張鵬，韋紅光

（1.桂林市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣西541002；2.玉林市第三人民醫(yī)院藥劑科，廣西537000）

不同抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥突變選擇窗的影響分析

張鵬1，韋紅光2

（1.桂林市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣西541002；2.玉林市第三人民醫(yī)院藥劑科，廣西537000）

目的探討不同抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥突變選擇窗（MSW）的影響。方法收集該院2013年4月至2014年4月分離的30株肺炎克雷伯菌的相關(guān)資料，采用瓊脂倍比稀釋法測(cè)定單一左氧氟沙星及左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的防突變濃度（MPC）及最低抑菌濃度（MIC），比較單一左氧氟沙星及左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星對(duì)肺炎克雷伯菌的選擇指數(shù)（SI）。結(jié)果左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MIC為0.03～1.00 mg/L，為單一左氧氟沙星（0.01～1.00 mg/L）的50.0%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MIC90為0.250 mg/L，顯著低于單一左氧氟沙星的0.500 mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2種抗菌藥物的MIC50比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MPC為1～8 mg/L，MPC50為1 mg/L、MPC90為2 mg/L，顯著低于單一左氧氟沙星的MPC（2～16 mg/L）及MPC50、MPC90（2、8 mg/L），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；單一左氧氟沙星與左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星對(duì)肺炎克雷伯菌的SI均在2～64，其不同SI菌株的分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星能夠降低肺炎克雷伯菌的MPC，引起左氧氟沙星對(duì)肺炎克雷伯菌的MSW變窄。

克雷伯菌，肺炎；氧氟沙星；突變；藥物耐受性；阿米卡星

肺炎克雷伯菌是臨床上常見(jiàn)的病原菌，在人類呼吸道中較常見(jiàn)，屬于條件致病菌，可引起呼吸道感染，從而引起肺炎等疾病，影響患者的正常生活和工作。目前臨床上對(duì)肺炎克雷伯菌引起的感染多以抗菌藥物治療為主，能夠有效改善癥狀，緩解病情，但隨著抗菌藥物的濫用，細(xì)菌耐藥性也越來(lái)越高［1］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合理使用抗菌藥物能夠降低或避免藥物引起的細(xì)菌耐藥［2］。同時(shí)，細(xì)菌耐藥突變選擇窗（MSW）理論也為細(xì)菌的耐藥性研究提供了新的依據(jù)和方法。但目前臨床上有關(guān)不同抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥MSW的影響研究相對(duì)較少［3］。為此，本研究對(duì)臨床分離的30株肺炎克雷伯菌的相關(guān)資料進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料收集本院2013年4月至2014年4月臨床分離的30株肺炎克雷伯菌的相關(guān)資料進(jìn)行分析，30株病原菌對(duì)左氧氟沙星及阿米卡星均敏感。肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC700603）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2試劑與藥物本研究所需藥物、試劑批號(hào)及生產(chǎn)廠家等見(jiàn)表1。

表1　試驗(yàn)所需藥物和試劑

1.2方法

1.2.1最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定MIC，測(cè)定過(guò)程中首先進(jìn)行0.5 McFarland（馬克法蘭）濁度肺炎克雷伯菌菌懸液配制，并對(duì)其進(jìn)行稀釋，取2 μL菌懸液接種于含有左氧氟沙星、阿米卡星單藥或2種藥物聯(lián)合的瓊脂平板上，進(jìn)行24 h孵育，溫度控制在35℃，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并記錄MIC濃度［4-5］。

