張明哲，張曉峰，徐莉莉，陳笑梅，周　圓，尹文秀，陳吳健，李孝軍

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；2.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316000）

復合PCR熒光檢測方法檢測轉基因水稻品系

張明哲1，張曉峰1，徐莉莉1，陳笑梅1，周圓2，尹文秀1，陳吳健1，李孝軍2

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；2.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316000）

建立一種高通量的轉基因復合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）熒光檢測方法，該方法通過對轉基因檢測內(nèi)源、外源及品系基因檢測引物進行熒光標記，經(jīng)復合PCR擴增和毛 細管電泳熒光檢測，實現(xiàn)特異性強、高通量檢測。結果表明，復合PCR熒光檢測方法檢測4 種轉基因水稻品系特異性好，并且靈敏度達到0.1%，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監(jiān)測等領域進行應用。

復合聚合酶鏈式反應；毛細管電泳；轉基因水稻；品系鑒定

近年來，全球轉基因作物的商業(yè)化迅猛發(fā)展，種植面積由1996年的170萬 hm2增加至2014年的1.8億hm2，19 a中增加了近100 倍［1］。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國糧食生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位，轉基因水稻研發(fā)進展也較為迅速，已經(jīng)有多個轉基因水稻優(yōu)良品系進入環(huán)境釋放階段，申請商業(yè)化種植［2］。與此同時，轉基因技術對環(huán)境和食品安全的潛在風險已引起全球的廣泛關注［3-4］，國際貿(mào)易糾紛時有發(fā)生。2012年初，歐盟委員會發(fā)布了《對中國出口大米制品中含有轉基因成分采取緊急措施的決定》，歐盟將對中國25 種米制品采取強制性轉基因成分檢測，并依據(jù)檢測結果采取退貨和銷毀處理措施，中國官方必須在向歐盟出口前提交米制品非轉基因證明的檢驗報告，表明是否含有轉基因成分。2006年以來，已有法國、德國、意大利和奧地利等7 個國家因為轉基因大米污染對我國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施［5］。在此情況下，加強進出口領域轉基因水稻品系檢測成為必然趨勢。

目前聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術在轉基因檢測中得到了廣泛的應用［6-8］，如實時定量PCR技術［9-10］、環(huán)介導等溫擴增技術［11-13］、重組酶聚合酶等溫擴增技術［14-17］等，但是常用的PCR檢測無法滿足轉基因高通量檢測的需求［18-19］。因此，迫切地需要建立一種有效、快速的檢測方法，而復合PCR熒光檢測技術是解決這一問題的亮點。本研究建立了一種高通量的轉基因復合PCR熒光檢測方法，并應用于轉基因水稻品系檢測。該方法通過對轉基因檢測內(nèi)源、外源及品系基因檢測引物進行熒光標記，經(jīng)復合PCR擴增和毛細管電泳熒光檢測，實現(xiàn)高度特異性、高通量檢測。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

非轉基因水稻、大豆和油菜籽 市購；轉基因水稻品系Bt汕優(yōu)63（Bt63）、科豐6號（KF6）、克螟稻（KMD） 中國檢驗檢疫科學研究院；轉基因水稻品系LLRICE62，轉基因玉米品系GA21、Bt176、MIR604、Mon88017、Bt11，轉基因大豆品系GTS-40-3-2、Mon89788、CV127，轉基因油菜籽品系Ms8、Rf3、Rt73歐洲標準局。

Dneasy Plant Mini Kit試劑盒 德國Qiagen公司；引物和探針合成、普通PCR反應的試劑 寶生物工程（大連）有限公司；其他分析純試劑購于美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

PHILIPS cucina blender HR2860 荷蘭Philips公司；Sorvall micro21R臺式冷凍離心機、MAXQ6000搖床、Nano Drop 3300核酸測定儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；S-1000PCR儀 美國Bio-Rad公司；Imager HP核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；XS104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Pixsys5500點樣儀 美國Cartesian Technologies公司；LS300 Scanner掃描儀 瑞士Tecan Group Ltd.公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)德國Merck公司；真空泵 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；遺傳分析儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3方法

1.3.1材料制備

將水稻、大豆、油菜籽、玉米等材料研磨至粉末狀（0.2 mm左右），在轉基因樣本中按比例加入非轉基因樣本，分別獲得1%、0.1%、0.01%含量的轉基因樣品。

1.3.2DNA提取

DNA提取都使用QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒進行，DNA濃度由核酸測定儀檢測得到。

