCGAGGCCTTTCGGTTAGTCCTTGC60啟動子克隆miR-148aRAAGCTTGACCAAAGTGGCTGTCTTCC60啟動子克隆Loop-RT-miR-148aGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAAG-反轉(zhuǎn)錄RT-U6CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-反轉(zhuǎn)錄qRT-UGTGCAGGGTCCGAGGT55RT-PCRU6FCTCGCTTCGGCAGCACA55RT-PCRU6RAACGCTTCACGAATTTGCGT55RT-PCRmiR-148a-upGGTCAGTGCACTACAGAACTTT55RT-PCRDNMT1FCAGACAAGTGGTGAGGAC60RT-PCRDNMT1RTGTGAAATGAGATGTGATGG60RT-PCRB-ACTINFGGACCTGACCGACTACCTCA60RT-PCRB-ACTINRCCATCTCCTGCTCGAAGTCC60RT-PCR

下劃線為引入酶切位點(diǎn)，Loop-RT-miR-148a反轉(zhuǎn)錄特異性引物為莖環(huán)引物，反轉(zhuǎn)錄特異性引物退火溫度根據(jù)試劑盒說明確定The underline is the introducing restriction enzyme cutting sites.Loop-RT-miR-148a reverse transcription primer is the specific stem-loop RT primer.Annealing temperature of reverse transcription specificity primer is determined according to kit instructions

1.2.2啟動子生物信息學(xué)分析將克隆得到的最長片段導(dǎo)入到甲基化分析軟件MethPrimer，在線預(yù)測甲基化CpG島。并利用啟動子在線分析軟件Promoter SCAN、TSSW、TFSEARCH預(yù)測ssc-miR-148a啟動子區(qū)和可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。

1.2.3啟動子活性檢測載體構(gòu)建將pMD-18T-148a-0.6K、pMD-18T-148a-1K、pMD-18T-148a-2K和pGL3-Basic重組質(zhì)粒分別經(jīng)XhoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，用T4 DNA連接酶將回收片段與pGL3-Basic載體連接，重組載體分別命名為pGL3-148a-0.6K、pGL3-148a-1K、pGL3-148a-2K。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑菌后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證的陽性質(zhì)粒，用去內(nèi)毒素提取試劑盒提取，-20 ℃保存用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。1.2.4啟動子活性檢測采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d接種1×104個細(xì)胞于24孔板，第2天將pGL3-Basic、pGL3-148a-0.6K、pGL3-148a-1K、pGL3-148a-2K、pGL3-promoter及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK按50∶1的比例用脂質(zhì)體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，72 h后收集細(xì)胞。按照Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)說明書操作分析啟動子活性。

1.2.5bFGF處理豬成纖維細(xì)胞將1×105個豬成纖維細(xì)胞接種于35 cm培養(yǎng)皿中，分別用含0、5和10 ng·mL-1bFGF的DMEM培養(yǎng)豬成纖維細(xì)胞，72 h后收獲細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，通過紫外分光光度計檢測其純度和完整性。分別對提取的RNA用全式金快速反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA經(jīng)紫外分光光度計檢測其濃度，稀釋到100 ng·μL-1用于RT-PCR反應(yīng)，qRT-PCR所用引物見表1。

以相同的bFGF處理?xiàng)l件處理共轉(zhuǎn)pGL3-148a-2K及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK的成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例為10∶1，72 h后收獲細(xì)胞檢測雙熒光素酶活性。

1.2.6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)以“mean±SE”表示，各組之間的差異采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1ssc-miR-148a啟動子的克隆及分析

應(yīng)用特異的PCR引物擴(kuò)增得到ssc-miR-148a前體上游3個特異性條帶，片段大小與預(yù)期一致(圖1)，將PCR片段分別與pMD-18T載體連接，篩選得到陽性重組質(zhì)粒，并命名為pMD-18T-148a-0.6K、pMD-18T-148a-1K、pMD-18T-148a-2K。經(jīng)華大公司測序，分析PCR片段大小分別為646、1 355、2 043 bp。利用MethPrimer軟件在線分析克隆得到的2 043 bp序列CpG島情況，發(fā)現(xiàn)該序列存在5個CpG島(圖2)。利用啟動子在線分析軟件Promoter SCAN、TSSW、TFSEARCH，推測克隆得到的2 043 bp片段存在2個啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄因子以Sp1、AP2為主(圖3)。

M.Marker III；1.miR-148a-0.6K；2.miR-148a-1K；3.miR-148a-2K圖1　ssc-miR-148a啟動子PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification result of ssc-miR-148a promoter

圖2　ssc-miR-148a啟動子序列甲基化預(yù)測圖譜Fig.2　The methylation prediction map of ssc-miR-148a promoter

2.2雙熒光素表達(dá)載體的構(gòu)建

將測序正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-148a-0.6K、pMD-18T-148a-1K、pMD-18T-148a-2K和pGL3-Basic分別經(jīng)XhoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，而后連接得到3個具有不同啟動子片段長度的雙熒光素報告載體pGL3-148a-0.6K、pGL3-148a-1K和pGL3-148a-2K。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，均得到1條預(yù)期大小片段(圖4)，說明重組質(zhì)粒均為陽性克隆。

