肖學(xué)敏 李誠讓 何艷艷 張曉峰 徐浩翔 王寶璽

350001福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科（肖學(xué)敏）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點實驗室 皮膚科（李誠讓、何艷艷、張曉峰、徐浩翔）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

·論著·

Nicastrin基因突變的反常性痤瘡患者皮損Notch-HES信號通路的表達

肖學(xué)敏 李誠讓 何艷艷 張曉峰 徐浩翔 王寶璽

350001福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科（肖學(xué)敏）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點實驗室 皮膚科（李誠讓、何艷艷、張曉峰、徐浩翔）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

目的 檢測nicastrin基因突變的反常性痤瘡患者皮損標本中，nicastrin及其下游Notch-HES信號通路蛋白的表達。方法 免疫組化法檢測nicastrin及Notch-HES信號通路分子在4例nicastrin基因突變的患者皮損石蠟標本的表達，并用6例正常皮膚組織作對照，同時采用Spearman相關(guān)分析，分析nicastrin與Notch-HES信號通路分子表達的相關(guān)性。結(jié)果 Nicastrin蛋白廣泛表達于表皮全層、皮膚附屬器,如,毛囊皮脂腺單位、大汗腺及小汗腺。在攜帶nicastrin基因突變的患者皮損中，表皮及毛囊漏斗部nicastrin表達較正常對照明顯減少；同時，Notch-HES信號通路分子表達亦較正常對照明顯減少。Nicastrin蛋白與Notch1、Notch3以及HES-1的表達呈明顯正相關(guān)（r分別為 0.831、0.748、0.807，P 值分別 <0.01，<0.05、<0.01），而與 Notch2、HES-5 的表達之間的相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（r分別為0.597和0.591，均P>0.05）。結(jié)論 Nicastrin基因突變患者的皮損中nicastrin低表達，且與多種Notch-HES信號通路分子表達呈正相關(guān)，提示nicastrin表達減少可能通過影響下游Notch-HES信號通路的表達參與反常性痤瘡的發(fā)病。

基因；突變；信號傳導(dǎo)；反常性痤瘡；Nicastrin基因；Notch-HES信號通路

反常性痤瘡（acne inversa,AI;OMIM 142690），又稱化膿性汗腺炎、毛囊閉鎖三聯(lián)征，是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病。2010 年，Wang等［1］發(fā)現(xiàn)，γ 分泌酶與部分家族性AI相關(guān)引起了學(xué)術(shù)界的極大興趣。γ分泌酶是一種跨膜蛋白酶，包含4個必要組分，分別為：早老素、nicastrin（NCT）蛋白、前咽缺陷蛋白、早老素增強子。目前文獻中共報道AI患者的γ分泌酶基因上發(fā)現(xiàn)27個不同的突變位點，其中出現(xiàn)在NCT基因上的突變有22個，均為功能缺失性突變［2-4］。NCT亞基屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩(wěn)定。最近發(fā)現(xiàn)，NCT亞基還具有募集γ分泌酶底物的功能，其表達異常可導(dǎo)致γ分泌酶活性和功能受損［5］。然而，NCT基因突變的AI患者皮損NCT蛋白的表達情況與正常人是否存在差異，未見文獻報道。同時，Notch蛋白作為γ分泌酶的重要底物在AI發(fā)病中的作用越來越受到重視［2］。在NCT基因突變的AI患者中，NCT基因的突變能否導(dǎo)致Notch信號通路表達異常亦未見文獻報道。本研究在4例含有NCT基因突變的AI患者皮損中使用免疫組化法檢測了NCT蛋白及其下游信號通路中的Notch、HES分子的表達，并探討NCT基因突變導(dǎo)致AI的可能機制。

