路雨婷 王震英 宋亞麗 姬燦燦 張莉

250021濟南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院皮膚科

人GJB6基因Tet-on HaCaT細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建與鑒定

路雨婷 王震英 宋亞麗 姬燦燦 張莉

250021濟南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院皮膚科

目的 以Tet-on慢病毒為載體建立穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因及其突變體的HaCaT細(xì)胞株，為后續(xù)研究有汗性外胚層發(fā)育不良的發(fā)病機制奠定實驗基礎(chǔ)。方法 利用PCR技術(shù)擴增人GJB6基因野生型與突變型（A88V）基因，重組Tet-on慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)基因測序及酶切技術(shù)對其鑒定，再將重組慢病毒轉(zhuǎn)染入HaCaT細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)編碼縫隙連接蛋白Cx30的GJB6基因的細(xì)胞株。細(xì)胞株加四環(huán)素誘導(dǎo)后，通過RTPCR檢測GJB6基因的mRNA表達(dá)量，同時通過Western印跡檢測Cx30與FLAG標(biāo)簽肽的表達(dá)，從而對穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因的HaCaT細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。用CCK8法檢測GJB6基因野生型與突變型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)后對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 經(jīng)酶切、測序鑒定，重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。RT-PCR檢測到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞中GJB6基因mRNA表達(dá)量明顯增加，感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT細(xì)胞組（WT組）加四環(huán)素GJB6基因表達(dá)豐度是WT組不加四環(huán)素的113.369倍（P＜0.05），感染突變型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT細(xì)胞組（MU組）加四環(huán)素GJB6基因表達(dá)豐度是MU組不加四環(huán)素的3.249倍（P＜0.05）；Western印跡可檢測到經(jīng)四環(huán)素處理的WT組和MU組穩(wěn)定表達(dá)Cx30與FLAG，而未經(jīng)四環(huán)素處理的細(xì)胞和感染陰性對照病毒的HaCaT細(xì)胞組（NC組）未檢測到Cx30與FLAG目的條帶。NC組加與不加入四環(huán)素在4、8、12、24、36、48 h時的A值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；WT組加與不加入四環(huán)素在4、8、12、24、36 h時的A值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MU組加與不加入四環(huán)素在4、8、12、24、36、48 h時的A值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 成功構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)GJB6基因野生型及其突變體A88V的HaCaT細(xì)胞株。

外胚層發(fā)育不良癥；連接蛋白類；GJB6基因；HaCaT細(xì)胞；Tet-on

Cx30是縫隙連接蛋白中的一員。2000年Lamartine 等［1］已證實，編碼 Cx30 蛋白的 GJB6 基因為有汗性外胚層發(fā)育不良的致病基因。迄今為止，在有汗性外胚層發(fā)育不良（hidrotic ectodermal dysplasia，HED）患者中已發(fā)現(xiàn)該基因的5種突變，它們均為錯義突變，分別為G11R、A88V、V37E、D50N和N14S［1-5］。目前的研究雖然已識別出該病的致病基因，但對其發(fā)病機制還了解甚少。我們曾通過過表達(dá)慢病毒的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，欲對Cx30蛋白的功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，但在實驗過程中4種突變型的過表達(dá)慢病毒分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后，細(xì)胞死亡現(xiàn)象均較明顯，熒光表達(dá)弱，導(dǎo)致后續(xù)研究不能正常進(jìn)行［6］。因此，改用Ten-on基因表達(dá)系統(tǒng)再次嘗試轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞并構(gòu)建為穩(wěn)定株。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗細(xì)胞與慢病毒：HaCaT細(xì)胞購自中國科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心；陰性對照組慢病毒、Tet-on野生型及突變型（A88V）慢病毒均為本院中心實驗室保存。

2.主要試劑：胎牛血清（澳大利亞Ausbian公司），二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司），DMEM（美國Corning公司），胰酶［生工生物工程（上海）股份有限公司］，嘌呤霉素（美國Clontech公司），Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司），BCA Protein Assay Kit（美國HyClone-Pierce公司），預(yù)染的蛋白參照（上海中晶公司），ECL-PLUS/Kit（美國 Amersham公司），Cx30抗體（美國Inventrogen公司），F(xiàn)LAG抗體（美國Sigma公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋公司），ECL+plusTMWestern印跡試劑盒（美國Amersham公司）。

