樊紅秀，劉婷婷，劉鴻鋮，任華華，張艷榮

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化高溫高壓制備玉米環(huán)（組氨酸-脯氨酸）二肽關(guān)鍵工藝

樊紅秀，劉婷婷，劉鴻鋮，任華華，張艷榮*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

將高溫高壓技術(shù)應(yīng)用于玉米環(huán)（組氨酸-脯氨酸）二肽（cyclo（His-Pro），CHP）的制備，以玉米蛋白水解物為原料，在水相溶液中采用高溫高壓法對(duì)其進(jìn)行環(huán)化，合成CHP。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察反應(yīng)溫度、底物質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間和KHCO3濃度對(duì)CHP提取量的影響，應(yīng)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)高溫高壓環(huán)化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度125.9 ℃、反應(yīng)壓力0.25 MPa、底物質(zhì)量濃度20.5 mg/mL、KHCO3濃度0.16 mol/L、反應(yīng)時(shí)間5.3 h，此條件下CHP提取量可達(dá)6.58 mg/g。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水解物中的CHP進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，結(jié)果表明制備的玉米CHP與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符。

玉米蛋白；環(huán)（組氨酸-脯氨酸）二肽；高溫高壓法；環(huán)化反應(yīng)

環(huán)（組氨酸-脯氨酸）二肽（cyclo（His-Pro），CHP）是一種內(nèi)源性環(huán)二肽，廣泛分布于人和動(dòng)物的組織和體液中［1］，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出多種生理活性，例如緩解酒精的麻醉作用［2］、避免自由基和外傷誘發(fā)的神經(jīng)元死亡［3］、降低食欲［4］、調(diào)節(jié)血糖代謝［5］等。CHP是促甲狀腺素釋放激素的代謝產(chǎn)物，相關(guān)研究過(guò)程中大量的CHP從某些食物蛋白水解物中被分離出來(lái)，如酪蛋白、魚(yú)、蝦以及大豆蛋白等［6-7］，這些CHP被認(rèn)為是由蛋白質(zhì)通過(guò)熱處理或酶解作用釋放出的組氨酸-脯氨酸（His-Pro）或脯氨酸-組氨酸（Pro-His）二肽發(fā)生非酶促環(huán)化而形成的［8］。食物蛋白源CHP因其安全性高、來(lái)源廣泛、成本低廉以及較強(qiáng)的生理活性而受到研究者們的關(guān)注，已成為生物活性肽領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

玉米是三大糧食作物之一，我國(guó)玉米年產(chǎn)量正常年產(chǎn)量為2.12億 t左右，約占世界總產(chǎn)量的四分之一［9］。玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副產(chǎn)物，其蛋白含量高達(dá)50%～60%。玉米蛋白粉水溶性差，缺乏色氨酸、賴氨酸等人體必需的氨基酸，嚴(yán)重限制其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。目前在國(guó)內(nèi)玉米蛋白粉主要作為低價(jià)飼料蛋白出售，未充分發(fā)揮玉米蛋白的糧食屬性，造成人類食物資源的浪費(fèi)［10-11］。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已收錄的玉米蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)玉米γ-醇溶蛋白、谷蛋白以及球蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含His-Pro和Pro-His序列［12］，是制備高附加值CHP的良好來(lái)源。環(huán)二肽的傳統(tǒng)合成方法主要有固相法和溶劑回流法［13］，存在產(chǎn)率低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)溶劑消耗量大等缺點(diǎn)。近年來(lái)出現(xiàn)了利用高溫高壓法、微波輻射法等新技術(shù)合成環(huán)二肽的文獻(xiàn)報(bào)道［14-15］，取得了令人滿意的結(jié)果。高溫高壓技術(shù)具有高效、廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，可大幅度提高反應(yīng)速度和產(chǎn)率。本研究將高溫高壓技術(shù)應(yīng)用于玉米CHP的合成中，以玉米黃粉為起始原料，經(jīng)蛋白酶水解得到富含His-Pro和Pro-His二肽的玉米蛋白水解物后，在高溫高壓條件下直接對(duì)其進(jìn)行環(huán)化，制備CHP。重點(diǎn)考察了高溫高壓環(huán)化反應(yīng)條件，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)產(chǎn)物中CHP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，旨在促進(jìn)CHP活性肽的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用、提高玉米蛋白的附加值、促進(jìn)玉米精深加工業(yè)良性發(fā)展。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

