陳蘭 榮冬蕓 吳春維 曹煜

550001貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

依維莫司和AR-A014418聯(lián)合使用促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞A375的凋亡

陳蘭 榮冬蕓 吳春維 曹煜

550001貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

目的 探討同時抑制mTORC1激酶和GSK-3β激酶活性對黑素瘤細(xì)胞4EBP1的磷酸化、帽子依賴翻譯、細(xì)胞存活和凋亡的影響。方法 分別采用二甲基亞砜（DMSO組）、5 nmol/L依維莫司（依維莫司組）、10 μmol/L AR-A014418（AR-A014418組）、5 nmol/L 依維莫司聯(lián)合 10 μmol/L AR-A014418（聯(lián)合處理組）處理A375細(xì)胞，Western印跡法檢測4EBP1的磷酸化和生存素蛋白的表達(dá)，m7GTP pull-down實驗檢測eIF4E和eIF4G的相互作用，CCK8法和流式細(xì)胞儀分別檢測A375細(xì)胞的增殖和凋亡。結(jié)果 依維莫司和AR-A014418對4EBP1磷酸化和生存素蛋白表達(dá)均有一定的抑制作用，兩組p4EBP1-65分別為0.74±0.05和0.62±0.06，生存素蛋白分別為0.71±0.06和0.58±0.07，與DMSO組（分別為1.00±0.07和1.00±0.06）相比，均P＜0.001，且聯(lián)合處理組對4EBP1磷酸化（0.14±0.04）和生存素蛋白表達(dá)（0.09±0.05）的抑制更為顯著。m7GTP pull-down實驗顯示，依維莫司組（0.72±0.04）、AR-A014418組（0.67±0.05）、聯(lián)合處理組（0.12±0.05）eIF4G 相對值均低于DMSO 組（1.00±0.06），而4EBP1相對值均高于DMSO 組（分別為 1.98±0.16、2.32±0.17、7.58±0.25、1.00±0.08），且聯(lián)合處理組eIF4G降低和4EBP1增加最為顯著。培養(yǎng)24 h時，與DMSO組相比，依維莫司、ARA014418、依維莫司聯(lián)合AR-A014418均對A375細(xì)胞增殖有抑制作用（后3組抑制率分別為18.5%±1.3%、19.8%±1.8%、61.2%±2.1%），且聯(lián)合處理組的抑制作用最為顯著；培養(yǎng)48 h時，依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞增殖的抑制顯示相同的趨勢，且其抑制作用隨時間的延長而增強。流式細(xì)胞儀檢測顯示，依維莫司和AR-A014418單獨處理A375細(xì)胞24 h對其凋亡有一定的促進(jìn)作用（凋亡率分別為14.28%±2.18%、14.57%±2.35%），聯(lián)合處理時細(xì)胞凋亡更為顯著，凋亡率為55.18%±6.27%。結(jié)論 聯(lián)合使用依維莫司和AR-A014418顯著抑制A375細(xì)胞中4EBP1的磷酸化，進(jìn)而抑制eIF4F蛋白復(fù)合物的形成，從而抑制帽子依賴的翻譯，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的凋亡。

黑色素瘤，實驗性；細(xì)胞凋亡；糖原合成酶激酶3；生存素；依維莫司；4E結(jié)合蛋白1；帽子依賴翻譯

帽子依賴的翻譯（cap-dependent translation）在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［1］。生存素是腫瘤細(xì)胞中重要的凋亡抑制蛋白，研究表明，生存素蛋白的翻譯受帽子依賴的翻譯調(diào)控［2］。細(xì)胞內(nèi)部帽子依賴的翻譯受真核細(xì)胞起始因子4F（eukaryotic initiation factor-4F，eIF4F）調(diào)控，eIF4F 蛋白復(fù)合物由eIF4E、eIF4A和eIF4G組成，而eIF4F的形成受真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-binding protein-1，4EBP1） 調(diào)控，即未磷酸化的4EBP1能夠與eIF4E結(jié)合，抑制eIF4E和eIF4G相互作用，進(jìn)而抑制eIF4F蛋白復(fù)合物的形成，而磷酸化的4EBP1不能與eIF4E結(jié)合，解除了對eIF4F蛋白復(fù)合物形成的抑制作用［3-4］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）作為4EBP1的激酶已經(jīng)受到廣泛而深入的研究［5-7］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）激酶可以通過與4EBP1之間的相互作用直接磷酸化4EBP1，進(jìn)而解除非磷酸化的4EBP1對eIF4F蛋白復(fù)合物功能的抑制作用，從而促進(jìn)受帽子依賴翻譯調(diào)控的腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體外增殖和裸鼠體內(nèi)成瘤能力［8］。本研究通過協(xié)同抑制mTORC1激酶和GSK-3β激酶活性來抑制黑素瘤細(xì)胞的生長，使用mTORC1激酶抑制劑依維莫司（RAD001）和GSK-3β激酶抑制劑AR-A014418聯(lián)合處理黑素瘤細(xì)胞A375，檢測4EBP1磷酸化及eIF4F蛋白復(fù)合物的變化情況，并檢測細(xì)胞的生長和凋亡情況。

