張秀敏，景鳳霞，王海強，趙若瑋，張艷芬

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定　071002；2.河北大學 科學技術處，河北 保定　071002)

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藤黃微球菌rpf基因的克隆表達及其結構預測

張秀敏1，景鳳霞1，王海強1，趙若瑋1，張艷芬2

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定071002；2.河北大學 科學技術處，河北 保定071002)

為了了解藤黃微球菌(Micrococcusluteus)復蘇促進因子(resuscitation-promoting factor，Rpf)的性質，用自行設計的引物，以藤黃微球菌ACCC41016基因組DNA為模板，擴增rpf基因．隨后，構建pET-28a(+)-rpf表達載體，在EscherichiacoliBL21(DE3)中進行IPTG誘導表達，并以克隆測得的rpf基因核酸序列為基礎，對Rpf蛋白的氨基酸序列、疏水性、信號肽、磷酸化位點、三級結構以及結構功能域進行生物信息學預測分析．結果表明：該rpf基因與文獻報道的藤黃微球菌IAM 14879rpf基因核苷酸序列一致性為69.72%；該rpf基因所編碼蛋白的氨基酸序列與文獻報道的Rpf蛋白氨基酸序列一致性為63.44%．在E.coliBL21(DE3)中成功表達了Rpf目的蛋白．初步了解了Rpf蛋白的理化性質及生物學功能．解釋了Rpf蛋白能夠使細菌復蘇并促進其生長的理論，為進一步探討Rpf蛋白的作用機理奠定了基礎．

藤黃微球菌；復蘇促進因子(Rpf)；克??；表達；結構預測

1998 年，Mukamolova等[1]從藤黃微球菌(Micrococcusluteus)的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)一種能夠促進細菌復蘇的物質．他們將培養(yǎng)液的上清液滅菌處理后，加入到處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)的細菌培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)這些細菌能夠快速復蘇和生長，將培養(yǎng)液純化后發(fā)現(xiàn)了復蘇促進因子(resuscitation-promoting factor，Rpf)，命名為Rpf[2]．

Rpf是首次被發(fā)現(xiàn)的能促進休眠態(tài)的細菌復活同時促進其生長的因子，該因子是一種分泌蛋白，加熱情況下或經胰蛋白酶水解后會失去活性．Rpf能夠對結核分枝桿菌和處于休眠期的多種革蘭氏陽性細菌的復蘇和生長起到促進作用[3-7]．到目前為止，Rpf的作用機理尚待探索．

本實驗通過擴增得到藤黃微球菌rpf基因，并構建表達載體(pET-28a(+)-rpf)；利用IPTG誘導目的基因在EscherichiacoliBL21(DE3)中表達，SDS-PAGE檢驗蛋白表達情況；將克隆得到的rpf基因與丁林賢等[8]報道的rpf基因進行同源性比對，并通過生物信息學技術對2段基因進行翻譯，將得到的氨基酸序列進行結構、性質、功能等預測分析比較，得到了有價值的數據信息，為以后的研究奠定了基礎．

1　材料和方法

1.1材料

藤黃微球菌(M.luteus)ACCC41016，來自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)．

1.2方法

1.2.1藤黃微球菌基因組DNA的提取

采用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提?。?/p>

1.2.2藤黃微球菌rpf基因的擴增、克隆及測序

根據藤黃微球菌rpf基因序列(Z96935)自行設計5′端引入NdeI和BamHI限制性內切酶酶切位點的引物，上游引物rpfF：5’-CGAcatatgACCATGGACACCATGACTCTCTTCAC-3’，下游引物rpfR：5’-TCAggatccTCAGGCCTGCGGCAGGACGAGCTCCT-3’． 以藤黃微球菌基因組DNA為模板，擴增rpf基因．擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、45 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)；94 ℃變性1 min、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min．PCR產物經質量分數為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，進行測序．經測序確定的rpf基因片段與pMD18-T載體連接，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，然后涂布于LB平板(含質量濃度為100 mg/L的氨芐青霉素)，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，隨機篩選2個白色菌落，分別接種于5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒DNA，酶切進行驗證．經驗證正確的陽性克隆命名為pMD18-T-rpf．