玉米黃粉（蛋白含量55.76%） 黃龍食品工業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（酶活286 000 U/mL）、風(fēng)味蛋白酶（酶活247 000 U/g）（均為食品級(jí)） 丹麥諾維信公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活20 000 U/g）、葡萄糖苷酶（酶活120 000 U/g）（均為食品級(jí)） 無(wú)錫杰能科生物工程有限公司；CHP標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 上海吉爾生化有限公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；三氟乙酸（trifl uoroacetic acid，TFA，純度98%） 美國(guó)Sigma Aldrich公司；屈臣氏蒸餾水 廣州屈臣氏有限公司；KHCO3（分析純） 北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

LDZM-80KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；Acquity H-Class超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Accela UPLC色譜系統(tǒng)和LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源和Xcalibur工作站） 美國(guó)Thermo Fisher公司；HA121-50-02超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；PHS-3BW電腦數(shù)顯酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京市中興偉業(yè)儀器有限公司；Alpha 1-4 LDplus凍干機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；KDC-1402低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HYP-1004消化爐 上海纖檢儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1玉米γ-醇溶蛋白和谷蛋白的同時(shí)提取

稱取1 kg玉米黃粉粉碎，過(guò)40 目篩，超臨界CO2萃取法脫脂脫色后用去離子水配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的玉米黃粉懸浮液，調(diào)節(jié)pH 6.5，于90 ℃條件下按40 U/g底物加入耐高溫α-淀粉酶，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h，降溫至55 ℃，調(diào)節(jié)pH 4.5，按280 U/g底物加入葡萄糖苷酶繼續(xù)水解1 h，在沸水浴中滅酶30 min，離心（3 800 r/min，15 min）去除上清液，沉淀物用等量蒸餾水洗滌3 次，徹底去除淀粉及其水解產(chǎn)物，60 ℃干燥箱中烘干。將脫淀粉玉米黃粉按料液比1∶10（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，60 ℃水浴提取60 min后，離心（3 800 r/min，15 min）分離收集上清液和沉淀。如此重復(fù)2 次。上清液即為α-醇溶蛋白和β-醇溶蛋白，可用于制備醇溶蛋白膜、緩釋性壁材等［16］；沉淀于60 ℃烘箱中烘干后，得到玉米γ-醇溶蛋白和谷蛋白（580 g），作為蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)的原料，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定其蛋白含量為83.14%。

1.3.2 γ-醇溶蛋白和谷蛋白水解液的制備

采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步水解玉米γ-醇溶蛋白和谷蛋白，得到富含His-Pro和Pro-His二肽的玉米蛋白水解物。將玉米γ-醇溶蛋白和谷蛋白按照料液比1∶20（g/mL）加水混合于55℃條件下預(yù)熱，調(diào)節(jié)溶液pH 8.0，按12 100 U/g底物加入堿性蛋白酶，攪拌水解6.5 h，調(diào)節(jié)pH 7.5，溫度保持不變，按17 000 U/g底物加入風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解6 h，反應(yīng)結(jié)束后在95 ℃條件下滅酶15 min，酶解液離心分離（3 800 r/min，15 min）收集上清液。向上清液中加入3 倍體積無(wú)水乙醇，于4 ℃條件下靜置4 h，離心脫除蛋白，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥，得到玉米蛋白水解物（232 g）。

1.3.3高溫高壓法合成玉米CHP

稱取10.00 g水解物凍干粉置于500 mL錐形瓶中，按一定底物質(zhì)量濃度加入蒸餾水配制成多肽溶液，同時(shí)加入一定量的KHCO3調(diào)節(jié)溶液pH值為弱堿性，用紗布封口，放入壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行高溫高壓處理，使樣液中的Pro-His二肽發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成CHP（圖1），達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，溶液冷卻，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，冷凍干燥，得到環(huán)化產(chǎn)物。稱取2 mg產(chǎn)物溶于20 mL含0.05% TFA的水-乙腈（95∶5，V/V）溶液，樣液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，采用超高效液相色譜法進(jìn)行分析。

圖1　CHP的合成途徑Fig.1　Scheme of CHP synthesis

1.3.4CHP含量的測(cè)定

環(huán)化產(chǎn)物中CHP含量的測(cè)定采用超高效液相色譜法，色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；保護(hù)柱：VanGuard Pre-Column HSS T3（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為含0.05% TFA的超純水，流動(dòng)相B為乙腈，線性洗脫梯度：0～5 min，5% B；5～6 min，5%～80% B；6～20 min，80% B。流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，進(jìn)樣量1 μL。