1.2.2防突變濃度（MPC）測(cè)定采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定MPC，測(cè)定過(guò)程中以第一步測(cè)定的左氧氟沙星、阿米卡星的MIC作為基準(zhǔn)，采用二倍遞增方法配制不同濃度的左氧氟沙星、左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的瓊脂平板，每個(gè)濃度配置4個(gè)平板，為測(cè)定不同抗菌藥物的MPC做好準(zhǔn)備。同時(shí)，以測(cè)得的左氧氟沙星、阿米卡星的MPC作為基準(zhǔn)進(jìn)行稀釋，并采用棋盤(pán)法對(duì)不同濃度的抗菌藥物進(jìn)行分配，配制成含有左氧氟沙星和阿米卡星2種藥物的瓊脂平板，為測(cè)定左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MPC做好準(zhǔn)備［6］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作步驟［7］配制濃度為3.0×1010CFU/mL菌懸液，并取100 μL菌懸液放置在含有單藥及聯(lián)合藥物的瓊脂平板上，使得病原菌總接種量達(dá)到1.2×1010CFU。最后對(duì)病原菌進(jìn)行72 h培養(yǎng)、孵育，溫度控制在35℃，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)［8-9］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1左氧氟沙星對(duì)30株肺炎克雷伯菌的MIC左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MIC為0.03～1.00 mg/L，為單一左氧氟沙星（0.01～1.00 mg/L）的50%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MIC90為0.250mg/L，明顯低于單一左氧氟沙星的0.500 mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2種抗菌藥物MIC50比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2　左氧氟沙星對(duì)30株肺炎克雷伯菌的MIC（mg/L）

2.2左氧氟沙星對(duì)30株肺炎克雷伯菌的MPC左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MPC為1～8 mg/L，MPC50為1 mg/L、MPC90為2 mg/L，顯著低于單一左氧氟沙星的上述指標(biāo)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.3左氧氟沙對(duì)30株肺炎克雷伯菌的選擇指數(shù)（SI）單一左氧氟沙星和左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星對(duì)30株肺炎克雷伯菌的SI均在2～64，其不同IS菌株的分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表3　左氧氟沙星對(duì)30株肺炎克雷伯菌的MPC（mg/L）

表4　左氧氟沙星對(duì)30株肺炎克雷伯菌不同SI的菌株分布（株）

3　討論

肺炎克雷伯菌是臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，在正常人群中的帶菌率約為5%，而對(duì)于住院患者而言，帶菌率可達(dá)20%，是酒精中毒、糖尿病及慢性阻塞性肺疾病患者并發(fā)肺部感染的潛在危險(xiǎn)因素［10］?；颊吒腥竞髸?huì)引起肺炎、腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等。目前臨床上對(duì)于肺炎克雷伯菌引起的感染多采用抗菌藥物治療為主，能夠有效地控制感染。但是，藥物在抑制細(xì)菌、控制感染的同時(shí)也會(huì)引起或加重細(xì)菌耐藥性。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，患者使用抗菌藥物后血藥濃度需要達(dá)到MIC以上才能發(fā)揮作用，顯然這種觀念是籠統(tǒng)的、不全面的。MSW相關(guān)研究結(jié)果顯示，當(dāng)抗菌藥物濃度低于MIC時(shí)，細(xì)菌沒(méi)有突變選擇的能力，從而不會(huì)引起耐藥突變株的選擇性富集［11］。當(dāng)抗菌藥物濃度在病原菌MIC和MPC之間時(shí)，敏感菌株才會(huì)得到抑制，從而引起細(xì)菌發(fā)生耐藥性。同時(shí)，當(dāng)抗菌藥物濃度高于MPC時(shí)，細(xì)菌必須含有2種或2種以上的耐藥突變才能夠正常生長(zhǎng)，并且這種概率相對(duì)比較低，從而造成病原菌很難出現(xiàn)耐藥突變體的富集［12］。本研究中左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星后MIC為0.03～1.00 mg/L，為單一左氧氟沙星（0.01～1.00 mg/L）的一半；左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MIC90為0.250mg/L，明顯低于左氧氟沙星（0.500 mg/L），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2種抗菌藥物MIC50比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