1.2.3Rpf蛋白結構及性質預測

1)rpf基因核酸序列基本分析：使用核酸序列分析軟件BioEdit(版本號7.0.9.1)對已經過測序獲得的rpf基因核酸序列的堿基組成及堿基分布進行基本分析，并翻譯得到rpf全長基因的氨基酸序列；2)Rpf蛋白氨基酸序列的基本分析：使用瑞士生物信息學研究所(SIB)的ExPASy服務器 (http://www.expasy.org)上的ProtParam程序對Rpf蛋白的氨基酸數量、氨基酸組成等一些基本性質進行分析；3)Rpf蛋白疏水性的基本分析：使用瑞士生物信息學研究所(SIB)的ExPASy服務器 (http://www.expasy.org)上的ProtScale程序對Rpf蛋白肽鏈的疏水性進行基本分析；4)Rpf蛋白信號肽的預測分析：使用丹麥科技大學(DTU)CBS服務器(http://www.cbs.dtu.dk)上的SignalP 4.1程序對Rpf蛋白序列中信號肽的存在位點進行預測分析；5)Rpf蛋白亞細胞定位的預測分析：使用PSORT服務器(http://www.psort.org)上的PSORTb v.3.0程序對Rpf蛋白做亞細胞定位分析；6)Rpf蛋白三級結構的預測分析：使用瑞士生物信息學研究所(SIB)的ExPASy服務器(http://www.expasy.org)上的SWISS-MODEL Workspace程序對Rpf蛋白做同源建模分析；7)Rpf蛋白結構功能域的預測分析：使用NCBI上的Blast服務器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對Rpf蛋白氨基酸序列的保守區(qū)域進行保守區(qū)檢索，通過結構功能域預測分析Rpf蛋白結構功能組成；8)Rpf蛋白同源性分析對比：從NCBI基因數據庫檢索丁林賢[8]等人克隆得到的rpf基因(GenBank accession no:Z96935.2)序列，使用軟件BioEdit(版本號7.0.9.1)預測得到Rpf蛋白氨基酸序列信息，并利用DNAMAN軟件將其與本實驗預測得到的Rpf蛋白氨基酸序列進行比對分析．

1.2.4pET-28a(+)-rpf 融合蛋白表達載體的構建及融合蛋白的誘導表達

提取陽性克隆pMD18-T-rpf的質粒，經NdeI和BamHI雙酶切后，回收目的基因片段，取目的基因片段和同樣用NdeI和BamHI雙酶切的pET-28a(+)質粒大片段，用T4連接酶連接，轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，然后涂布于LB平板(含質量濃度為100 mg/L的卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，隨機篩選2個菌落，分別接種于5 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒DNA，酶切進行驗證．經驗證，rpf基因插入正確的陽性克隆，命名為pET-28a(+)-rpf．將pET-28a(+)-rpf陽性克隆子和帶有pET-28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)分別接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含質量濃度為100 mg/L的卡那霉素)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.6～0.8時，以終濃度為0.8 mmol/L的IPTG分別于20 ℃和37 ℃下誘導過夜，培養(yǎng)后的菌液倒入50 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，用去離子水重新懸浮后再次離心，收集菌體.取適量菌體加入300 μL的去離子水和等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer，用渦旋混合器懸浮，做好標記，煮沸5 min，12 000 r/min離心10 min，取20 μL上清液進行SDS-PAGE檢查，電泳條件為200 V恒壓．電泳結束后，用質量分數為0.1%的考馬斯亮藍R-250染液(含體積分數分別為45%、45%、10%的甲醇、水、冰醋酸，染色3 h，在脫色液(含體積分數分別為45%、45%、10%的甲醇、水、冰醋酸)中脫色2 h后觀察分析結果．

1.2.5Rpf蛋白的純化

將含有pET-28a(+)-rpf表達載體的E.coliBL21(DE3)20 ℃誘導后，獲取重組蛋白培養(yǎng)菌液，10 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入15 mL細胞裂解液和100 μL 濃度為100 mmol/L的PMSF(蛋白酶抑制劑)，懸浮混勻置于冰浴中.使用超聲波400 W功率進行破碎，每次工作5 s，間隔5 s，循環(huán)60次，直至菌體溶液變清澈為止.將破碎好的菌體4 ℃，10 000 r/min離心15 min，分離上清液和沉淀，分別取少量用300 μL 超純水和等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer懸浮，做好標記，煮沸5 min，用作SDS-PAGE電泳的檢測樣品；將離心得到的大部分沉淀重懸于His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)(康為世紀，CW0893S)的Binding Buffer中，盡量混勻使包涵體充分溶解，10 000 r/min離心20 min，收集上清液，經Ni-Argarose His標簽蛋白純化試劑盒洗脫純化并用SDS-PAGE檢測．