對象與方法

一、對象

AI患者組：4例患者均符合 AI的診斷標準［6］，其中男3例，女1例，年齡24～29歲，平均27.3歲；病程3～10年，平均6.3年。發(fā)病部位：腋下3/4例、肛周及臀部4/4例、腹股溝3/4例、會陰3/4例、頸部4/4例。根據(jù)Hurley分級對患者皮損進行評估［7］：Ⅰ級是膿腫形成，不伴竇道及瘢痕，Ⅱ級是一處或多處孤立的膿腫，伴竇道及瘢痕，Ⅲ級是融合的膿腫及竇道形成。本組患者3例Hurley分級為Ⅲ級，1例為Ⅱ級；4例患者均已證實含有NCT基因突變，其中3例有家族史，1例為散發(fā)患者；3例男性患者均有長期吸煙史。AI患者2例皮損組織切片來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院病理科存檔的石蠟塊，2例皮損組織切片來自手術(shù)室切除AI患者皮損制作石蠟塊。取材部位為臀部2例、腋下1例、頸部1例。

正常對照組：2例皮膚組織切片來自江蘇省人民醫(yī)院整形外科腋臭切除術(shù)的患者正常皮膚制作石蠟塊，4例皮膚組織切片來自本院行整形外科手術(shù)患者的正常皮膚制成的石蠟塊（臀部及頭皮各2例），其中男3例、女3例，年齡18～29歲，平均23.8歲。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，入選患者及正常對照者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

兔抗人NCT多克隆抗體（工作濃度1∶1 600）、兔抗人Notch1單克隆抗體（1∶600）、兔抗人Notch2多克隆抗體（1∶400）、兔抗人Notch3多克隆抗體（1∶2 000）、兔抗人 HES-5多克隆抗體（1∶1 200）均購自美國Abcam公司；兔抗人HES-1單克隆抗體（1∶2 500）購自美國Cell Signaling公司。即用型免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒及蘇木素體細胞染色液均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

三、免疫組化法

所有標本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)切成4 μm薄片，置于防脫載玻片上；在58～60℃條件下烤片2 h，二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化；用稀釋后的1×檸檬酸組織抗原修復(fù)液高壓3 min進行抗原修復(fù)，PBS清洗后加過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，PBS清洗后非免疫羊血清孵育10 min，除去血清后滴加適當稀釋的一抗，4℃孵育過夜；PBS清洗后滴加生物素標記的二抗IgG，孵育10 min后清洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，0.5%鹽酸乙醇分化后中性樹膠封片。已知陽性片作陽性對照，PBS替代一抗作陰性對照。所有樣本染色條件相同，每批染色均有陽性對照、陰性對照。

四、結(jié)果判定

由兩位病理醫(yī)師分別隨機選擇5個不連續(xù)高倍鏡視野計數(shù)，細胞內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒者判斷為陽性細胞。結(jié)合著色強度和陽性細胞百分比進行結(jié)果判定。著色強度計分：基本無著色計0分，著色弱陽性計1分，中度陽性計2分，強陽性計3分；陽性細胞百分比計分：每個高倍鏡視野下分別計數(shù)100個細胞，陽色細胞所占細胞總數(shù)的百分比均值：＜5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，＞50%計3分。以兩者的乘積為最后得分：陰性（-）為0分，弱陽性（+）為1～2分，陽性（++）為 3～4分，強陽性（+++）為 5 分以上［8］。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，NCT與Notch-HES信號分子之間的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、NCT蛋白在正常皮膚的表達

NCT蛋白廣泛表達于正常表皮全層、皮膚附屬器如，毛囊上皮、皮脂腺、大汗腺及小汗腺。免疫組化顯示其陽性著色部位為胞質(zhì)（圖1）。

二、NCT蛋白在正常對照皮膚及患者皮損的表達差異

在正常毛囊上皮中，NCT蛋白在毛囊漏斗部高表達；AI皮損處毛囊口擴張，可見毛囊角栓，毛囊漏斗部NCT蛋白低表達（圖2A，2B）。AI皮損表皮肥厚，表皮突鋸齒狀延長呈銀屑病樣增生，且NCT蛋白的表達水平較正常表皮明顯較少（圖2C，2D）。

三、Notch-HES信號通路在患者皮損及正常對照皮膚的表達差異

Notch1、Notch2、Notch3 的陽性著色部位為胞質(zhì)、可有少量胞核的陽性表達；核因子HES-1及HES-5的陽性著色部位為胞核，代表其活化狀態(tài)。Notch-HES信號分子在正常表皮全層均有表達；皮損中 Notch1、Notch2、Notch3、HES-1 及 HES-5 的表達水平較對照正常表皮明顯減少。見圖3，表1。

