梁穎紅 魏明 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花

450052鄭州大學(xué)附屬第五臨床學(xué)院檢驗(yàn)科

特應(yīng)性皮炎患者外周血T淋巴細(xì)胞Rho激酶活性變化及其意義

梁穎紅 魏明 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花

450052鄭州大學(xué)附屬第五臨床學(xué)院檢驗(yàn)科

目的 觀察特應(yīng)性皮炎（AD）患者外周血T淋巴細(xì)胞中Rho激酶活化情況，分析其臨床意義。方法 收集60例AD患者和60例健康兒童外周肝素抗凝血8 ml，分離提取T細(xì)胞和血清。分別用AD血清和健康對(duì)照血清培養(yǎng)AD患者T細(xì)胞或健康對(duì)照T細(xì)胞，分為患者T細(xì)胞+自身血清組、患者T細(xì)胞+健康對(duì)照血清組、健康對(duì)照T細(xì)胞+自身血清組、健康對(duì)照T細(xì)胞+AD血清組。此外，分別用Rho激酶特異性抑制劑Y27632（Y27632組）、CD3/CD28單抗（CD3/CD28單抗組）、Y27632+CD3/CD28單抗（Y27632+CD3/CD28單抗組）處理AD患者T細(xì)胞，自身血清培養(yǎng)AD患者T細(xì)胞為患者T細(xì)胞組。采用Western印跡法檢測(cè)各組Rho激酶活性，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性，ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）6、IL-10水平。結(jié)果新鮮分離的AD患者外周血T細(xì)胞Rho激酶活性（2.47%±0.89%）顯著高于健康對(duì)照組（0.65%±0.35%，t=2.729，P＜0.05）。AD患者T細(xì)胞在體外經(jīng)10%胎牛血清培養(yǎng)24 h后Rho激酶活性（0.70%±0.38%）較培養(yǎng)前顯著降低（t=2.658，P＜0.05），但與培養(yǎng)24 h后健康對(duì)照T細(xì)胞（0.63%±0.32%）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.010，P＞0.05）。與健康對(duì)照血清培養(yǎng)T細(xì)胞相比，AD血清培養(yǎng)T細(xì)胞會(huì)增加Rho激酶活性（F=8.22，P＜0.001），患者T細(xì)胞+自身血清培養(yǎng)24 h后Rho激酶活性（2.41%±0.87%）明顯高于患者T細(xì)胞+健康對(duì)照血清組（0.76%±0.41%），健康對(duì)照T細(xì)胞+AD血清組（2.17%±0.85%）顯著高于健康對(duì)照T細(xì)胞+自身血清組（0.64%±0.33%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Y27632可顯著抑制AD患者T細(xì)胞的增殖和IL-6的分泌（F=18.68、22.95，P＜0.001），Y27632組T細(xì)胞增殖率、IL-6的表達(dá)均顯著低于患者T細(xì)胞組（均P＜0.05），且Y27632+CD3/CD28單抗組也顯著低于CD3/CD28單抗組（均P＜0.05），而Y27632對(duì)AD患者T細(xì)胞IL-10分泌無顯著影響。結(jié)論 AD患者T淋巴細(xì)胞存在Rho激酶信號(hào)活化異常，提示Rho激酶信號(hào)異常在AD發(fā)病過程中可能發(fā)揮著一定的作用。

皮炎，特應(yīng)性；T淋巴細(xì)胞；rho相關(guān)激酶類；信號(hào)傳導(dǎo)；白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素10