2　結果

2.1rpf基因的擴增、克隆和測序

應用上述合成的1對引物，以藤黃微球菌基因組為模板，擴增藤黃微球菌rpf基因序列，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，PCR擴增產物為800 bp左右的片段．將PCR擴增產物克隆于pMD18-T載體中，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑選經酶切鑒定正確的克隆pMD18-T-rpf(圖2)，送北京三博遠志生物技術有限公司進行測序．測序結果表明所得到的rpf目的片段為813 pb．將該基因序列提交到GenBank，獲得基因注冊號(accession number) 為KU504338．

1.rpf基因；M．Marker(bp).圖1　藤黃微球菌rpf基因的PCR擴增電泳Fig．1　PCR amplification electrophoresis figure of the rpf gene of Micrococcus luteus

1．pMD18-T-rpf 載體酶切后的片段；M．Marker(bp).圖2　pMD18-T-rpf質粒酶切鑒定圖譜Fig.2　Electrophoresis figure of pMD18-T-rpf vector digested

M．Marker(bp)；1．1#陽性克?。?2．2#陽性克隆(bp)．圖3　pET-28a(+)-rpf融合蛋白表達載體酶切電泳Fig．3　Electrophoresis figure of pET-28 a (+)-rpf fusion protein expression vector digested by restriction enzymes

2.2pET-28a(+)-rpf 融合蛋白表達載體的鑒定

將純化的重組質粒pMD18-T-rpf雙酶切后回收，與用相同酶切的pET-28a(+)質粒連接、轉化，隨機挑選2個克隆，提取質粒進行酶切驗證，結果表明，2個質粒均能酶切得到813 bp的片段(圖3)，將2#陽性克隆命名為pET-28a(+)-rpf．

2.3Rpf蛋白性質預測

2.3.1rpf基因核酸序列的基本分析結果

本實驗克隆得到的藤黃微球菌rpf基因序列長度為813 bp，“G+C”物質的量分數為73.40%，“A+T” 物質的量分數為26.60%．

2.3.2Rpf蛋白氨基酸序列的基本分析結果

本研究克隆得到的藤黃微球菌rpf基因中包括完整的編碼區(qū)序列807 bp，經過對其氨基酸序列的基本分析預測，翻譯得到的藤黃微球菌rpf基因氨基酸序列如圖4所示．

2.3.3Rpf蛋白疏水性的基本分析結果

從表1中可以看出，藤黃微球菌Rpf蛋白在18～37個氨基酸具有很強的疏水性，最高達1.922，推測這段序列可能是Rpf蛋白的信號肽序列；而在之后的序列中也陸續(xù)出現(xiàn)了幾個疏水性較強的氨基酸區(qū)域．

圖4　Rpf蛋白氨基酸序列Fig．4　Amino acid sequence of Rpf protein

氨基酸區(qū)域疏水性18～371.922125～1311.089211～2261.444255～2651.422

2.3.4Rpf蛋白信號肽的預測分析結果

通過對藤黃微球菌Rpf蛋白的預測分析，初步確定前40個氨基酸為信號肽(圖5)．

圖5　Rpf蛋白信號肽預測分析Fig．5　Signal peptide prediction analysis of Rpf protein

2.3.5Rpf蛋白亞細胞定位的預測分析結果

蛋白質正常行使功能的一個重要因素是蛋白質的亞細胞定位，因此確定藤黃微球菌Rpf蛋白的亞細胞定位對于Rpf蛋白的功能研究十分重要．根據預測分析結果(圖6)，藤黃微球菌Rpf蛋白在細胞質膜上的定位得分為9.87，在細胞壁上的定位得分為0.12，在細胞外的定位得分為0.01，在細胞質中的定位得分為0，由此可預測藤黃微球菌Rpf蛋白極大可能存在于細胞質膜上．

圖6　Rpf蛋白亞細胞定位預測分析Fig．6　Subcellular localization prediction analysis of Rpf protein

2.3.6Rpf蛋白結構功能域的預測分析結果

從圖7中可以看出，藤黃微球菌Rpf蛋白由2個結構功能域組成，分別是屬于溶菌酶超家族的轉糖基酶結構域(aa39～112)和屬于LysM結構域家族的LysM結構域(aa220～267)．LysM結構域為小球狀，有大約40個氨基酸，是一種廣泛存在的肽聚糖黏合蛋白功能域，該結構域最初發(fā)現(xiàn)在細菌細胞壁降解酶中，由此證明所克隆的目的基因可能編碼一種細菌細胞壁降解酶．

圖7　Rpf蛋白結構功能域預測分析Fig．7　Structure function domain forecast analysis of Rpf protein

2.3.7Rpf 蛋白的數據庫分析對比結果

利用DNAMAN軟件將丁林賢等[8]人報道的rpf基因(GenBank accession no.Z96935.2)和本研究克隆得到的藤黃微球菌rpf基因進行序列同源性分析，結果見圖8，經分析得知2段序列相似性為69.72%．