二、方法

1.重組慢病毒質(zhì)粒載體的鑒定：以GJB6基因野生型及野生型A88V引物為模板擴增其對應(yīng)的GJB6基因的cDNA序列。再克隆到GV308質(zhì)粒上，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析證實其正確性。

2.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)：從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快解凍。完全解凍后，150×g，離心3 min，75%乙醇擦拭凍存管消毒后，移至生物安全柜。吸去凍存液上清液，將細(xì)胞懸液接種至含有10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。24 h后更換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

實驗分組：感染陰性對照病毒的HaCaT細(xì)胞組（NC組）、感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT細(xì)胞組（WT組）、感染突變型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT細(xì)胞組（MU組）。

3.Tet-on慢病毒感染HaCaT細(xì)胞：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成3×104～5×104個/ml細(xì)胞懸液，接種相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)到培養(yǎng)板中進(jìn)行預(yù)實驗，繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時鋪板量達(dá)到15%～30%左右。按照預(yù)實驗結(jié)果，將完全培養(yǎng)基制成3×104～5×104個/ml細(xì)胞懸液接種至6孔板中，感染時每孔細(xì)胞融合度為20%，MOI值為20，16 h左右更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.觀察感染后細(xì)胞狀態(tài)及感染效率并篩選細(xì)胞：細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)大量死亡，感染效率達(dá)到80%左右。于感染96 h后，換用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，處理時間為120 h。待細(xì)胞融合至70%～80%時，以終濃度2.00 mg/L的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況每3～5 d更換1次篩選培養(yǎng)基，最終以1.00 mg/L的嘌呤霉素維持。5 mg/L四環(huán)素處理48 h后送樣RT-PCR檢測和Western印跡檢測。

5.RT-PCR檢測目的基因GJB6：用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用分光光度儀測得A260nm/A280nm為1.8～2.1。按照試劑盒說明書，取1 μg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴增。GJB6基因引物序列上游為5′-GTGGCCTACTACAGGCACGAA-3′，下游 5′-AGCGACCCCTCTATCCGAAC-3′，擴增長度為113 bp。GAPDH為內(nèi)參照，引物序列上游為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游 5′-CA CCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增長度為 121 bp。

6.Western印跡檢測HaCaT細(xì)胞中Cx30與FLAG的表達(dá)：收集生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，提取蛋白。以GAPDH、β肌動蛋白作為內(nèi)參，每個樣品蛋白上樣量均為30 μg。采用10%分離膠進(jìn)行SDSPAGE電泳，在4℃、300mA恒流條件下濕轉(zhuǎn)150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液室溫封閉PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過夜。洗膜后二抗室溫孵育2 h，次日顯影。

7.CCK8法檢測加四環(huán)素誘導(dǎo)GJB6基因表達(dá)后對細(xì)胞增殖的影響：將對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞分組：①對照組：不加四環(huán)素的NC組、WT組、MU組HaCaT細(xì)胞；②實驗組：加四環(huán)素的NC組、WT組、MU組HaCaT細(xì)胞。在96孔板中接種密度為6×103個/ml的細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔培養(yǎng)基為100 μl，同時設(shè)置空白組，即培養(yǎng)基+CCK8試劑，上述方法種4塊96孔板分別用于各個時間點的檢測。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后，實驗組換含有5 mg/L四環(huán)素的培養(yǎng)基100 μl。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 4、8、12、24、36、48 h，取出培養(yǎng)板，加入10 μl CCK8溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，選擇450 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度（A值），實驗重復(fù)3次，取平均值。

8.采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，差異可信區(qū)間為95%，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用t檢驗。

結(jié) 果

一、PCR擴增GJB6基因的野生型和突變型A88V并克隆到載體進(jìn)行測序

PCR試劑盒擴增突變型和野生型GJB6基因cDNA全長序列，PCR產(chǎn)物交換人線性化表達(dá)載體，將該片段克隆至GV308載體（12.4 kb）中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選單克隆菌落。PCR鑒定結(jié)果，野生型與突變型A88V的陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小分別是829 bp和1128bp，陰性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小分別是363bp和377 bp，經(jīng)測序，結(jié)果與已報道的GJB6基因序列一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。