材料與方法

一、細(xì)胞株及主要試劑

人黑素瘤細(xì)胞株A375由本實驗室保存。依維莫司和AR-A014418（美國Selleck公司），m7GTP瓊脂糖株（美國 Sigma公司），Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），AnnexinVFITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），4EBP1抗體、磷酸化4EBP1（Ser65）抗體、eIF4E抗體、eIF4G抗體和c-Parp抗體（美國Cell Signaling Technology公司），Tubulin抗體（美國Santa Cruz公司）。

二、實驗分組及處理

6孔或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)A375細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別用DMSO（DMSO組）、5 nmol/L依維莫司（依維莫司組）、10 μmol/L AR-A014418（ARA014418 組）、5 nmol/L 依維莫司聯(lián)合 10 μmol/L AR-A014418（聯(lián)合處理組）處理細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱孵育，然后進(jìn)行相關(guān)檢測。

三、Western印跡法檢測磷酸化4EBP1和生存素蛋白的表達(dá)

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種5×104個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按上述方法處理各組細(xì)胞。各組細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后用冰冷的PBS清洗3次，使用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，冰上靜置30 min，4℃10 000×g離心10 min，收集上清液。蛋白樣品與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按4∶1的比例混合，沸水浴加熱5～10 min。冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。封閉結(jié)束后將硝酸纖維素膜置于含5%脫脂奶粉以一定濃度稀釋的一抗搖動孵育，TBST洗膜3次后孵育二抗（辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG），TBST洗膜3次，ECL底物發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色。采用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，以Tubilin作為內(nèi)參對磷酸化4EBP1和生存素蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。

四、m7GTP pull-down實驗

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種5×104個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁，按上述方法處理各組細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后用冷PBS清洗3次，1 ml細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞25～35 min，4℃10 000×g離心10 min，取上清液加入m7GTP瓊脂糖株15 μl，4℃翻轉(zhuǎn)混合孵育3 h，4℃500×g離心3 min，棄上清液，離心收集m7GTP瓊脂糖株，用結(jié)合緩沖液洗滌沉淀物3次，每次10 min。4℃500×g離心后，加入2×SDS蛋白上樣緩沖液20μl，沸水浴加熱5～10min，離心取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，Western印跡法檢測4EBP1、eIF4E和eIF4G的蛋白表達(dá)，以未進(jìn)行pull-down的蛋白裂解液Lysate作為內(nèi)參，比較藥物處理后eIF4F蛋白復(fù)合物功能活性的變化。

五、CCK8法檢測細(xì)胞活性

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種2 000個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按上述方法處理各組細(xì)胞。各組分別于培養(yǎng) 24、48 h后，每孔加入 CCK8溶液 10 μl，再將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度（A值）。每個時間點平行做3個孔，實驗重復(fù)3次。

六、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞培養(yǎng)液到離心管內(nèi)備用，PBS清洗細(xì)胞后將PBS加入離心管中，加入0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化液1 ml，置于CO2培養(yǎng)箱靜置2 min左右，待細(xì)胞變圓，彼此不連接為止，加入3 ml新鮮培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞收集到離心管內(nèi)。300×g離心5 min，棄去上清液后用PBS洗滌細(xì)胞2次，500×g離心 5 min，棄去上清液后用 500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl碘化丙啶和5 μl Annexin V-FITC混勻，避光室溫孵育10 min。在488 nm激發(fā)波長處用流式細(xì)胞儀通過FITC通道檢測Annexin V-FITC的綠色熒光和PI通道檢測PI紅色熒光（在染色后1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測）。使用正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照進(jìn)行熒光補償調(diào)節(jié)。