四、NCT蛋白與Notch-HES信號通路分子表達的相關(guān)性分析

NCT 蛋白與 Notch1（r=0.831，P<0.01）、Notch3（r=0.748，P<0.05） 以及 HES-1（r=0.807，P<0.01）的表達呈明顯正相關(guān)，NCT蛋白與Notch2（r=0.597，P=0.069）、HES-5（r=0.591，P=0.072）的表達之間的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

圖1 NCT蛋白廣泛表達于正常表皮全層（1A）、皮膚附屬器如毛囊上皮和皮脂腺（1B）、大汗腺（1C）及小汗腺（1D），陽性著色部位為胞質(zhì)（1A、1C、1D免疫組化×200；1B：×100） 圖2 NCT蛋白在正常對照（2A）與皮損處（2B）毛囊皮脂腺單位的表達（免疫組化×100）；NCT蛋白在正常對照（2C）與皮損處（2D）表皮的表達（免疫組化×200）

本研究結(jié)果表明，NCT蛋白廣泛表達于表皮全層、皮膚附屬器如，毛囊上皮、皮脂腺、大汗腺及小汗腺。目前公認，AI的始動因素是毛囊漏斗部位的角化過度及栓塞，而大汗腺受累僅是繼發(fā)現(xiàn)象［9］。本研究顯示，在正常毛囊上皮中，NCT蛋白在毛囊漏斗部高表達，而在皮損標本中，NCT在毛囊漏斗部的表達較正常對照明顯減少。因此，我們推測，NCT蛋白功能缺失性突變可能導(dǎo)致毛囊漏斗部角質(zhì)形成細胞的NCT蛋白表達缺失，從而誘發(fā)毛囊漏斗部的異常角化，最終出現(xiàn)毛囊口擴張及毛囊角栓。另外，表皮增生是AI的一個新發(fā)現(xiàn)的組織學(xué)特征；本研究還發(fā)現(xiàn)，在NCT蛋白功能缺失性突變患者的皮損中，表皮肥厚，表皮突鋸齒狀延長呈銀屑病樣增生，且NCT蛋白的表達水平較正常表皮明顯減少。

Notch 蛋白包括，Notch1-4，Notch 配體包括Jagged1、Jagged2和3種 Delta樣蛋白（DLL-1,-3,-4）。Notch蛋白與鄰近細胞配體結(jié)合活化后，γ分泌酶在膜平面切割蛋白，將胞內(nèi)功能域NICD（Notch intracellular domain）釋放入胞質(zhì)并入核。在核內(nèi)，NICD與細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合并使之活化，激活下游靶基因HES-1（hairy enhancer of split-1）等的轉(zhuǎn)錄［10］。既往研究中證實，Notch1、Notch2、Notch3在正常表皮中全層均有表達，本研究發(fā)現(xiàn)，其靶基因HES-1及HES-5在正常表皮中亦廣泛表達［11］。本研究結(jié)果表明，在NCT蛋白突變患者的皮損中，其Notch-HES信號分子的表達水平較對照正常表皮明顯減少，且表達的減少程度與NCT蛋白表達的減少水平呈正相關(guān)；由于HES-1及HES-5是Notch通路直接作用的效應(yīng)分子，其表達下降表明Notch信號通路活性降低［12］。

圖3 Notch-HES信號通路分子在正常對照及患者皮損的表達差異 Notch1、Notch2、Notch3的陽性著色部位為胞質(zhì)、可有少量胞核的陽性表達；核因子HES-1及HES-5的陽性著色部位為胞核（3A～3E為正常對照；3F～3J為皮損，免疫組化×200）