二、Tet-on過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞結(jié)果

陰性對照組慢病毒、Tet-on野生型及突變型（A88V）慢病毒分別感染HaCaT細(xì)胞后（圖2），細(xì)胞狀態(tài)良好，為多角形，呈簇集生長。感染96 h后，經(jīng)嘌呤霉素處理120 h后的細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常，生長狀態(tài)亦良好（圖3）。HaCaT細(xì)胞為有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染較為成功。

圖1 酶切鑒定重組質(zhì)粒結(jié)果 1：陰性對照（ddH20）；2：空載自連對照組；3：GAPDH；4：標(biāo)準(zhǔn)參照物：自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5 ～ 12：1A 為 GJB6基因野生型1～8號重組質(zhì)粒，1B為GJB6基因突變型A88V 1～8號重組質(zhì)粒

圖2 Tet-on過表達(dá)慢病毒感染HaCaT細(xì)胞 細(xì)胞狀態(tài)良好，為多角形，呈簇集生長

圖3 Tet-on過表達(dá)慢病毒感染HaCaT細(xì)胞96 h、經(jīng)嘌呤霉素處理120 h后的生長狀態(tài) HaCaT細(xì)胞生長良好，細(xì)胞無明顯分化、老化現(xiàn)象

三、四環(huán)素誘導(dǎo)后細(xì)胞狀態(tài)的變化

MU組加四環(huán)素誘導(dǎo)，24 h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，48 h后大部分細(xì)胞死亡，殘存的細(xì)胞老化，細(xì)胞核固縮（圖4），而NC組與WT組細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化，且細(xì)胞無明顯死亡。

四、RT-PCR檢測目的基因GJB6 mRNA水平

WT加四環(huán)素組GJB6基因表達(dá)豐度（113.369±6.494） 是 WT不加四環(huán)素組（1.001±0.067）的113.369倍（P＜0.05）；MU加四環(huán)素組GJB6基因表達(dá)豐度（3.249±0.273）是MU不加四環(huán)素組（1.001±0.067）的3.249倍（P＜0.05）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞加四環(huán)素誘導(dǎo)后表達(dá)量增高，說明目的基因的表達(dá)是可調(diào)控的。

圖4 Tet-on過表達(dá)慢病毒感染HaCaT細(xì)胞經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)24、48 h后的細(xì)胞形態(tài) 24 h后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，48 h后的細(xì)胞老化，細(xì)胞核固縮

圖5 Western印跡檢測各組蛋白的表達(dá) 經(jīng)四環(huán)素處理的感染野生型Tet-on慢病毒組（WT組）和感染突變型（A88V）Tet-on慢病毒組（MU組）檢測到Cx30與FLAG目的條帶。1：感染陰性對照病毒的HaCaT細(xì)胞組（NC組）不加四環(huán)素；2：NC組加四環(huán)素；3：WT組不加四環(huán)素；4：WT組加四環(huán)素；5：MU組不加四環(huán)素；6：MU組加四環(huán)素

五、HaCaT細(xì)胞中Cx30與FLAG的檢測

將各實驗組細(xì)胞裂解并提取蛋白行Western印跡檢測，經(jīng)四環(huán)素處理的WT組和MU組檢測到Cx30與FLAG目的條帶，而未經(jīng)四環(huán)素處理的細(xì)胞和NC組細(xì)胞未檢測到Cx30與FLAG目的條帶（圖5）。說明穩(wěn)定株轉(zhuǎn)染成功，且表達(dá)受四環(huán)素調(diào)控。

六、加四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)后對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞分別培養(yǎng)4、8、12、24、36、48h后測A值（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NC組加與不加四環(huán)素在各個時間節(jié)點的A值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；WT組加與不加四環(huán)素在 4、8、12、24、36 h 時的A值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MU組加與不加四環(huán)素在各時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。加入四環(huán)素后不同組別間各時段的多重比較采用單向方差分析，LSD法結(jié)果提示，加入四環(huán)素后NC組與WT組、NC組與MU組、MU組與WT組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 加四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)后不同時間對HaCaT細(xì)胞增殖的影響（A450值）