表1 依維莫司和AR-A014418對真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）磷酸化和生存素蛋白表達(dá)的抑制作用（±s）

表1 依維莫司和AR-A014418對真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）磷酸化和生存素蛋白表達(dá)的抑制作用（±s）

注：n=3

組別 p4EBP1-65 生存素 4EBP1 DMSO組 1.00±0.07 1.00±0.06 1.00±0.09依維莫司組 0.74±0.05 0.71±0.06 0.94±0.08 AR-A014418組 0.62±0.06 0.58±0.07 1.06±0.07聯(lián)合處理組 0.14±0.04 0.09±0.05 0.91±0.08 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05

七、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、依維莫司和AR-A014418對4EBP1磷酸化和生存素蛋白表達(dá)的抑制作用

Western印跡結(jié)果顯示，依維莫司組、AR-A014418組、聯(lián)合處理組p4EBP1-65、生存素蛋白表達(dá)均較DMSO組降低（均P＜0.05），而4組間4EBP1的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1，圖1、2。析因分析顯示，依維莫司和AR-A014418對4EBP1磷酸化和生存素表達(dá)均有一定的抑制作用（p4EBP1-65：F=154.231、193.634；生存素：F=115.2、213.4；均P＜0.001），且依維莫司與AR-A014418對4EBP1磷酸化和生存素蛋白表達(dá)的抑制有交互作用（F=16.321、25.691，P=0.004、0.001），根據(jù)相加模型判斷為正交互作用。

圖1 Western印跡法檢測p4EBP1蛋白的表達(dá) 1～4：分別為DMSO組、依維莫司組、AR-A014418組、聯(lián)合處理組。依維莫司組和AR-A014418組p4EBP1-65相對值有一定降低，而聯(lián)合處理組顯著降低

圖2 Western印跡法檢測生存素蛋白的表達(dá) 1～4：分別為DMSO組、依維莫司組、AR-A014418組、聯(lián)合處理組。依維莫司組和AR-A014418組生存素蛋白表達(dá)有一定降低，而聯(lián)合處理組顯著降低

二、m7GTP pull-down實驗檢測依維莫司和ARA014418對eIF4E和eIF4G之間相互作用的影響

依維莫司組、AR-A014418組、聯(lián)合處理組eIF4G相對值均較DMSO組降低，且聯(lián)合處理組下降最為明顯；而4EBP1相對值又均較DMSO組增加，聯(lián)合處理組增加最為明顯；eIF4E相對值與DMSO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖3。

表2 m7GTP pull-down實驗檢測依維莫司和AR-A014418對eIF4E和eIF4G相互作用的影響（±s）

表2 m7GTP pull-down實驗檢測依維莫司和AR-A014418對eIF4E和eIF4G相互作用的影響（±s）

注：n=3

組別 eIF4G 4EBP1 eIF4E DMSO組 1.00±0.06 1.00±0.08 1.00±0.09依維莫司組 0.72±0.04 1.98±0.16 1.07±0.07 AR-A014418組 0.67±0.05 2.32±0.17 1.04±0.11聯(lián)合處理組 0.12±0.05 7.58±0.25 1.09±0.12

圖3 m7GTP pull-down實驗檢測依維莫司和AR-A014418對eIF4E和eIF4G之間的相互作用的影響 1～4：分別為DMSO組、依維莫司組、AR-A014418組、聯(lián)合處理組。與DMSO組相比，依維莫司和AR-A014418均可促進(jìn)4EBP1的合成，抑制eIF4G的合成，且聯(lián)合處理組對4EBP1的促進(jìn)和eIF4G的抑制更顯著

三、依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞增殖的抑制作用

培養(yǎng)24 h時，與DMSO組相比，依維莫司、ARA014418、依維莫司聯(lián)合AR-A014418均對A375細(xì)胞增殖有抑制作用，聯(lián)合處理組的抑制作用最為明顯；培養(yǎng)48 h時，與DMSO組相比，依維莫司、ARA014418、依維莫司聯(lián)合AR-A014418依然對A375細(xì)胞增殖有抑制作用，聯(lián)合處理組的抑制作用最為明顯，且依維莫司和AR-A014418對細(xì)胞增殖的抑制隨時間的延長而增強。見圖4。