在特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）的發(fā)病機(jī)制中，T細(xì)胞活化可能起著關(guān)鍵性的作用［1-3］，活化的T細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和（或）細(xì)胞間相互接觸等方式啟動(dòng)B細(xì)胞多克隆活化和擴(kuò)增，導(dǎo)致高球蛋白血癥和自身抗體過度產(chǎn)生，參與局部炎癥反應(yīng)。研究［4-7］發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞中存在多種信號(hào)蛋白活性異常，并且這些異常的信號(hào)蛋白可能參與了AD的發(fā)病機(jī)制。Rho激酶（Rho kinase）是小分子鳥嘌呤核苷（GTP）酶Rho A信號(hào)下游的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白，不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形成、遷移等細(xì)胞活動(dòng)，而且對(duì)細(xì)胞增殖、免疫炎癥反應(yīng)也有重要的調(diào)控作用［8-10］。據(jù)文獻(xiàn)［11］報(bào)道，Rho 激酶特異性抑制劑 Y27632能顯著抑制人外周T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-2、干擾素（IFN）-γ等細(xì)胞因子，提示Rho激酶可能參與T細(xì)胞活化。但Rho激酶是否參與AD的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。為此，我們觀察了AD患者外周血T細(xì)胞Rho激酶活性，探討其臨床意義。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2011年10月至2014年12月就診于我院門診的AD患者60例，全部符合Williams特應(yīng)性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］，其中男 24例，女 36例，年齡 5～14（10.0±4.6）歲。所有患者均無其他明顯皮膚病變、自身免疫性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、肝病和腫瘤等病史，且停用抗組胺藥2周以上，停用系統(tǒng)及局部糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑1個(gè)月以上。健康對(duì)照組60例來自兒?？平】刁w檢者，其中男26例，女34例，年齡 5～14（10.0±4.5）歲，無家族過敏史，無明顯皮膚病變或內(nèi)臟疾病史。兩組受試者性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兒童法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

二、方法

1.材料和試劑：RosettSep T細(xì)胞提取試劑盒（加拿大Stemcell Technologies公司），含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），抗CD3單抗（美國BD Pharmingen公司），CD3單抗、CD28單抗（美國BD Biosciences公司），Rho激酶特異性抑制劑Y27632（美國Chemicon公司），1∶500磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基1（MYPT-1）、1∶2 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG（美國Santa Cruz公司）。十二烷基硫酸鈉（SDS）樣本裂解緩沖液A由50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、10 mmol/L MgCl2、500 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、0.5%去氧膽酸鈉、0.1%SDS、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、10 mg/L亮抑肽酶、10 mg/L抑肽酶配制而成。

2.標(biāo)本收集及外周血T細(xì)胞分離：抽取AD患者和健康對(duì)照組兒童外周靜脈血8 ml，均分裝2管。一管5 ml抗凝血用于T細(xì)胞分離，采用RosettSep T細(xì)胞提取試劑盒分離T淋巴細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整T細(xì)胞密度1×109，分別把懸液置于 96孔板（100 μl/孔），37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，用抗CD3單抗在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)T細(xì)胞純度，均在95%以上。采用免疫印跡法檢測(cè)AD患者和健康對(duì)照組外周血T細(xì)胞培養(yǎng)前后Rho激酶活性。另一管3 ml血液1 500×g離心5 min，吸取上清液，分裝儲(chǔ)存于－80℃待用。

3.AD患者血清對(duì)T細(xì)胞的影響：使用前，AD患者和健康對(duì)照血清均在56℃滅活30 min，然后離心除去沉淀物。隨機(jī)將血清和T細(xì)胞分為患者T細(xì)胞+自身血清組、患者T細(xì)胞+健康對(duì)照血清組、健康對(duì)照T細(xì)胞+自身血清組、健康對(duì)照T細(xì)胞+AD血清組，培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組Rho激酶活性。

4.免疫印跡法檢測(cè)Rho激酶活性：提取各組T細(xì)胞總蛋白：用冷1×PBS洗滌T細(xì)胞1次，加入50 μl SDS樣本裂解緩沖液A，勻漿后置冰上，超聲粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上；4℃1 600×g離心5 min，吸取上清液，分裝儲(chǔ)存于-20℃。采用免疫印跡法檢測(cè)磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá)（用磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá)來表示Rho激酶活性）。取50 μl T細(xì)胞總蛋白上樣于15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h。然后膜與I抗（1∶500磷酸化MYPT1）于4℃孵育過夜，β肌動(dòng)蛋白（1∶2 000）為內(nèi)參，后在室溫下與Ⅱ抗（1∶2 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG）孵育1 h，TBST洗膜后，用ECL液顯影，最后用KODAKID型凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析，Rho激酶活性=磷酸化MYPT-1A值/β肌動(dòng)蛋白A值。