2.3啟動子表達(dá)活性

將含啟動子的雙熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-148a-0.6K、pGL3-148a-1K、pGL3-148a-2K、pGL3-promoter分別與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-Basic的細(xì)胞為對照。轉(zhuǎn)染72 h后檢查熒光素酶的表達(dá)水平，計算Fluc/Rluc的比值。與對照質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染pGL3-148a-0.6K、pGL3-148a-1K質(zhì)粒組細(xì)胞的熒光素酶比值無顯著變化(P>0.05)，轉(zhuǎn)染pGL3-148a-2K和pGL3-promoter質(zhì)粒組細(xì)胞的熒光素酶比值顯著增加(P<0.05)，說明pGL3-148a-2K具有啟動子效率(圖5)。

2.4bFGF對相關(guān)基因表達(dá)及啟動子活性的影響

采用0、5和10 ng·mL-1的bFGF分別處理豬成纖維細(xì)胞及共轉(zhuǎn)含啟動子的雙熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-148a-2K和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK的豬成纖維細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行分析。RT-PCR分析結(jié)果顯示，5和10 ng·mL-1bFGF處理后，miR-148a表達(dá)均顯著下降(P<0.05)，DNMT1 mRNA顯著增加(P<0.05)(圖6)。雙熒光素酶表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，5和10 ng·mL-1濃度間無顯著差異(P>0.05)(圖7)。以上結(jié)果說明bFGF可通過影響ssc-miR-148a啟動子活性，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。

圖3　ssc-miR-148a啟動子調(diào)控區(qū)序列Fig.3　Nucleotide sequence of the regulatory region of the ssc-miR-148a

M1.Marker VII；1.miR-148a-0.6K；2.miR-148a-2K；3.miR-148a-1K；4.pGL3-148a-0.6K；5.pGL3-148a-1K；6.pGL3-148a-2K；M2.Supercoiled DNA ladder marker圖4　重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4　The enzyme digestion results of recombinant plasmid

3　討　論

H.K.Saini等利用生物信息學(xué)方法分析了人類基因間miRNA啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcriptional start site，TSS)的位置，發(fā)現(xiàn)大部分基因間miRNA TSS位于pre-miRNA上游2 kb內(nèi)[21]。因此，本試驗(yàn)克隆了ssc-miR-148a前體上游最長2 043 bp片段并對其進(jìn)行了分析。X.F.Zhou等對4種模式生物的miRNA啟動子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，80%的miRNA核心啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-500 bp內(nèi)，has-mir-148a啟動子區(qū)域位于pre-miR-148a上游-395 bp處[22]。A.Lujambio等通過5′RACE方法得到has-miR-148a的TSS位于pre-miR-148a上游-518 bp處[23]。M.Bhattacharyya等通過分析人pri-miRNA 5′UTR區(qū)CAGE tags、TSS Seqs、H3K4me3預(yù)測miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，得到hsa-miR-148a TSS位于pre-miR-148a上游-1 097 bp處[24]。將人和豬miR-148a上游-3 000 bp序列進(jìn)行比對，同源性為83%，推測人和豬可能具有相似的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。將克隆得到的ssc-miR-148a前體上游2 kb序列進(jìn)行預(yù)測分析，存在兩個啟動子區(qū)。雙熒光素酶報告分析結(jié)果顯示，pre-ssc-miR-148a上游2 043 bp具有啟動子活性，646和1 355 bp不具有啟動子活性，說明ssc-miR-148a啟動子位于-1 355～-2 043 bp。這與軟件預(yù)測的啟動子區(qū)結(jié)果接近，同時與A.Lujambio等[23]得到的人miR-148a TSS位點(diǎn)在上游500 bp接近，但與X.F.Zhou等[22]預(yù)測的啟動子區(qū)位于-395 bp不同，可能是由于miR-148a具有多個啟動子區(qū)，其在不同組織中的表達(dá)由不同的啟動子啟動。

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Different letters means significant difference (P<0.05).The same as below圖5　啟動子活性檢測結(jié)果Fig.5　Detection of promoter activity

圖6　bFGF對ssc-miR-148a和DNMT1表達(dá)的影響Fig.6　The effect of bFGF on the expression of ssc-miR-148a and DNMT1