圖2　CHP標(biāo)準(zhǔn)品的超高效液相色譜圖Fig.2　UPLC chromatogram of CHP standard

CHP的定量采用外標(biāo)法，精密稱取CHP標(biāo)準(zhǔn)品5 mg（精確至0.l mg）于5 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，配置成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用上述色譜條件檢測(cè)（圖2），以峰面積為縱坐標(biāo)、以對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到方程y=4 307 590x+10 640（R2=0.999 8）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CHP的含量，最終根據(jù)下式計(jì)算CHP提取量：

式中：X為CHP提取量/（mg/g）；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣液中CHP的含量/（mg/mL）；V為樣液的體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g；M1為環(huán)化產(chǎn)物的質(zhì)量/g；M2為環(huán)化前玉米蛋白水解物的質(zhì)量/g。

1.3.5高溫高壓法合成玉米CHP工藝條件優(yōu)化

1.3.5.1單因素試驗(yàn)

選取反應(yīng)溫度（11 0～1 3 5 ℃）、反應(yīng)時(shí)間（3～7 h）、底物質(zhì)量濃度（13～33 mg/mL）和KHCO3濃度（0～0.5 mol/L）4 個(gè)因素，研究不同因素對(duì)CHP提取量的影響，從而確定各因素的最佳水平。

1.3.5.2響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度、底物質(zhì)量濃度、KHCO3濃度和反應(yīng)時(shí)間為自變量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以CHP提取量為響應(yīng)值，優(yōu)化高溫高壓法合成玉米CHP的工藝條件，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table1　Factors and levels used in central composite design

1.3.6環(huán)化產(chǎn)物中CHP超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

采用Thermo LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì)環(huán)化產(chǎn)物中CHP進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，正離子檢測(cè)模式，噴霧電壓5.00 kV，毛細(xì)管電壓25.00 V，毛細(xì)管溫度250 ℃，鞘氣（N2）流速50.00 mL/min，管透鏡補(bǔ)償電壓85.00 V，一級(jí)全掃描范圍m/z 100～500。采用Thermo-Fisher Accela超高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用，色譜柱及色譜條件同方法1.3.4節(jié)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和處理采用Xcalibur軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1反應(yīng)溫度的確定

線型二肽前體閉合成環(huán)二肽反應(yīng)實(shí)質(zhì)上是分子內(nèi)縮合形成肽鍵的過(guò)程，二肽的環(huán)化反應(yīng)歷程是線型二肽前體通過(guò)單鍵的旋轉(zhuǎn)使羧基中的C和氨基中的N逐漸接近，羧基上的OH先脫去，N和C繼續(xù)接近至形成單鍵，而后氨基上的H才脫去，H移向OH與之結(jié)合成H2O，最后H2O遠(yuǎn)離生成的環(huán)二肽［17］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［18］，高溫高壓有利于線性肽克服形成環(huán)狀過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)中的扭曲張力，增加首尾相遇機(jī)會(huì)，促進(jìn)成環(huán)反應(yīng)進(jìn)行。在底物質(zhì)量濃度23 mg/mL、KHCO3濃度0.2 mol/L、反應(yīng)時(shí)間5 h條件下，分別于110、115、120、125、130、135 ℃進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，考察反應(yīng)溫度對(duì)CHP提取量的影響，如圖3所示。

圖3　反應(yīng)溫度對(duì)CHP提取量的影響Fig.3　Effect of reaction time on the yield of CHP

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)釜顯示的反應(yīng)壓力不斷增大，而CHP提取量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)：當(dāng)反應(yīng)溫度低于125 ℃時(shí)，CHP提取量隨著反應(yīng)溫度的升高而急劇增大，在125 ℃時(shí)趨于平穩(wěn)；繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，超過(guò)130 ℃時(shí)，反應(yīng)壓力繼續(xù)增大，而CHP提取量開(kāi)始降低，同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物生成，并且在產(chǎn)物中觀察到了部分消旋。因此本實(shí)驗(yàn)選取125 ℃為最佳反應(yīng)溫度，此時(shí)反應(yīng)壓力為0.24 MPa。

2.1.2底物質(zhì)量濃度的確定

Marchini等［19］指出最佳底物質(zhì)量濃度是形成環(huán)狀過(guò)渡態(tài)復(fù)合物引起環(huán)張力最小的那一種；若底物質(zhì)量濃度過(guò)高則容易發(fā)生分子間的聚合，從而導(dǎo)致環(huán)二聚肽和環(huán)多聚肽等副產(chǎn)物的生成［20］。在KHCO3濃度0.2 mol/L、反應(yīng)溫度125 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h條件下，分別于13、18、23、28、33 mg/mL的底物質(zhì)量濃度條件下進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，考察底物質(zhì)量濃度對(duì)CHP提取量的影響，如圖4所示。