5.Y27632對(duì)AD患者T細(xì)胞的影響：將已分離的部分AD患者T細(xì)胞分為患者T細(xì)胞組（不進(jìn)行任何處理）、CD3/CD28單抗組（用5 mg/L CD3單抗和5 mg/L CD28單抗處理AD患者T細(xì)胞）、Y27632組（用 10 μmol/L Y27632處理 T細(xì)胞）、CD3/CD28單抗+Y27632組（先用Y27632處理T細(xì)胞，再用CD3/CD28單抗刺激）。處理48 h后，提取各組T細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)各組T細(xì)胞增殖活性和T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-10水平。采用噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定T細(xì)胞增殖活性，MTT法具體步驟參見文獻(xiàn)［13］。按ELISA試劑盒步驟檢測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-10水平。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：臨床資料采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同組處理前后的比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，另行兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、AD患者外周血T細(xì)胞培養(yǎng)前后Rho激酶活性變化

新鮮分離的AD患者外周血T細(xì)胞Rho激酶活性（2.47%±0.89%）顯著高于健康對(duì)照組（0.65%±0.35%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.729，P＜0.05）。外周血T細(xì)胞經(jīng)10%胎牛血清培養(yǎng)24 h后，AD患者外周血T細(xì)胞Rho激酶活性（0.70%±0.38%）較培養(yǎng)前顯著降低（t=2.658，P＜0.05），但與培養(yǎng)24 h后健康對(duì)照組（0.63%±0.32%）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.010，P＞0.05）。見圖1。

二、AD患者血清對(duì)T細(xì)胞Rho激酶活性的影響

T細(xì)胞與血清培養(yǎng)24 h后，患者T細(xì)胞+自身血清組Rho激酶活性（2.41%±0.87%）明顯高于患者T細(xì)胞+健康對(duì)照血清組（0.76%±0.41%），也顯著高于健康對(duì)照T細(xì)胞 +AD血清組（2.17%±0.85%）（P＜0.05）；健康對(duì)照T細(xì)胞+AD血清組明顯高于健康對(duì)照T細(xì)胞+自身血清組（0.64%±0.33%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AD患者T細(xì)胞+健康對(duì)照血清組高于健康對(duì)照T細(xì)胞+自身血清組（P＜0.05）。析因設(shè)計(jì)方差分析示，與健康對(duì)照血清培養(yǎng)T細(xì)胞相比，AD血清培養(yǎng)T細(xì)胞會(huì)增加Rho激酶活性（F=8.22，P＜0.001），AD 患者 T細(xì)胞Rho激酶活性高于健康對(duì)照T細(xì)胞（F=12.21，P＜0.001），細(xì)胞與血清存在交互作用（F=11.81，P＜ 0.001）。見圖2。

圖1 特應(yīng)性皮炎（AD）患者及健康對(duì)照者外周血T細(xì)胞磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá) 1：培養(yǎng)前健康對(duì)照組；2：培養(yǎng)前AD患者組；3：培養(yǎng)24 h后健康對(duì)照組；4：培養(yǎng)24 h后AD患者組

圖2 特應(yīng)性皮炎（AD）患者血清對(duì)T細(xì)胞磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá)的影響 1：患者T細(xì)胞+對(duì)照血清組；2：健康對(duì)照T細(xì)胞+對(duì)照血清組；3：患者T細(xì)胞+AD血清組；4：健康對(duì)照T細(xì)胞+AD血清組

三、Y27632對(duì)AD患者T細(xì)胞增殖的影響

單獨(dú)效應(yīng)分析，Y27632組患者T細(xì)胞增殖率顯著低于患者T細(xì)胞組（P＜0.05），且Y27632+CD3/CD28單抗組也顯著低于CD3/CD28單抗組（P＜0.05）。CD3/CD28單抗組顯著高于患者T細(xì)胞組（P＜ 0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組亦高于Y27632組（P＜0.05），見表1。析因設(shè)計(jì)方差分析示，Y27632可顯著抑制AD患者T細(xì)胞的增殖（F=18.68，P＜0.001），而 CD3/CD28單抗可顯著促進(jìn) AD患者T細(xì)胞的增殖（F=13.35，P＜0.001），Y27632與CD3/CD28單抗存在交互作用（F=15.39，P＜0.001）。