利用BioEdit(版本號7.0.9.1)對已報道的rpf基因(GenBank accession no.Z96935.2)進行翻譯得到其氨基酸序列，共有223個氨基酸，見圖9．將該氨基酸序列與本研究得到的氨基酸序列進行同源性對比，結果見圖10，經分析得知氨基酸序列相似性為63.44%．

圖8　已報道的rpf基因與本研究克隆得到的rpf基因對比分析結果Fig．8　Comparing results of nucleotide sequences between reported rpf gene and cloning rpf gene in this study

圖9　已報道的rpf基因氨基酸序列Fig．9　Reported rpf gene amino acid sequence

圖10　已報道的Rpf蛋白與本研究得到的Rpf蛋白氨基酸序列對比分析結果Fig．10　Comparing results of amino acid sequences between reported Rpf protein and Rpf fusion protein in this study

用DNAMAN軟件對已報道的rpf基因氨基酸序列和本研究得到的氨基酸序列進行疏水性比對，結果見表2，從表2可知，已報道的Rpf蛋白與本研究得到的Rpf蛋白的氨基酸序列均在18～37個氨基酸，具有很強的疏水性，推測這段序列可能是信號肽序列；而在之后的序列中也陸續(xù)出現(xiàn)了幾個疏水性較強的氨基酸區(qū)域．

表2　已報道的Rpf蛋白與本研究得到的Rpf蛋白氨基酸疏水性統(tǒng)計

利用SWISS-MODEL對已報道的Rpf蛋白氨基酸序列進行同源性建模，得到相似度最高的三維模型(圖11)，與本研究的Rpf蛋白預測的三維結構相似度極高，兩者都具有較多的α-helix結構，這可能與兩者的生物學功能相關，具有類似的生物學功能，但兩者也存在一定差異，報道的Rpf蛋白三維結構比本研究得到的Rpf蛋白三維結構多出2股α-helix，后者比前者在模型中心區(qū)域多出一部分無規(guī)則卷曲結構，這與兩者序列上的差異是分不開的．

a．文獻報道的Rpf 蛋白；b．本研究中的Rpf 蛋白.圖11　已報道的rpf基因編碼蛋白與本研究Rpf融合蛋白三級結構模型對比Fig．11　Comparison of tertiary structure model between reported Rpf protein and protein encoded by rpf in this study

利用NCBI上的Blast服務器對報道的rpf基因分析得到的氨基酸序列保守區(qū)域進行檢索(圖12)，并與本研究得到的蛋白進行結構功能域預測，比對發(fā)現(xiàn)，已報道的rpf基因編碼的蛋白也由2個結構功能域組成，分別是屬于溶菌酶超家族的轉糖基酶結構域(aa41～114)和屬于LysM結構域家族的LysM結構域(aa173～220)，與預測的本實驗的Rpf融合蛋白功能結構域完全吻合，只是所在氨基酸區(qū)域存在差別，見表3．

圖12　報道的rpf基因編碼蛋白的結構功能域預測Fig.12　Prediction of structure function domain of reported Rpf protein

功能域文獻報道的rpf基因(Z96935.2)編碼的蛋白的氨基酸位點本研究中的Rpf蛋白的氨基酸位點溶菌酶超家族轉糖基酶結構域41～11439～112LysM超家族LysM結構域173～220220～267

根據比對結果，發(fā)現(xiàn)本研究克隆得到的rpf基因與文獻中報道的基因序列(登錄號Z96935.2)在核酸序列和氨基酸序列同源性上相似性較高，分別為69.72%和63.44%，但仍然存在一定差別，本研究克隆得到的rpf基因在核酸序列和氨基酸序列水平上比文獻中報道的基因序列多出一部分序列，這部分序列存在于序列中部；但從比對結果來看，兩者在理化性質上不存在較大差異，三維結構也大致相同．

2.4Rpf蛋白的誘導表達及檢測

將攜帶有pET-28a(+)-rpf表達載體的E.coliBL21(DE3)和攜帶有pET-28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)分別在37 ℃和20 ℃經IPTG誘導后，用SDS-PAGE檢測分析，發(fā)現(xiàn)經20 ℃誘導的菌體裂解液的沉淀在35 ku處都有1條明顯的蛋白條帶(圖13)，同預計大小吻合．

2.5Rpf蛋白的誘導表達及檢測

經過Ni-Argarose His標簽蛋白純化試劑盒洗脫純化并用SDS-PAGE檢測后，得到了如圖14的結果.從圖14中，可以清楚地看出，蛋白洗脫液中含有清晰的目的條帶，且雜帶數量明顯減少，說明經過Ni-Argarose層析柱洗脫后得到了純度較高的Rpf蛋白，表達的重組Rpf蛋白為包涵體蛋白.