圖4　底物質(zhì)量濃度對(duì)CHP提取量的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on the yield of CHP

由圖4可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，CHP提取量逐漸降低，底物質(zhì)量濃度在13～23mg/mL范圍內(nèi)，CHP提取量隨著底物質(zhì)量濃度的增加降低不顯著；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)23 mg/mL時(shí)，CHP提取量降低的幅度較大，液相色譜檢測(cè)到有副產(chǎn)物生成。因此關(guān)環(huán)反應(yīng)需在稀溶液中進(jìn)行，但是過(guò)低的底物質(zhì)量濃度造成反應(yīng)溶液體積過(guò)大，在實(shí)際生產(chǎn)中無(wú)形的增加了設(shè)備要求，濃縮成本也加大，因此本實(shí)驗(yàn)選取23 mg/mL為最佳底物質(zhì)量濃度。

2.1.3KHCO3濃度的確定

根據(jù)文獻(xiàn)［21］，反應(yīng)體系中添加堿可以提高二肽N端的親核活性，有利于氨基進(jìn)攻末端碳原子發(fā)生分子內(nèi)縮合，提高環(huán)化速率，故經(jīng)典的環(huán)二肽液相合成法大多是在堿性條件下進(jìn)行，但是過(guò)量的堿易引起終產(chǎn)物環(huán)二肽的消旋，得到非對(duì)映異構(gòu)體的混合物［22］。分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L不同濃度的KHCO3溶液，于底物質(zhì)量濃度23 mg/mL、反應(yīng)溫度125 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h條件下進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，考察KHCO3濃度對(duì)CHP提取量的影響，如圖5所示。

圖5　KHCO3濃度對(duì)CHP提取量的影響Fig.5　Effect of KHCO3concentration on the yield of CHP

由圖5可知，隨著KHCO3濃度的增加，CHP提取量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)KHCO3在低濃度范圍（0～0.2 mol/L）時(shí)，隨著KHCO3濃度的增加，CHP提取量逐漸增大；當(dāng)KHCO3濃度大于0.2 mol/L時(shí)，隨著KHCO3濃度的增加，CHP提取量開(kāi)始緩慢下降，并且產(chǎn)物的消旋化程度逐漸增加，因此本實(shí)驗(yàn)中KHCO3濃度選擇0.2 mol/L。

2.1.4反應(yīng)時(shí)間的確定

在底物質(zhì)量濃度23 mg/mL、反應(yīng)溫度125 ℃、KHCO3濃度0.2 mol/L的條件下，分別反應(yīng)不同的時(shí)間3、4、5、6、7 h，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)CHP提取量的影響，如圖6所示。

圖6　反應(yīng)時(shí)間對(duì)CHP提取量的影響Fig.6　Effect of reaction time on the yield of CHP

由圖6可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CHP提取量逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5 h時(shí)，CHP提取量達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，CHP提取量上升緩慢并逐漸趨于平穩(wěn)，表明此時(shí)反應(yīng)已經(jīng)完全，從能耗及經(jīng)濟(jì)角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選取5 h為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由于試驗(yàn)過(guò)程中反應(yīng)釜的壓力不可調(diào)，其是隨著反應(yīng)溫度的變化而變化的，故反應(yīng)壓力和反應(yīng)溫度的影響一致，因此選擇反應(yīng)溫度（A）、底物質(zhì)量濃度（B）、KHCO3濃度（C）和反應(yīng)時(shí)間（D）進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table2　Experimental design and results for response surface methodology

以CHP提取量為因變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得二次多項(xiàng)擬合回歸方程為：

Y=-276.925 2+4.254 9A+0.437 8B-34.666 7C+ 5.935D-0.003 2AB+0.37AC-0.13AD+0.35BC+ 0.015BD-1.1CD-0.016 6A2-0.004 8B2-42.5C2-0.37D2