1.3.3引物

實驗所用引物設計時通過GeneBank中的BLAST功能考慮引物擴增特異性，由于采用的是復合PCR擴增體系，每組PCR的引物之間在混合體系中將存在一定的干擾，因此引物設計時考慮復合PCR的多組引物之間的干擾和平衡，調(diào)整引物。其中選擇兩條引物中的一條引物的5'端采用6-FAM、HEX、TAMRA中一種進行標記，且各組之間的標記色均不相同。以水稻品系Bt63為例，引物如表1所示。

表1　水稻品系Bt63引物序列Table1　Primer sequences for transgenetic rice event Bt6

1.3.4復合PCR擴增

以轉基因樣品提取的DNA為模板，同時加入多對引物進行復合PCR擴增，對復合PCR各引物添加量、TaqDNA聚合酶用量進行優(yōu)化，建立優(yōu)化的反應體系。PCR反應體系為：Reaction Mix 10 μL；熱啟動C-Taq 1 μL；Primers 5 μL；模板DNA 1 μL（質(zhì)量濃度30 ng/μL左右）；補ddH2O至25 μL。引物擴增終濃度見表2。擴增程序為：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表2　引物擴增終濃度Table2　Final concentrations of primers

1.3.5熒光檢測

由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子質(zhì)量內(nèi)標AGCU Maker SIZ-500組成上樣混合物［（0.5 μL AGCU Maker SIZ-500（制備方法參照專利CN101307226：用于寡核苷酸和蛋白標記的熒光染料及其制備方法和用途）×進樣數(shù)+（12 μL去離子甲酰胺）×進樣數(shù)］。將12.5 μL上樣混合物與1 μL擴增產(chǎn)物混合，渦旋混勻后，2 000 r/min離心2 min，避免產(chǎn)生氣泡。95 ℃變性3 min，冰浴3 min，并盡快采用多道或單道毛細管電泳進行檢測，檢測結果用遺傳分析儀進行分析。

2　結果與分析

2.1檢測基因選擇與排布

轉基因檢測位點主要分為3 類，分別為內(nèi)源、外源及品系基因。本研究中共檢測27 個基因，包括大豆、玉米、油菜、水稻4 個內(nèi)源基因、8 個外源基因以及15 個轉基因品系，其中FAM色檢測8 個外源基因，分別為NOS、Bar、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-epsps、Cry1Ab、NPTII；HEX色檢測玉米內(nèi)源基因Zein及5 個轉基因玉米品系GA21、MIR604、Mon88017、Bt176、Bt11；TAMRA色檢測大豆內(nèi)源基因Lectin、油菜內(nèi)源基因Pe3-pepcase、水稻內(nèi)源基因Sps，4 個轉基因水稻品系Bt63、KF6、KMD、LLRICE62，3 個轉基因油菜品系Ms8、Rf3、Rt73以及3 個轉基因大豆品系GTS-40-3-2、Mon89788、CV127。具體排布位置見圖1。

圖1　轉基因檢測基因排布Fig.1　Gene loci configuration for GMO detection

2.2特異性分析

在本實驗中，利用復合PCR熒光檢測法對4 種轉基因水稻品系進行檢測，其中Bt63品系檢測結果如圖2A所示。出峰位點分別為終止子基因NOS、轉基因水稻抗蟲外源基因Cry1Ab、水稻轉基因品系Bt63、基因水稻內(nèi)源基因Sps，而其他基因位點未出峰。因此確定檢測出轉基因水稻Bt63品系，說明復合PCR熒光檢測法進行轉基因檢測具有高度的特異性。

圖2　轉基因水稻Bt63擴增圖譜Fig.2　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63

2.3混合品系檢測分析

在本實驗中，利用復合PCR熒光檢測法對轉基因水稻Bt63、KF6、KMD的混合品系進行檢測，結果如圖3所示，出峰位點分別為終止子基因NOS、啟動子CaMV35S、轉基因水稻抗蟲外源基因Cry1Ab、水稻轉基因品系KMD、水稻轉基因品系KF6、水稻轉基因品系Bt63及水稻內(nèi)源基因Sps，而其他基因位點未出峰。因此我們確定檢測出轉基因水稻KMD、KF6、Bt63的混合品系。

圖3　轉基因水稻混合品系擴增圖譜Fig.3　Polymorphic fingerprints of mixed genetically modified rice events