討 論

Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)是一個由Gossen和Bujard［7］建立的比較成熟的四環(huán)素正向誘導(dǎo)的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，具有高效、無毒、開關(guān)嚴(yán)密等優(yōu)點。當(dāng)四環(huán)素的衍生物存在時，目的基因高效表達(dá)；而撤走藥物時，基因一般不被轉(zhuǎn)錄［8］。該基因表達(dá)系統(tǒng)目前被廣泛運用在基因功能研究中。Schrier等［9］使用該表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了攜帶FMRP野生型和突變型的PC12細(xì)胞株，并研究了FMRP突變體的功能，為該蛋白的功能研究開辟了一個新的途徑。Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的這些優(yōu)勢彌補了之前本課題組在構(gòu)建傳統(tǒng)慢病毒載體過程中所遇到的基因表達(dá)和終止調(diào)控性差等問題，成功穩(wěn)定構(gòu)建GJB6野生型與突變型（A88V）HaCaT細(xì)胞株。

縫隙連接蛋白（Connexin）是在細(xì)胞間通訊中起重要作用的一個蛋白質(zhì)家族，它們是完整的膜蛋白，形成含水的縫隙連接通道，允許細(xì)胞間離子和小代謝分子的擴散交換，協(xié)調(diào)多細(xì)胞組織的新陳代謝活動［10］。間隙連接是介導(dǎo)多細(xì)胞生物相鄰細(xì)胞之間直接進(jìn)行小分子物質(zhì)交換的通道，其介導(dǎo)的信息交流在細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育過程中起到了十分重要的作用?？p隙連接蛋白是組成間隙連接通道的亞單位。目前已發(fā)現(xiàn)許多遺傳性疾病的發(fā)生與縫隙連接蛋白的突變有關(guān)［11-13］。

有研究顯示，大鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（REKs）被表達(dá)了A88V突變體后會進(jìn)入細(xì)胞死亡途徑，細(xì)胞核發(fā)生固縮、碎裂，并且可引起細(xì)胞膜的破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞在突變體表達(dá)后的 24 h內(nèi)死亡［14］。Essenfelder等［15］研究發(fā)現(xiàn)，A88V 突變體通過形成異常的間隙連接半通道，導(dǎo)致ATP外流和細(xì)胞死亡。我們曾構(gòu)建過帶有綠色熒光的過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，G11R和A88V突變體過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可觀察到弱的熒光；V37E突變型未觀察到熒光或僅有較弱熒光，且48 h內(nèi)3種HaCaT細(xì)胞均出現(xiàn)大量死亡，細(xì)胞無法傳代［6］。以至于不能對轉(zhuǎn)染后的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行篩選，未得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，無法確保實驗的同步性和統(tǒng)一性。改用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)后，將攜帶GJB6基因野生型和突變型的過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到HaCaT細(xì)胞，因病毒載體具有抗嘌呤霉素的特性，被成功轉(zhuǎn)染該病毒載體的HaCaT細(xì)胞也具備嘌呤霉素抗性，未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有上述特點，故經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的HaCaT細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功后穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。然后，通過四環(huán)素的誘導(dǎo)使它們在同一時間點表達(dá)該基因的野生型和突變型A88V。實驗過程中觀察到，四環(huán)素誘導(dǎo)突變體A88V在HaCaT細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，經(jīng)過24 h細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生變化，部分細(xì)胞出現(xiàn)漂??；48 h后貼壁細(xì)胞中部分細(xì)胞胞核固縮，細(xì)胞出現(xiàn)老化，大部分細(xì)胞漂浮。為了進(jìn)一步了解GJB6基因野生型與突變型A88V經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)后對細(xì)胞增殖的影響，我們采用CCK8法進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT組和MU組加入四環(huán)素的A值與WT組和MU組不加四環(huán)素的A值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明四環(huán)素對感染野生型和突變型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT細(xì)胞的增殖有顯著影響；加入四環(huán)素后WT組在各時間段的A值比NC組略小，MU組在各時間段的A值明顯小于NC組，且加入四環(huán)素的WT組與MU組比較后在各時間段的A值具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明GJB6基因野生型與突變型（A88V）經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)后會不同程度地影響上述兩組HaCaT細(xì)胞的增殖。