M．Marker(ku)；1． 20 ℃下誘導的含有pET-28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)菌體；2． 37 ℃下誘導的含有pET-28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)菌體； 3． 20 ℃下誘導的含有pET-28a(+)-rpf表達載體的E.coliBL21(DE3)菌體； 4． 37 ℃下誘導的含有pET-28a(+)-rpf表達載體的E.coliBL21(DE3)菌體．

圖13Rpf蛋白誘導表達的SDS-PAGE

Fig．13SDS-PAGE of Rpf protein induced expression

M．Marker(ku);1. 菌體；2． 細胞裂解液的上清液；3． 細胞裂解液沉淀；4． 流穿液；5、6． 蛋白洗脫液.圖14　純化的Rpf蛋白SDS-PAGEFig．14　SDS-PAGE of purified Rpf protein

3　討論

Rpf蛋白作用機理雖尚不明確，但Rpf蛋白具有細菌細胞壁溶解活性已被證實[9-10]．從比對的蛋白質結構功能域中發(fā)現(xiàn)，雖然兩者的2種功能結構域處于各自序列的不同位點，但它們所屬的結構域家族相同，都擁有溶菌酶超家族和LysM 超家族．溶菌酶超家族具有溶菌酶活性；LysM超家族LysM結構域最早是在芽孢桿菌噬菌體溶菌酶中被發(fā)現(xiàn)的，該酶通過降解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的糖苷鍵來降解細胞壁[11]，這表明2種蛋白質的理論生物學功能相似，均具有細胞壁溶解活性，這與已報道內容相同，證實了本實驗中克隆的rpf基因的正確性．

亞細胞定位結果顯示Rpf蛋白存在于細胞質膜上，因此它可以在細胞處于休眠狀態(tài)，細胞壁增厚時不斷溶解細胞壁，當延長培養(yǎng)時間后，Rpf蛋白將細胞壁完全溶解，釋放到培養(yǎng)液中．這一分析也解釋了Rpf蛋白能夠使細菌復蘇并促進其生長的理論．

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(責任編輯：趙藏賞)

Cloning and expression of Micrococcus luteus rpf gene and structure prediction of Rpf protein

ZHANG Xiumin1,JING Fengxia1,WANG Haiqiang1,ZHAO Ruowei1,ZHANG Yanfen2

(1.College of Life Scineces,Hebei University,Baoding 071002,China; 2.Office of Science and Technology,Hebei University,Baoding 071002,China)

In order to study the properties of resuscitation-promoting factor (Rpf) ofMicrococcusluteus，rpfgene (813 pb)was amplified by using genome DNA ofM.luteusACCC41016 as templates.pET-28a (+)-rpfexpression vector was constructed and Rpf protein was induced using IPTG to express inEscherichiacoliBL21(DE3).Based onrpfnucleic acid sequence,the bioinformation of Rpf protein,such as protein amino acid sequence,hydrophobic,signal peptide,phosphorylation sites,tertiary structure,structure and functional domains,were predicted by using bioinformatics method.The results showed that the identity of nucleotide sequences between the cloningrpfgene and the reportorialrpfgene was 69.72%.And the identity of amino acids sequences between the protein encoded by the cloningrpfgene and the reportorial Rpf protein was 63.44%.SDS-PAGE results confirmed that the expression ofrpfgene in theE.coliBL21 (DE3)was successful.According to the bioinformatics and homology analysis of Rpf protein,the physical and chemical properties and biological function of Rpf protein were preliminary elucidated.The study explained the theory of the Rpf protein can make the bacteria recovery and promote its growth.This laid the groundwork for further mechanistic studies of Rpf protein.

MicrococcusLuteus;resuscitation-promoting factor(Rpf)；clone；express； structure prediction

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.04.012

2016-04-13

國家自然科學基金資助項目(31270053)；河北省自然科學基金資助項目(C2014201141)；河北省生物工程重點學科建設經費資助項目(1050-5030023)；河北省高等學?？茖W技術研究資助項目(Z2015013)

張秀敏(1970—)，女，河北淶水人，河北大學教授，博士，主要從事微生物系統(tǒng)性及多樣性研究．

E-mail：zhxiumin1106@126.com

張艷芬(1979—)，女，河北邯鄲人，河北大學講師，主要從事分子生物學研究．

E-mail：zhangjing@hbu.edu.cn

Q939.13；

A

1000-1565(2016)04-0402-10