從表3可以看出，整體模型的P值小于0.05，表明該二次方程模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.304 9＞0.05，表明其對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，方程擬合較好；變異系數(shù)越小，試驗(yàn)的可靠性越高［23］，變異系數(shù)較低，說(shuō)明試驗(yàn)操作的可信度高。此外，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.971 8和校正決定系數(shù)=0.945 5，說(shuō)明自變量與響應(yīng)值之間的多元回歸關(guān)系顯著，該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合良好，可以在模型設(shè)定的范圍內(nèi)分析和預(yù)測(cè)CHP提取量。模型中一次項(xiàng)A、B、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2以及交互項(xiàng)AC、BC對(duì)CHP提取量有顯著影響，其余項(xiàng)的影響均不顯著（P＞ 0.05）。方差分析結(jié)果還說(shuō)明，高溫高壓合成過(guò)程中對(duì)CHP提取量影響程度由強(qiáng)到弱的因素為：KHCO3濃度＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞底物質(zhì)量濃度。

表3　回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table3　Analysis of variance （ANOVA） and significance test for quadratic response surface model

圖7　各因素交互作用對(duì)CHP提取量影響的響應(yīng)面Fig.7　Response surfaces showing the interactive effects of reaction conditions on the yield of CHP

利用軟件分析得到如圖7所示的因變量與四因素間交互作用的響應(yīng)面圖。對(duì)回歸方程進(jìn)行模擬優(yōu)化，得到高溫高壓法合成玉米CHP的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度125.87 ℃、底物質(zhì)量濃度20.5 mg/mL、KHCO3濃度0.16 mol/L，反應(yīng)時(shí)間5.26 h，在此條件下得到的CHP提取量的理論值為6.54 mg/g。

2.3最佳反應(yīng)條件的驗(yàn)證

考慮到實(shí)際操作可行性，將最佳反應(yīng)條件修正為反應(yīng)溫度125.9 ℃、底物質(zhì)量濃度20.5 mg/mL、KHCO3濃度0.16 mol/L，反應(yīng)時(shí)間5.3 h。取10 g水解物，按照上述最優(yōu)條件進(jìn)行3 次高溫高壓合成反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的平均CHP提取量為6.58 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值較為相近，驗(yàn)證了響應(yīng)面設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。Lieberman等［6］從富含蛋白的加工食品如肉罐頭、魚(yú)露以及干制蝦中鑒定出CHP，其含量分別為0.84、1.27、1.41 μg/g食物；Koo等［24］用含KHCO3的乙醇溶液加熱回流大豆蛋白水解物，反應(yīng)2 周后水解物中CHP的含量為11.2 mg/g（水解物干質(zhì)量），但我國(guó)大豆年產(chǎn)量很低，為1 200萬(wàn)～1 300萬(wàn) t，每年需要進(jìn)口大豆6 500萬(wàn)～7 700萬(wàn) t，占國(guó)內(nèi)大豆消費(fèi)總量的80%［25］，有研究指出到2020年國(guó)內(nèi)大豆供需缺口將高達(dá)1 383萬(wàn) t［26］，我國(guó)大豆資源呈緊缺態(tài)勢(shì)。玉米蛋白粉來(lái)源廣泛，利用率很低，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示每年全國(guó)通過(guò)廢液自然排放的玉米黃粉的產(chǎn)量達(dá)8萬(wàn) t以上［27］，利用高溫高壓技術(shù)將玉米蛋白粉中含量豐富的玉米蛋白轉(zhuǎn)化為CHP不僅能夠提高社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，而且有利于減少環(huán)境污染。

2.4環(huán)化產(chǎn)物中CHP的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

圖8　高溫高壓環(huán)化反應(yīng)前（a）和反應(yīng)后（b）水解物的超高效液相色譜圖Fig.8　Comparison of UPLC chromatogram of hydrolysate before and after being subjected to cyclization reaction under high temperature and high pressure

圖9　保留時(shí)間3.07 min的色譜峰的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9　Mass spectrum of peak at retention time of 3.07 min

圖10　10 m/z 235.7母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.10　Tandem mass （MS/MS） spectrum of precursor ion m/z 235.7