本實驗成功構(gòu)建了突變體A88V和野生型Tet-on慢病毒表達(dá)載體，我們將用該方法構(gòu)建G11R等其他突變體的載體。通過該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞株后探討野生型和多種突變型GJB6基因?qū)堑鞍?、兜甲蛋白、?nèi)披蛋白和絲聚蛋白的作用，從而為闡明GJB6基因突變體引起皮膚角化異常等表型的可能機制奠定基礎(chǔ)。該模型不僅有助于揭示有汗性外胚層發(fā)育不良的發(fā)病機制，還可以探討與縫隙連接蛋白基因突變相關(guān)的其他多種綜合征的發(fā)病機制，為今后的基因治療提供實驗研究依據(jù)。

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Construction of HaCaT cell lines stably expressing the human GJB6 gene by using a Tet-On lentiviral vector and their identification

Lu Yuting,Wang Zhenying,Song Yali,Ji Cancan,Zhang Li
Department of Dermatology,Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250021,China

ObjectiveTo construct HaCaT cell lines stably expressing the wild type human GJB6 gene or its mutant by using a Tet-On lentiviral vector,and to lay an experimental foundation for studies on pathogenesis of hidrotic ectodermal dysplasia.MethodsThe wild-type human GJB6 gene and its mutant（A88V）were amplified by PCR,and then inserted into the Tet-on lentivirus plasmid to construct recombinant lentivirus vectors.The recombinants were identified by gene sequencing and enzymatic digestion.Cultured HaCaT cells were classified into three groups to be transfected with a negative control lentiviral vector （NC group）,the lentivirus vector expressing the wild-type human GJB6 gene （WT group）,or the lentivirus vector expressing the mutant human GJB6 gene （MU group）.Puromycin was used to select HaCaT cell clones stably expressing the GJB6 gene which encodes the connexin 30 （Cx30）protein.The selected HaCaT cell clones were cultured with or without tetracycline for 48 hours,thereafter,real-time PCR（RT-PCR）was performed to detect GJB6 gene mRNA expression,Western-blot analysis to measure expressions of Cx30 and FLAG-tag proteins,and cell counting kit 8 （CCK8）assay to evaluate cellular proliferative activity.ResultsEnzymatic digestion and gene sequencing showed that recombinant lentivirus plasmids were successfully constructed.RT-PCR showed evidently increased mRNA expression of the GJB6 gene in stably transfected HaCaT cells.Moreover,the expression abundance of the GJB6 gene was 112.369 times higher in the WT group induced by tetracycline than in that without tetracycline treatment（P＜0.05）,and 2.249 times higher in the MU group induced by tetracycline than in that without tetracycline treatment（P＜ 0.05）.Western-blot analysis showed that Cx30 and FLAG-tag proteins were stably expressed in the WT group and MU group after induction with tetracycline,while neither of them was observed in the WT group or MU group without tetracycline treatment,or in the NC group.Significant differences were noted in cellular proliferative activity（expressed as the absorbance value at 450 nm）between the MU group with and without tetracycline treatment and between the WT group with and without tetracycline treatment at 4,8,12,24,36 and 48 hours（allP＜0.05）,but not between the NC group with and without tetracycline treatment at any of the above time points （allP＞0.05）.ConclusionHaCaT cell lines which stably express the wild-type GJB6 gene or its mutant（A88V）are successfully constructed.

Ectodermal dysplasia;Connexins;GJB6 gene;HaCaT cells;Tet-on

Zhang Li,Email:zhangliwenzhe@medmail.com.cn

張莉，Email：zhangliwenzhe@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.009

國家自然科學(xué)基金（81171492）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2011HQ056）；山東省科技發(fā)展計劃項目（2010GSF10812、2011GSF11847）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81171492）;Natural Science Foundation of Shandong Province of China （ZR2011HQ056）;Shandong Province Science and Technology Development Program（2010GSF10812,2011GSF11847）

2015-08-18）

（本文編輯：顏艷）