◎卞 璐，張 旭

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學校，遼寧 錦州 121001；

2.沈陽鐵路局錦州機務(wù)段，遼寧 錦州 121001）

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)及其在食品檢測中的應(yīng)用

◎卞 璐1，張 旭2

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學校，遼寧 錦州 121001；

2.沈陽鐵路局錦州機務(wù)段，遼寧 錦州 121001）

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)是一種具有特異性強、操作簡便、快速、高效擴增等優(yōu)點的等溫核酸擴增方法，可在數(shù)十分鐘內(nèi)完成，通過使用鏈替換核酸聚合酶。基于此，就環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的原理及其在食源性病原微生物的檢測和食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測方面做一綜述。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)；食品；檢測

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由日本榮研株式會的Notomi T.等首次報道的一種新的核酸擴增方法，不僅能快速擴增DNA，也可實現(xiàn)對RNA的直接擴增[1]。LAMP技術(shù)已經(jīng)在核酸研究、病原微生物的檢測、疾病的診斷和預(yù)防、動物的早期胚胎性別鑒定等生命科學領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并取得了一些成就[2-6]。近年來，該技術(shù)也逐步被應(yīng)用到食品檢測中來。該文就LAMP技術(shù)的原理及其在食品檢測即食源性病原微生物的檢測和食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測方面做一綜述。

1　LAMP技術(shù)原理

雙鏈DNA在65 ℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一條引物與雙鏈DNA的互補部位進行堿基互補配對延伸的時候，另一條鏈就會脫落變成單鏈，LAMP方法就是利用DNA的這一特點設(shè)計而成的。

1.1LAMP技術(shù)的引物設(shè)計

LAMP方法的4個引物是針對靶基因上的6個區(qū)域進行設(shè)計的，這6個區(qū)域分別是位于3'端的F3c區(qū)段，F(xiàn)2c區(qū)段、F1c區(qū)段和位于5'端的B1區(qū)段、B2區(qū)段、B3區(qū)段（見圖1）。LAMP法的2條內(nèi)引物FIP（Forward Inner Primer）和BIP（Back Inner Primer），F(xiàn)IP包含有F1c序列、TTTT連接子和F2（F2c的互補序列）；BIP包含有B1c（B1的互補序列）、TTTT連接子和B2序列；2條外引物為F3（F3c的互補序列）和B3序列（B3c的互補序列）（見圖1）[7]。LAMP引物設(shè)計除了要避免引物二聚體形成、3′端發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物自身互補等原則外，對引物之間的距離也有要求，F(xiàn)3和F2之間，B2和B3之間的距離應(yīng)該是0～20 bp，引物中形成環(huán)的部分距離是40～60 bp，LAMP反應(yīng)擴增的區(qū)域的距離建議是120～180 bp[8]。

圖1　靶序列上6個特異區(qū)及引物設(shè)計圖

1.2LAMP技術(shù)的操作程序

LAMP等溫擴增反應(yīng)體系通常為25 μ L，包含了模板DNA、引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。其中內(nèi)引物濃度為0.8～2.0 μ mol/L，外引物濃度為0.2～0.8 μ mol/L，鎂離子濃度為2～10 mmol/L。各種物質(zhì)混勻后，置于在60～65 ℃保溫60～90 min，80 ℃滅活10 min，產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時用肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度變化[9，10]。

2　LAMP技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，LAMP技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在食源性病原微生物的檢測和食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測兩個方面[11-13]。

2.1食源性病原微生物的檢測

LAMP技術(shù)在食源性致病菌、食源性病毒[14]及食源性寄生蟲[15]的檢測方面均有研究，但目前報道最多的是食源性致病菌的檢測。董鑫悅等以阪崎腸桿菌的OmpA序列為靶基因，建立了一種檢測乳中阪崎腸桿菌的方法。結(jié)果表明，LAMP檢測阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度為3.7×101cfu/mL，其靈敏度是PCR方法的10倍，人工污染阪崎腸桿菌滅菌乳的檢測限為4.3×101cfu/mL，具有特異性強、靈敏度高、耗時短的特點[16]。程曉艷等根據(jù)副溶血弧菌的毒力基因tdh保守序列設(shè)計引物，建立了LAMP快速檢測技術(shù)，其細菌DNA最低檢出限為35.5 fg/反應(yīng)管，并利用該方法對扇貝樣品中致病性副溶血弧菌進行了檢測，證明LAMP技術(shù)可用于水產(chǎn)品致病菌的快速檢測，且操作簡單、安全可靠[17]。

2.2食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測

自世界上首例轉(zhuǎn)基因煙草1983年在美國問世以來[18]，轉(zhuǎn)基因作物的種類與日俱增，其中轉(zhuǎn)基因大豆占全球種植面積的51%，玉米占31%，棉花占13%，油菜占5%[19]。而隨著這些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大量流入市場，其安全性問題已成為全球爭論的熱點。目前應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法操作步驟煩瑣、檢測成本高、時間長，不適合現(xiàn)場實時監(jiān)測和跟蹤檢測。LAMP技術(shù)作為一種新興的檢測技術(shù)，具有操作簡單、無須PCR儀和昂貴的試劑、可快速高效擴增等優(yōu)點，已逐步應(yīng)用于食品轉(zhuǎn)基因成分的檢測分析。我國近年來開展了食品中轉(zhuǎn)基因成分的LAMP檢測方法的研究。吳少云等針對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計4條特異性引物，建立的實時濁度法LAMP快速檢測技術(shù)，能夠特異性檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系，其最低檢出限為0.01%，是普通PCR方法的10倍[20]。

總之，作為一種新興的檢測技術(shù)，LAMP技術(shù)既符合食品臨床檢驗所需的要求，也存在著某些不足。隨著LAMP技術(shù)的不斷發(fā)展和改良，LAMP作為一種新興的檢測技術(shù)，必將會憑借其強大的優(yōu)勢，在基層檢測機構(gòu)和食品檢測部門得到應(yīng)用和推廣。而該技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣，對于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全和推動食品國際貿(mào)易發(fā)展無疑具有重要的意義。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Technololy and Its Application in Food Detection

Bian Lu1， Zhang Xu2
（1.Liaoning Agricultural Economy School， Jinzhou 121001， China；
2. Shenyang Railway Bureau Jinzhou， Jinzhou 121001， China）

Loop-mediated isothermal amplification technology is a kind of isothermal nucleic acid amplification method with strong specificity， simple operation， fast and efficient amplification etc， which can complete in dozens of minutes by using Chain replacement DNA polymerase. In this paper， the principle of loop-mediated isothermal amplification technology and its application in detection of the food borne pathogenic microorganism and geneticallymodifiedingredients in food were reviewed.

Loop-mediated isothermal amplification； Food； Detection

Q817

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.06.014