析因分析顯示，24、48 h時依維莫司和ARA014418均對細(xì)胞增殖有抑制作用（依維莫司：F24h=117.69，F(xiàn)48h=397.629；AR-A014418：F24h=375.09，F(xiàn)48h=736.38；均P＜0.001）；依維莫司和 ARA014418對細(xì)胞增殖的抑制有交互作用（F24h=77.241，F(xiàn)48h=19.817，均P＜ 0.001），根據(jù)相加模型判斷為正交互作用。

圖4 依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞增殖的抑制作用依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞的增殖活性均有抑制作用，而聯(lián)合處理組的抑制作用更為顯著

圖5 依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞的凋亡均有一定的促進(jìn)作用，聯(lián)合處理組對A375細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更為顯著

析因分析顯示，依維莫司和AR-A014418均對4EBP1有明顯的促進(jìn)作用（F=139.2、258.4，均P＜0.001），且兩者有交互作用（F=15.325，P＜ 0.001），根據(jù)相加模型判斷為正交互作用。

依維莫司和AR-A014418均可抑制eIF4G的表達(dá)（F=217.5、352.4，均P＜ 0.001），且兩者有交互作用（F=27.145，P＜ 0.001），根據(jù)相加模型判斷為正交互作用。

四、依維莫司和AR-A014418對A375細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見圖5，依維莫司和AR-A014418單獨處理A375細(xì)胞24 h對其凋亡有一定的促進(jìn)作用（凋亡率分別為14.28%±2.18%、14.57%±2.35%），聯(lián)合處理時凋亡率為55.18%±6.27%。析因分析顯示，依維莫司和AR-A014418均可促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡（F=86.006、88.146，均P＜0.001），且兩者有交互作用（F=45.96，P＜0.001），根據(jù)相加模型判斷為正交互作用。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E蛋白在黑素瘤臨床組織標(biāo)本中表達(dá)升高，且eIF4E蛋白的表達(dá)與黑素瘤的惡性程度呈正相關(guān)［9-10］；最近的研究發(fā)現(xiàn)，RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活能通過抑制miR-768-3p的表達(dá)調(diào)控eIF4E蛋白表達(dá)，促進(jìn)帽子依賴的翻譯，從而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖和存活［11］。因此，帽子依賴的翻譯可以作為治療黑素瘤的重要靶點。

我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用mTORC1激酶抑制劑依維莫司和GSK-3β激酶抑制劑AR-A014418能夠顯著抑制4EBP1的磷酸化，而非磷酸化的4EBP1能夠與eIF4G競爭性結(jié)合eIF4E，從而抑制eIF4F蛋白復(fù)合物的形成。我們隨后采用m7GTP pull-down實驗檢測依維莫司和AR-A014418對eIF4E和eIF4G相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)依維莫司和ARA014418均可促進(jìn)4EBP1的合成，抑制eIF4G的合成，且聯(lián)合處理組對4EBP1的促進(jìn)和eIF4G的抑制更顯著，從而抑制4EBP1磷酸化，促進(jìn)4EBP1與eIF4E結(jié)合，抑制eIF4E和eIF4G之間相互作用，從而抑制eIF4F蛋白復(fù)合物的形成。由于eIF4F蛋白復(fù)合物能夠通過細(xì)胞存活促進(jìn)基因（如Mcl1、Bcl2和生存素等）的蛋白翻譯起始，從而促進(jìn)細(xì)胞存活［12］，因此我們使用依維莫司和AR-A014418聯(lián)合處理黑素瘤細(xì)胞A375后檢測細(xì)胞的存活和凋亡，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制A375細(xì)胞存活，促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。生存素是腫瘤細(xì)胞中重要的凋亡抑制蛋白，研究表明，生存素蛋白的翻譯受eIF4F蛋白復(fù)合物調(diào)控［13］。檢測依維莫司和AR-A014418聯(lián)合處理A375細(xì)胞后生存素蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與依維莫司或AR-A014418單獨作用相比，聯(lián)合使用能夠顯著抑制A375細(xì)胞中生存素蛋白的表達(dá)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，依維莫司和AR-A014418聯(lián)合使用可協(xié)同抑制4EBP1的磷酸化，進(jìn)而抑制eIF4F蛋白復(fù)合物的形成，抑制帽子依賴的翻譯，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的凋亡。這些研究結(jié)果提示，將來在臨床用藥中可以采用聯(lián)合使用依維莫司和ARA014418的方式抑制黑素瘤，以增強雷帕霉素衍生物依維莫司的腫瘤殺傷效果，克服黑素瘤細(xì)胞雷帕霉素耐藥性的產(chǎn)生。