四、Y27632對(duì)AD患者T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析示，Y27632可顯著抑制AD患者T細(xì)胞IL-6的分泌（F=22.95，P＜0.001），而CD3/CD28單抗可顯著促進(jìn)IL-6的分泌（F=13.26，P＜0.001），Y27632與 CD3/CD28單抗存在交互作用（F=18.67，P＜0.001）。單獨(dú)效應(yīng)分析，Y27632組IL-6的表達(dá)顯著低于患者T細(xì)胞組（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組IL-6的表達(dá)顯著低于CD3/CD28單抗組（P＜0.05）。CD3/CD28單抗組IL-6的表達(dá)高于患者T細(xì)胞組（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組IL-6的表達(dá)亦高于Y27632組（P＜0.05）。此外，CD3/CD28單抗可顯著促進(jìn)IL-10的分泌（F=14.68，P＜0.001），CD3/CD28單抗組 IL-10的表達(dá)高于患者T細(xì)胞組（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組IL-10的表達(dá)亦高于Y27632組（P＜0.05）；然而，Y27632對(duì)AD患者T細(xì)胞IL-10的分泌無明顯作用（F=1.13，P＞0.05）。見表1。

表1 Rho激酶特異性抑制劑Y27632對(duì)特應(yīng)性皮炎（AD）患者T細(xì)胞增殖活性、IL-6和IL-10分泌的影響（±s）

表1 Rho激酶特異性抑制劑Y27632對(duì)特應(yīng)性皮炎（AD）患者T細(xì)胞增殖活性、IL-6和IL-10分泌的影響（±s）

注：a：與患者 T 細(xì)胞組相比，P ＜ 0.05；b：與 CD3/CD28 單抗組相比，P ＜ 0.05；c：與Y27632組相比，P＜0.05

組別 例數(shù) T細(xì)胞增殖率（%） IL-6（ng/L） IL-10（ng/L）患者T細(xì)胞組 60 102±35 389±72 112±27 Y27632組 60 51±17a 130±25a 92±23 CD3/CD28單抗組 60 228±65a 712±126a 291±56a Y27632+CD3/CD28單抗組 60 136±38bc 378±77bc 273±48c

討 論

Rho家族蛋白是小分子GTP酶，具有廣泛的生物學(xué)功能，特別在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增生、黏附、免疫反應(yīng)等方面有重要作用。作為RhoA下游關(guān)鍵性信號(hào)蛋白，Rho激酶在轉(zhuǎn)導(dǎo)Rho信號(hào)通路活化方面起重要作用［14］，MYPT-1是 Rho激酶重要的底物，能反應(yīng) Rho 激酶的活性［15］。有研究［16］發(fā)現(xiàn)，RhoA/Rho 激酶信號(hào)通路活化參與調(diào)控健康人外周血單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細(xì)胞因子。Segain等［17］發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性克羅恩病患者炎癥部位腸黏膜RhoA和Rho激酶活性顯著高于健康對(duì)照組。本研究結(jié)果顯示，AD組外周血T細(xì)胞Rho激酶活性明顯高于對(duì)照組，同時(shí)，Rho激酶特異性抑制劑Y27632能抑制患者外周血T淋巴細(xì)胞分泌IL-6，但對(duì)IL-10的分泌沒有顯著的抑制作用?？赡躌ho激酶通過影響T淋巴細(xì)胞的增殖，參與AD患者的炎性因子的調(diào)控。但有關(guān)Rho激酶在AD發(fā)病機(jī)制中的具體作用及其意義仍有待進(jìn)一步研究。

本研究中AD患者T細(xì)胞經(jīng)體外10%胎牛血清孵育24 h后，原本增高的Rho激酶活性卻降至正常水平，同時(shí)AD患者T細(xì)胞與健康對(duì)照組血清培養(yǎng)后，T細(xì)胞Rho激酶活性也顯著下降，而健康對(duì)照組T細(xì)胞與AD患者血清培養(yǎng)后其T細(xì)胞Rho激酶活性明顯增高。上述結(jié)果提示，AD患者外周血T細(xì)胞中異常增高的Rho激酶活性可能是繼發(fā)性的，可能與其血清中存在某種“致病”因素有關(guān)。這與其他研究者發(fā)現(xiàn)SLE患者T細(xì)胞ERM信號(hào)通路異常活化的結(jié)果相類似［18］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-17能夠顯著上調(diào)變應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）皮膚模型的炎性因子表達(dá)，IL-17可通過誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增生和活化，刺激黏附分子的表達(dá)和上調(diào)下游細(xì)胞因子［19］。