2.4靈敏度分析

在本實驗中，利用復合PCR熒光檢測法對不同含量的轉基因水稻進行檢測靈敏度分析，檢測結果顯示，Sps基因擴增的信號值基本穩(wěn)定，能有效滿足芯片靈敏度檢測的需要。外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab及品系Bt63檢測發(fā)現(xiàn)，1%、0.1%含量的轉基因檢測都有陽性信號出現(xiàn)（圖4、5），而0.01%含量的轉基因檢測無陽性信號出現(xiàn)（圖6）。3 次重復檢測顯示，0.1%含量的檢測結果基本穩(wěn)定，因此認為本實驗中復合PCR熒光檢測法進行轉基因檢測的靈敏度為0.1%。

圖4　轉基因樣本Bt63與非轉基因水稻混合所占比例為1%時擴增圖譜Fig.4　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63 added with 1% non-genetically modified rice

圖5　轉基因樣本Bt63與非轉基因水稻混合所占比例為0.1%時擴增圖譜Fig.5　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63 added with 0.1% non-genetically modified rice

圖6　轉基因樣本Bt63與非轉基因水稻混合所占比例為0.01%時擴增圖譜Fig.6　Polymorphic fingerprints of genetically modified rice Bt63 added with 0.01% non-genetically modified rice

3　討 論

目前基于DNA的轉基因檢測通常使用對目標序列擴增的方法來進行檢測，根據(jù)檢測目標序列的不同可分為篩選檢測（如35S啟動子、NOS終止子等）、基因特異性檢測（外源基因）、構建特異性檢測和品系特異性檢測（轉化事件）。其中品系特異性檢測［20］是通過分析外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實現(xiàn)的，每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有非常高的特異性和準確性。品系特異性檢測是目前轉基因植物及其產(chǎn)品檢測的最準確和最特異的核酸檢測方法，并將為國際檢測標準和國際各檢測實驗室所采用。

目前，已建立了以PCR技術為代表的一系列水稻品系檢測方法，如Bt63［21］、LLRICE62［22］、科豐6號［23］等。但是這些方法都是以單品系檢測為基礎的，隨著轉基因品系的不斷增多，迫切需求高通量、高靈敏度和高特異性的檢測方法。綜上所述，本研究建立的轉基因復合PCR熒光檢測方法具有高特異性、高靈敏度以及高通量等特點，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監(jiān)測等領域進行廣泛應用。

［1］ JAMES C. 2014年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢［J］. 中國生物工程雜志, 2015, 35（1）： 1-14. DOI：10.13523/j.Cb.20150101.

［2］ 李黎紅, 葉衛(wèi)軍, 郭龍彪. 我國轉基因水稻研究進展和商業(yè)化前景分析［J］. 中國稻米, 2012, 18（6）： 1-4. DOI：10.3969/ j.issn.1006-8082.2012.06.001.

［3］ 賈士榮. 轉基因作物的環(huán)境風險分析研究進展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37（2）： 175-187. DOI：10.3321/j.issn：0578-1752.2004.02.004.

［4］ 賈士榮. 未來轉基因作物的環(huán)境風險分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37（4）： 484-489. DOI：10.3321/j.issn：0578-1752.2004.04.004.

［5］ 張明哲, 陳吳健, 張曉峰, 等. 酶連接探針雜交芯片特異性檢測轉基因水稻品系［J］. 食品科學, 2014, 35（8）： 222-225. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201408044.

［6］ GACHET E, MARTIN G G, VIGNEAU F, et a1. Derection of genetically modified organisms （GMOs） by PCR： a brief review of methodologies available［J］. Trends in Food Science and Technology, 1999, 9： 380-388. DOI：10.1016/S0924-2244（99）00002-3.

［7］ 邱良焱, 肖有玉, 劉佳, 等. 多重PCR法檢測轉Bar、Bt基因雙抗稻米［J］. 食品科學, 2013, 34（6）： 139-142. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201306030.

［8］ 王媛, 葛毅強, 陳穎, 等. 大豆加工食品中轉基因成分多重PCR檢測體系的建立［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30（10）： 117-121. DOI：10.3321/j.issn：0253-990X.2004.10.025.

［9］ CHAOUACHI M, MALKI R E, BERARD A, et al. Development of a real-time PCR method for the differential detection and quantification of four solanaceae in GMO analysis： potato, tomato, eggplant and pepper［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56（6）：1818-1828. DOI：10.1021/jf073313n.

［10］ WENG H B, YANG L T, LIU Z L, et al. Novel reference gene, highmobility-group protein I/Y, can be used in qualitative and realtime quantitative PCR detection of transgenic canolas cultivars［J］. Journal of Aoac International, 2005, 88（2）： 577-584.