對(duì)最優(yōu)工藝條件下得到的環(huán)化產(chǎn)物中的CHP進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。圖8為環(huán)化產(chǎn)物的超高效液相色譜圖，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，推測(cè)保留時(shí)間3.07 min的峰為CHP。通過(guò)質(zhì)譜儀自動(dòng)對(duì)來(lái)自超高效液相色譜的洗脫組分交替進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜處理，借助分析軟件，可對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。由圖9可知，保留時(shí)間3.07 min的成分形成m/z 235.7的母離子［M+H］+峰，可得出該組分的分子質(zhì)量為234.7 D，與標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量一致。再選擇母離子（m/z 235.7）通過(guò)惰性氣體碰撞誘導(dǎo)離解為多個(gè)二級(jí)碎片離子，碎片離子的掃描圖如圖10所示，主要碎片離子峰有m/z 207、162、166、110、70，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)環(huán)二肽的質(zhì)譜裂解規(guī)律可以推斷出：母離子m/z 235裂解失去一個(gè)中性分子—CO形成碎片離子m/z 207.7，基峰m/z 162是碎片m/z 207進(jìn)一步丟失一個(gè)肽鍵（—CHONH2）形成的，強(qiáng)峰 m/z 166則是母離子m/z 235通過(guò)丟失一個(gè)咪唑基團(tuán)（C3N2H5）產(chǎn)生的，另一強(qiáng)峰m/z 110是由碎片m/z 207丟失CHNHC4N2H5形成的，二級(jí)質(zhì)譜中還出現(xiàn)了典型的m/z 70的碎片離子，這是典型的脯氨酸的特征碎片離子，故可進(jìn)一步證明高溫高壓環(huán)化反應(yīng)后的玉米蛋白水解物中含有CHP。

3　結(jié) 論

以水為溶劑，采用高溫高壓技術(shù)對(duì)玉米蛋白水解物進(jìn)行環(huán)化，制備CHP。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)此工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度125.9 ℃、反應(yīng)壓力0.25 MPa、底物質(zhì)量濃度20.5 mg/mL、KHCO3濃度0.16 mol/L、反應(yīng)時(shí)間5.3 h。在此條件下，玉米蛋白水解物中的His-Pro和Pro-His線性二肽可以直接發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，得到較高提取量的CHP（6.58 mg/g），表明從玉米蛋白粉中實(shí)際生產(chǎn)CHP很有前景。通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)產(chǎn)物中的CHP進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步證明了環(huán)化產(chǎn)物中含有CHP活性肽。目前環(huán)二肽的高溫高壓合成都要經(jīng)過(guò)兩步：首先將二肽的羧基端制成活潑酯，然后于高溫高壓條件下成環(huán)，制備工藝繁瑣。本實(shí)驗(yàn)利用高溫高壓法一步合成CHP，不僅簡(jiǎn)化了工藝流程，同時(shí)具有反應(yīng)時(shí)間短、產(chǎn)物提取量高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，適于在工業(yè)化生產(chǎn)中推廣。我國(guó)玉米蛋白資源豐富，利用率低，玉米蛋白制備CHP用于保健食品和藥品的生產(chǎn)，可大幅度提高玉米蛋白經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。

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Optimization of Key Processing Parameters for Preparation of Corn Cyclo （His-Pro） by High Temperature/High Pressure Method

FAN Hongxiu, LIU Tingting, LIU Hongcheng, REN Huahua, ZHANG Yanrong*
（College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China）

In this study, we investigated the synthesis of corn cyclo （His-Pro） （CHP） in aqueous solution by a high temperature/pressure method from corn protein hydrolysate prepared in our laboratory. First of all, the one-factor-at-a-time method was used to investigate the influences of reaction temperature, substrate concentration, KHCO3concentration and reaction time on CHP yield. Subsequently, the reaction conditions were optimized using response surface methodology. Results revealed that the optimum reaction conditions were determined as follows： reaction temperature, 125.9 ℃；reaction pressure, 0.25 MPa； substrate concentration, 20.5 mg/mL； KHCO3concentration, 0.16 mol/L； and reaction time, 5.3 h, resulting in the maximum yield of CHP as high as 6.58 mg/g. The prepared CHP exhibited the expected structure as confirmed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）.

corn protein； cyclo （His-Pro）； high temperature/high pressure method； cyclization reaction

10.7506/spkx1002-6630-201620002

TS213.4

A

1002-6630（2016）20-0006-07

樊紅秀, 劉婷婷, 劉鴻鋮, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化高溫高壓制備玉米環(huán)（組氨酸-脯氨酸）二肽關(guān)鍵工藝［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 6-12. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620002. http：//www.spkx.net.cn

FAN Hongxiu, LIU Tingting, LIU Hongcheng, et al. Optimization of key processing parameters for preparation of corn cyclo （His-Pro） by high temperature/high pressure method［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 6-12. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620002. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-12

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD16B08）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100805）

樊紅秀（1987—），女，博士研究生，研究方向?yàn)榧Z油植物蛋白工程。E-mail：xcpyfzx@163.com

張艷榮（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油植物蛋白工程及功能食品。E-mail：xcpyfzx @163.com