T細(xì)胞的“病理性”活化通過分泌細(xì)胞因子（如IL-6）或細(xì)胞間的相互作用，參與了局部炎癥反應(yīng)［20］。本研究結(jié)果顯示，Rho激酶特異性抑制劑Y27632顯著抑制AD患者T細(xì)胞增殖和分泌IL-6，提示AD患者外周血T細(xì)胞中Rho激酶可能參與其體內(nèi)T細(xì)胞的內(nèi)在活化。由于AD是慢性炎癥性皮膚病，病情遷延反復(fù)，推測(cè)外周血中T細(xì)胞的黏附和遷徙能力的強(qiáng)弱對(duì)T細(xì)胞能否遷徙并在局部浸潤起關(guān)鍵性的作用。因此，Rho激酶通路很可能是調(diào)節(jié)AD患者T細(xì)胞活化和在局部浸潤的重要靶點(diǎn)，通過抑制該通路活性可能有利于AD的治療。

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Changes of Rho kinase activity in peripheral blood T lymphocytes from patients with atopic dermatitis and their significance

Liang Yinghong,Wei Ming,Tu Ling,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Yihua
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo evaluate changes of Rho kinase（ROK）activity in peripheral blood T lymphocytes from patients with atopic dermatitis （AD）,and to analyze their clinical significance.MethodsEight milliliters of heparin-anticoagulated blood samples were collected from 60 patients with AD and 60 healthy human controls followed by separation of T lymphocytes and sera from these blood samples as well as culture of isolated T lymphocytes with 10%fetal bovine serum for 24 hours.Both patient-and control-derived T lymphocytes were classified into two groups to be cultured with patient-or control-derived sera.In addition,some patient-derived T lymphocytes were classified into 4 groups:Y27632 group treated with the Rho kinase-specific inhibitor Y2763,CD3/CD28 group treated with anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies,Y27632+CD3/CD28 group treated with Y27632 and anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies,and control group treated with patient-derived sera.Subsequently,Western-blot analysis was performed to evaluate ROK activity in cells,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay to evaluate proliferative activity of T lymphocytes,and ELISA to measure interleukin 6 （IL-6）and IL-10 levels in supernatants of T lymphocytes.ResultsROK activity was significantly lower in fresh T lymphocytes from patients than in those from healthy controls（2.47%±0.89%vs.0.65%±0.35%,t=2.729,P＜ 0.05）.After 24-hour culture with 10%fetal bovine serumin vitro,ROK activity was significantly decreased in patient-derived T lymphocytes compared with those before culture（0.70%±0.38%vs.2.47%±0.89%,t=2.658,P＜0.05）,but no significant difference was observed between patient-and control-derived T lymphocytes（0.70% ± 0.38%vs.0.63% ±0.32%,t=1.010,P＞0.05）.Compared with T lymphocytes cultured with control-derived sera,those cultured with patient-derived sera showed significantly increased ROK activity（F=8.22,P＜0.001）.Concretely speaking,ROK activity was significantly higher in patient-derived T lymphocytes cultured with patient-derived sera than in those cultured with control-derived sera（2.41%±0.87%vs.0.76% ±0.41%,P＜0.05）,and higher in control-derived T lymphocytes cultured with patient-derived sera than in those cultured with control-derived sera（2.17% ±0.85%vs.0.64%±0.33%,P＜0.05）at 24 hours.Y27632 could significantly inhibit the proliferation of as well as secretion of IL-6（F=18.68,22.95,respectively,bothP＜ 0.001）by patient-derived T lymphocytes,but had insignificant effects on secretion of IL-10.The cellular proliferative activity and IL-6 supernatant level were significantly lower in the Y27632 group than in the control group,and lower in the Y27632+CD3/CD28 group than in the CD3/CD28 group （allP＜0.05）.ConclusionAberrant activation of ROK exists in T lymphocytes from patients with AD,which may play a certain role in the pathogenesis of AD.

Dermatitis,atopic;T-lymphocytes;rho-Associated kinases;Signal transduction;Interleukin-6;Interleukin-10

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.007

2015-05-18）

（本文編輯：周良佳 顏艷）