圖7　bFGF對啟動子活性的影響Fig.7　The effect of bFGF on promoter activity

堿性成纖維生長因子(bFGF)是一種多效能生長因子，誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、Src家族的酪氨酸激酶、磷酸肌醇3激酶(PI3K)和磷脂酶(PLC)途徑[25]。其中，MAPK作用的底物有ERK、p38和JNK，這些激酶活化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。轉(zhuǎn)錄因子SP1被ERK磷酸化并激活，磷酸化的SP1可以上調(diào)或下調(diào)目的基因。M.Wang等研究表明bFGF通過ERK/Sp1通路下調(diào)TSP50的表達(dá)[26]。S.Liu等研究KIT過表達(dá)引起的急性髓性白血病，Sp1與NFκB/HDAC形成復(fù)合體，結(jié)合到miR-29b啟動子區(qū)抑制miR-29b的表達(dá)[27]。H.Liu等研究睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，bFGF可以通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，抑制LH誘導(dǎo)的雄激素生成過程，在前體睪丸間質(zhì)細(xì)胞中miR-29a、miR-29c、miR-142-3p表達(dá)下調(diào)；miR-451、miR-335表達(dá)上調(diào)[28]。T.Numakawa研究發(fā)現(xiàn)，bFGF處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)miR-132的表達(dá)，處理星形膠質(zhì)細(xì)胞使miR-134表達(dá)上調(diào)，可能是通過ERK1/2的激活引起的[29-30]。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測，ssc-miR-148a啟動子區(qū)含有大量Sp1結(jié)合位點(diǎn)，bFGF處理豬成纖維細(xì)胞影響了miR-148a啟動子活性，使miR-148a表達(dá)受到抑制。S.F.Tao等試驗(yàn)證實(shí)，胃癌細(xì)胞中E2通過GPER抑制miR-148a的表達(dá)，可能是通過GPER/EGFR/ERK通路影響核轉(zhuǎn)錄因子EGR-1的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)miR-148a的表達(dá)，這與bFGF影響miR-148a的表達(dá)通路相似[20]。bFGF和E2是否通過MAPK-ERK-Sp1/EGR-1調(diào)控miR-148a表達(dá)的還需要后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

在許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-148/152家族基因DNA高甲基化。N.Hanoun等研究胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)現(xiàn)，miR-148a因DNA編碼區(qū)高甲基化而表達(dá)降低[31]。A.Lujambio等比較了正常組織與癌細(xì)胞中miR-148a CpG島甲基化情況，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞miR-148a CpG島高甲基化，并用DNA去甲基化藥物(5-aza-2′-deoxycytidine)處理癌細(xì)胞，miR-148a的表達(dá)上調(diào)[23]。DNMT1作為miR-148a的一個靶基因在許多腫瘤細(xì)胞中都已有報道。Q.Xu等發(fā)現(xiàn)DNMT1過表達(dá)會引起miR-148a啟動子高甲基化[32]。因此，miR-148a 啟動子區(qū)CpG島的甲基化可能降低miR-148a的表達(dá)，DNMT1是miR-148a的一個靶基因，相反，也可以影響miR-148a的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中存在miR-148a-DNMT1調(diào)控通路。本研究克隆得到的miR-148a啟動子，預(yù)測含有5個CpG島。bFGF處理成纖維細(xì)胞，miR-148a表達(dá)下調(diào)，DNMT1表達(dá)上調(diào)，可能是由于miR-148a的降低，解除了對DNMT1的抑制作用。本研究為體細(xì)胞核移植中miR-148a的表達(dá)及作用奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

Cloning and Analysis of ssc-miR-148a Promoter

WANG Ping1，HAO Wen-yan1，CAO Li-hua1，SHEN Kai-yuan1，DAI Xiao-li1，LI Hai-yan1，LIANG Xian-wei2，SHI De-shun1*，LI Xiang-ping1*

(1.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresource，GuangxiUniversity，Nanning530005，China；2.BuffaloResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Nanning530001，China)

In order to understand the transcriptional regulatory mechanism of ssc-miR-148a，we have cloned and analyzed its promoter.Firstly，we designed specific PCR primers to amplify 3 upstream fragments of ssc-miR-148a precursors，then inserted them into pGL3-Basic expression vector.Based on the amplified fragments，ssc-miR-148a promoter region，methylation sites and transcription factor binding sites were predicted by bioinformatics.The plasmid was transfected into 293T cells to analyze the promoter activity.Expression of ssc-miR-148a and DNA methylation transferase 1 (DNMT1) in treated porcine fibroblasts by Basic Fibroblast Growth Factor(bFGF)with different concentrations was detected.The results showed that the cloned 2 043 bp sequence had promoter activity，which had 5 CpGs and transcriptional factor binding sites，such as Sp1，AP2.After treated porcine fibroblasts with 0，5 and 10 ng·mL-1bFGF，the expression of ssc-miR-148a was decreased significantly(P<0.05)，DNMT1 mRNA level increased significantly (P<0.05).The promoter activity significantly reduced (P<0.05)，but no significant difference between 5 and 10 ng·mL-1concentrations (P>0.05).The results indicate that the promoter region of ssc-miR-148a locate at -2 043 bp，which has Sp1 transcription factor binding sites.The expression of ssc-miR-148a is regulated by the bFGF.

ssc-miR-148a；promoter；cloning；bFGF；DNMT1

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.004

2015-11-19

廣西壯族自治區(qū)研究生教育創(chuàng)新計劃項(xiàng)目(YCBZ2014013)；國家自然科學(xué)基金(31560632)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFAA118084)；廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(SNKF-2014-03)

王萍(1987-)，女，山東濟(jì)寧人，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wangping.online@163.com

李湘萍，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：xiangpingli@163.com；石德順，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn

S828;S813.3

A

0366-6964(2016)10-1969-08