表1 nicastrin（NCT）蛋白與Notch-HES信號通路分子在患者皮損及正常對照表皮的表達

Notch信號通路在維持表皮角質(zhì)形成細胞及毛囊外毛根鞘細胞正常增殖和分化是必須的［13］。AI的一個重要組織病理學(xué)特征是表皮囊腫的形成［14］。缺乏γ分泌酶可使外毛根鞘細胞向表皮細胞分化，導(dǎo)致毛囊轉(zhuǎn)化為表皮囊腫；在Notch通路缺陷的小鼠中也出現(xiàn)了類似的表現(xiàn)，即毛囊終末分化缺陷，被表皮囊腫所替代［15］。因此，NCT蛋白功能缺失性突變下調(diào)Notch信號通路，導(dǎo)致異常的外毛根鞘角化可能在本病發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。同時，Notch1表達缺失可促進復(fù)層鱗狀上皮增殖；AI患者和Notch1基因缺陷的小鼠皮損都出現(xiàn)了毛囊間表皮銀屑病樣異常增殖的組織學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述，本研究在NCT蛋白功能缺失性突變的AI患者皮損中檢測NCT蛋白及其下游Notch、HES信號分子的表達，表明NCT蛋白功能缺失性突變可導(dǎo)致Notch信號通路表達異常。結(jié)合文獻，我們提出一個設(shè)想：NCT蛋白功能缺失性突變導(dǎo)致γ分泌酶及其下游Notch信號通路表達及活性受損可使毛囊漏斗部異常角化（毛囊角栓）及表皮囊腫形成，膨脹的毛囊漏斗部及表皮囊腫破裂釋放的內(nèi)容物可繼發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)，而Notch信號通路受損使其無法有效地抑制激活的自身免疫反應(yīng)，加之肥胖及皺褶部位的摩擦、機械性壓力等誘發(fā)因素都可進一步損害Notch信號通路，導(dǎo)致病情的加重以及遷延，形成竇道及瘢痕，可解釋AI的主要病理改變和危險因素［10，14］。

志謝 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所姜祎群主任醫(yī)師、萬川博士

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Expression of the Notch-HES signaling pathway in lesions of patients with acne inversa harbouring nicastrin gene mutations

Xiao Xuemin,Li Chengrang,He Yanyan,Zhang Xiaofeng,Xu Haoxiang,Wang Baoxi

Department of Dermatology,Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China（Xiao XM）;Department of Dermatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China（Li CR,He YY,Zhang XF,Xu HX）;Department of Dermatology,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China（Wang BX）

Objective To measure expressions of nicastrin and its downstream Notch-HES signaling pathwayassociated proteins in skin lesions of patients with acne inversa harbouring nicastrin gene mutations.Methods An immunohistochemical study was performed to measure the expressions of nicastrin and Notch-HES signaling pathwayassociated proteins in paraffin-embeded skin samples from lesions of 4 patients with acne inversa and confirmed nicastrin mutations and from normal skin of 6 human controls.Spearman correlation analysis was carried out to assess the relationship between the expressions of nicastrin and Notch-HES signaling pathway-associated proteins.Results In normal control skin samples,nicastrin was widely distributed in the full-thickness epidermis and skin appendages such as pilosebaceous units,apocrine glands and eccrine glands.However,the expressions of nicastrin and Notch-HES signaling pathway-associated proteins were markedly decreased in the epidermis and hair follicle infundibulum in lesions of patients harbouring nicastrin gene mutations compared with normal control skin.Furthermore,nicastrin expression was positively correlated with Notch1,Notch3 and HES-1 expressions（r=0.831,0.748 and 0.807,P<0.01,0.05 and 0.01 respectively）,but not significantly correlated with Notch2 or HES-5 expressions （r=0.597,0.591 respectively,bothP>0.05）.Conclusion Nicastrin expression markedly decreases in lesions of patients with acne inversa harbouring nicastrin gene mutations,and is positively correlated with the expressions of several Notch-HES signaling pathway-associated proteins,suggesting that the decrease in nicastrin expression may take part in the pathogenesis of acne inversa by influencing the expression of the downstream Notch-HES signaling pathway.

Genes;Mutation;Signal transduction;Acne inversa;Nicastrin gene;Notch-HES signaling pathway

s:Xu Haoxiang,Email:xbpipi@163.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

徐浩翔，Email：xbpipi@163.com；王寶璽，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.012

國家自然科學(xué)基金（81472905、81472872、81101207）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金（3332013056、33320140048）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472905，81472872，81101207）;PUMC Youth Fund（3332013056，33320140048）

2015-07-13）

（本文編輯：吳曉初）