［11］ GUAN X Y, GUO J C, SHEN P, et al. Visual and rapid detection of two genetically modified soybean events using loop-mediated isothermal amplification method［J］. Food Analytical Methods, 2010, 3（4）： 313-320. DOI：10.1007/s12161-010-9132-x.

［12］ CHEN L L, GUO J C, WANG Q D, et al. Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assays for seven genetically modified maize events and their application in practical samples analysis［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59（11）：5914-5918. DOI：10.1021/jf200459s.

［13］ CHEN X Y, WANG X F, JIN N, et al. Endpoint visual detection of three genetically modified rice events by loop-mediated isothermal amplification［J］. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13（11）： 14421-14433. DOI：10.3390/ijms131114421.

［14］ BOYLE D S, LEHMAN D A, LILLIS L, et al. Rapid detection of HIV-1 proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification［J］. MBio, 2013, 4（2）： 49-52. DOI：10.1128/ mbio.00135-13.

［15］ EULER M, WANG Y J, NENTWICH O, et al. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Rift valley fever virus［J］. Journal of Clinical Microbiology, 2012, 54（4）： 308-312. DOI：10.1016/j.jcv.2012.05.006.

［16］ EULER M, WANG Y J, OTTO P, et al. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Francisella tularensis［J］. Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50（7）： 2234-2238. DOI：10.1128/jcm.06504-11.

［17］ 徐潮, 李亮, 金蕪軍, 等. 熒光RPA技術檢測轉基因水稻科豐6號［J］.分子植物育種, 2014, 12（5）： 875-880.

［18］ 許文濤, 楊蓉, 陸姣, 等. 轉基因玉米59122品系的特異性檢測［J］. 食品科學, 2011, 32（4）： 139-142. DOI：10.3969/ j.issn.0439-8114.2011.24.065.

［20］ BERDAL K, HOLST-JENSEN A. Roundup ready soybean eventspecific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detectionand quantification limits in GMO analyses［J］. European Food Research and Technology, 2001, 213： 432-438. DOI：10.1007/s002170100403.

［21］ 吳志毅, 張明哲, 陳曦, 等. 大米和米制品Bt63轉基因檢測PCR方法的靈敏度研究［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學, 2009, 21（6）： 549-554. DOI：10.3969/j.issn.1004-1524.2009.06.004.

［22］ DING J Y, JIA J W, YANG L T, et al.Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52（11）： 3372-3377. DOI：10.1021/jf049915d.

［23］ REITING R, GROHMANN L, MADE D. A testing cascade for the detection of genetically modified rice by real-time PCR in food and its application for detection of an unauthorized rice line similar to KeFeng6［J］. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2010, 5（2）： 185-188. DOI：10.1007/s00003-010-0573-3.

Establishment of a High-Throughput Fluorescence Multiplex PCR Method for Detection of Genetically Modified Rice Events

ZHANG Mingzhe1, ZHANG Xiaofeng1, XU Lili1, CHEN Xiaomei1, ZHOU Yuan2, YIN Wenxiu1, CHEN Wujian1, LI Xiaojun2
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China；2. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316000, China）

In this research, a high-throughput and specific method for the detection of genetically modified （GM） rice events was developed using fluorescence multiplex PCR and capillary electrophoresis based on fluorescence-labeled primers for endogenous, exogenous and event-specific genes. The fluorescence multiplex PCR method could specifically detect four GM rice events with a sensitivity of 0.1%. This method has the potential to be applied in the inspection and quarantine of import and export genetically modified commodities and in food safety detection.

multiplex PCR； capillary electrophoresis； genetic modified rice； identification of genetically modified events

10.7506/spkx1002-6630-201620032

Q789

A

1002-6630（2016）20-0187-04

張明哲, 張曉峰, 徐莉莉, 等. 復合PCR熒光檢測方法檢測轉基因水稻品系［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 187-190.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620032. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Mingzhe, ZHANG Xiaofeng, XU Lili, et al. Establishment of a high-throughput fluorescence multiplex PCR method for detection of genetically modified rice events［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 187-190. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620032. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-01

浙江省重大科技專項（2011C12023）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2011IK249）；浙江省公益技術項目（2011C22065；2014C32004）

張明哲（1982—），男，高級農(nóng)藝師，博士研究生，研究方向為分子生物學和植物檢疫。

E-mail：mzzhang429@163.com