MSW理論顯示，肺炎克雷伯菌感染患者在選擇抗菌藥物時(shí)應(yīng)盡可能將藥物濃度縮短至MIC及MPC之間，盡可能選擇窄MSW藥物，必要時(shí)甚至可以采取聯(lián)合用藥，從而使MSW變窄或關(guān)閉，降低病原菌突變發(fā)生率。本研究中，左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星的MPC為1～8mg/L、MPC50為1 mg/L、MPC90為2 mg/L，顯著低于單一左氧氟沙星（MPC為2～16 mg/L、MPC50為2 mg/L、MPC90為8 mg/L），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是，目前臨床上窄MSW的抗菌藥物并不多，多數(shù)抗菌藥物是在血藥濃度及組織液濃度達(dá)到MPC時(shí)才會(huì)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，因此，這種治療方案在臨床上比較少用甚至不使用。臨床上通過(guò)抗菌藥物的聯(lián)合使用能夠有效縮小或關(guān)閉MSW，這是臨床上降低或預(yù)防病原菌耐藥的一種重要方法［13］。

本研究結(jié)果顯示，單一左氧氟沙星和左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星對(duì)肺炎克雷伯菌的SI均在2～64，其不同SI菌株的分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明2種抗菌藥物聯(lián)合使用能夠有效降低肺炎克雷伯菌的MPC，能使抗菌藥物在臨床上應(yīng)用時(shí)的血藥濃度達(dá)到MPC之上，從而更有利于防止病原菌的富集。2種抗菌藥物聯(lián)合使用，能夠有效改善藥物對(duì)病原菌的MIC和MPC，從而相應(yīng)引起SI值發(fā)生變化。不同抗菌藥物的聯(lián)合使用更有利于血藥濃度快速通過(guò)MSW，降低耐藥病原菌的聚集，同時(shí)引起MSW變寬，從而引起血藥濃度在MSW內(nèi)的時(shí)間變長(zhǎng)，增加了耐藥突變株富集的機(jī)會(huì)。表明抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用能夠有效預(yù)防耐藥突變菌的富集，并且引起MSW的增快，增加病原菌的耐藥突變選擇性富集。因此，使用抗菌藥物時(shí)應(yīng)加強(qiáng)藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇針對(duì)性的抗菌藥物，以提高臨床治療效果［14］。

綜上所述，左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星能夠降低對(duì)肺炎克雷伯菌的MPC，使左氧氟沙星對(duì)肺炎克雷伯的MSW變窄。

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Analysis on influence of different antibacterial agents against Klebsiella pneumoniae drug resistant mutant selection window

Zhang Peng1，Wei Hongguang2
（1.Department of Pharmacy，Guilin Municipal People′s Hospital，Guilin，Guangxi 541002，China；2.Department of Pharmacy，Yulin Municipal Third People′s Hospital，Yulin，Guangxi 537000，China）

ObjectiveTo study the influence of different antibacterial drugs on Klebsiella pneumoniae drug resistant mutant selection window（MSW）.MethodsThe related data in 30 strains of Klebsiella pneumoniae in our hospital from April 2013 to April 2014 were collected.The mutant prevention concentration（MPC）and minimum inhibitory concentration（MIC）of single levofloxacin and levofloxacin combined with amikacin were detected by adopting the agar double ratio dilution method.Then their selection indexes（SI）on Klebsiella pneumoniae were compared.ResultsMIC of levofloxacin combined with amikacin was 0.03-1.00 mg/L，which was 50.0%of single levofloxacin（0.01-1.00 mg/L），the difference was statistically significant（P＜0.05）；MIC90of levofloxacin combined with amikacin was 0.250 mg/L，which was significantly lower than 0.500 mg/L of single levofloxacin，the difference was statistically significant（P＜0.05）；MIC50had no statistical difference between the two kinds of antibacterial drug（P＞0.05）.MPC of levofloxacin combined with amikacin was 1-8 mg/L，MPC50was 1 mg/L，MPC90was 2 mg/L，which were significantly lower than 2-16mg/L，2，8mg/Lof single levofloxacin，the differences were statistically significant（P＜0.05）；SI of single levofloxacin and levofloxacin combined with amikacin against Klebsiella pneumoniae was 2-64，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.ConclusionLevofloxacin combined with amikacin can reduce MPC to Klebsiella pneumoniae and can cause levofloxacin to narrow MSW to Klebsiella pneumoniae.

Klebsiella pneumoniae；Ofloxacin；Mutation；Drug toleranc；Amikacin

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.009

A

1009-5519（2016）20-3122-03

張鵬（1978-），主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。

（2016-04-18）