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Everolimus together with AR-A014418 induces apoptosis of A375 melanoma cells

Chen Lan,Rong Dongyun,Wu Chunwei,Cao Yu
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550001,China

ObjectiveTo evaluate effects of simultaneous inhibition of mammalian target of rapamycin complex 1（mTORC1）kinase and glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）on phosphorylation of 4E-binding protein-1（4EBP1）,cap-dependent translation,as well as survival and apoptosis of melanoma cells.MethodsCultured A375 cells were classified into several groups to be treated with dimethyl sulfoxide （DMSO group）,the mTORC1 kinase inhibitor everolimus at a concentration of 5 nmol/L （everolimus group）,the GSK-3β kinase inhibitor AR-A014418 at a concentration of 10 μmol/L （AR-A014418 group）,or 5 nmol/L everolimus and 10 μmol/L AR-A014418（combined treatment group）.After additional culture,Western-blot analysis was performed to measure protein expressions of phosphorylated 4EBP1 （p4EBP1）and survivin in A375 cells,m7GTP pull down assay to estimate interaction between eukaryotic initiation factor-4E （eIF4E）and eIF4G,cell counting kit 8 （CCK8）assay to evaluate cell proliferation,and flow cytometry to detect cell apoptosis.ResultsBoth everolimus and AR-A014418 had inhibitory effects on 4EBP1 phosphorylation and survivin expression.The expressions of p4EBP1-65 and survivin were both significantly decreased in the everolimus group（0.74±0.05 and 0.71±0.06 respectively）,AR-A014418 group（0.62±0.06 and 0.58±0.07 respectively）and combined treatment group （0.14±0.04 and 0.09±0.05 respectively）compared with the DMSO group（1.00±0.07 and 1.00±0.06,respectively,allP＜0.001）,with the most significant decrease observed in the combined treatment group.As m7GTP pull-down assay showed,the everolimus group,AR-A014418 group and combined treatment group all showed significantly lower relative expression levels of eIF4G（0.72±0.04,0.67±0.05 and 0.12±0.05 vs.1.00±0.06,allP＜0.001）,but significantly higher relative expression levels of 4EBP1（1.98±0.16,2.32±0.17 and 7.58±0.25 vs.1.00±0.08,allP＜0.001）than the DMSO group,and the combined treatment group showed the lowest eIF4G expression but highest 4EBP1 expression.After 24-hour culture,the proliferation of A375 cells was inhibited by 18.5%±1.3%in the everolimus group,19.8%±1.8%in the AR-A014418 group,and 61.2%±2.1%in the combined treatment group compared with the DMSO group,with the strongest inhibition noted in the combined treatment group.The inhibitory effects of everolimus and AR-A014418 on cell proliferation increased over time,and showed the same trend at 48 hours.Flow cytometry showed that the apoptosis of A375 cells was accelerated by the 24-hour treatments with everolimus and AR-A014418 alone or in combination,with the apoptosis rate being 14.28%±2.18%,14.57%±2.35%and 55.18%±6.27%in the everolimus group,AR-A014418 group and combined treatment group respectively,and the combined treatment showed the strongest accelerating effect.ConclusionThe combined treatment with everolimus and ARA014418 can evidently inhibit 4EBP1 phosphorylation and eIF4F complex formation in A375 cells,which then suppress cap-dependent translation and promote apoptosis of melanoma cells.

Melanoma,experimental;Apoptosis;Glycogen synthase kinase 3;Survivin;Everolimus;4E-binding protein-1;Cap-dependent translation

s:Cao Yu,Email:caoyu7099@163.com;Wu Chunwei,Email:1960746280@qq.com

曹煜，Email：caoyu7099@163.com；吳春維，Email：1960746280@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.010

貴州省中藥現(xiàn)代化專項項目（20125018）

Fund program:Modernization of Traditional Chinese Medicine Program of Guizhou Province（20125018）

2015-09-25）

（本文編輯：周良佳 顏艷）