楊云周新麗戴建軍張德福邵文琪衣星越陶樂(lè)仁

（1上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海 201106）

冷凍保護(hù)劑添加-去除過(guò)程對(duì)豬M II期卵母細(xì)胞損傷研究

楊云1周新麗1戴建軍2張德福2邵文琪1衣星越1陶樂(lè)仁1

（1上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海 201106）

在卵母細(xì)胞的低溫保存過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑的添加與去除是一個(gè)必不可少的步驟，但高濃度的冷凍保護(hù)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞造成滲透損傷和毒性損傷。為研究冷凍保護(hù)劑添加與去除過(guò)程對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞的損傷，本文采用傳統(tǒng)的方法（一步法、兩步法）來(lái)添加和去除冷凍保護(hù)劑，探究冷凍液、解凍液、稀釋液對(duì)細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在冷凍保護(hù)劑添加-去除過(guò)程中，卵母細(xì)胞的滲透損傷主要發(fā)生在卵母細(xì)胞從冷凍液轉(zhuǎn)移至解凍液，以及保護(hù)劑去除階段；解凍液濃度與平衡時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞存活率有很大影響；卵母細(xì)胞保護(hù)劑的去除與添加過(guò)程是相關(guān)的，解凍液濃度和平衡時(shí)間的選擇依賴(lài)于細(xì)胞在冷凍液中的濃度和平衡時(shí)間。此研究結(jié)果將為豬MII期卵母細(xì)胞的低溫保存方案提供參考。

低溫保存；冷凍保護(hù)劑；滲透損傷；卵母細(xì)胞

自從1986年Chen C［1］首次成功地冷凍保存人的卵母細(xì)胞并受精后獲得后代以來(lái)，卵母細(xì)胞的低溫保存一直是低溫生物醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)課題，該技術(shù)的發(fā)展在人類(lèi)輔助生殖及生物胚胎技術(shù)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景［2-3］。卵母細(xì)胞的低溫保存方法主要有兩種:慢速冷凍和玻璃化冷凍。近年來(lái)，學(xué)術(shù)界一致認(rèn)為玻璃化冷凍效果明顯優(yōu)于慢速冷凍，因?yàn)椴ＡЩ鋬鍪歉邼舛壤鋬霰Ｗo(hù)劑溶液在超快速凍結(jié)過(guò)程中形成一種介于液態(tài)和固態(tài)之間的、透明的、非晶態(tài)物質(zhì)的過(guò)程，避免了細(xì)胞內(nèi)外冰晶的產(chǎn)生［4-5］。為了實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍，研究學(xué)者提出了微滴噴射法［6］、開(kāi)放式麥管法、冷凍環(huán)法［7］、Cryotop法［8-9］等多種提高降溫速率的方法。盡管如此，目前臨床上卵母細(xì)胞解凍復(fù)溫后的存活率、受精率、胚胎率及分娩率依然很低。Kuwayama M等［10］報(bào)道了Cryotop法玻璃化冷凍111個(gè)人MII期卵母細(xì)胞，獲得活胚分娩的機(jī)率僅為10%左右。

影響卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的因素有很多，除了冷凍載體、升降溫速率等，冷凍保護(hù)劑的使用所帶來(lái)的副作用也是一個(gè)重要的因素。在冷凍保護(hù)劑添加與去除過(guò)程中，由于胞外滲透壓的急劇變化，大量水或保護(hù)劑快速流出或流入細(xì)胞，從而引起細(xì)胞體積的收縮或膨脹，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷；同時(shí)冷凍保護(hù)劑自身的化學(xué)毒性，會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞造成毒性損傷［11］。為了減小保護(hù)劑滲透作用和化學(xué)毒性對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，目前通常采用分步添加和分步去除保護(hù)劑的方法。Mullen S F等［12］研究表明分步法向人卵母細(xì)胞導(dǎo)入6.4 mol/L乙二醇（EG）時(shí)，以四步添加最為理想。解政鼎等［13］認(rèn)為添加高濃度低溫保護(hù)劑時(shí)，采用等滲透壓差、滲透時(shí)間間隔逐漸減小的分步添加方法，可以減輕細(xì)胞的滲透損傷和毒性損傷。前人研究的側(cè)重點(diǎn)在于保護(hù)劑添加-去除程序的優(yōu)化，而對(duì)于分步添加-去除過(guò)程中每一步對(duì)細(xì)胞的損傷程度有多大，并沒(méi)有定量的數(shù)據(jù)，從而不能準(zhǔn)確地了解細(xì)胞滲透損傷發(fā)生在哪個(gè)階段；此外，上述研究多是孤立地優(yōu)化添加過(guò)程或去除過(guò)程，而事實(shí)上，保護(hù)劑去除過(guò)程中稀釋液濃度與平衡時(shí)間的選擇都依賴(lài)于保護(hù)劑加載過(guò)程（冷凍液濃度、平衡時(shí)間），保護(hù)劑的加載過(guò)程與去除過(guò)程需要相匹配。

本研究首先采用一步法、兩步法對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保護(hù)劑的添加與去除，逐步分析加載-去除過(guò)程中每一步對(duì)細(xì)胞存活率的影響，對(duì)滲透損傷發(fā)生在哪個(gè)階段有更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。然后對(duì)兩步法中滲透損傷明顯的階段進(jìn)行優(yōu)化，討論冷凍液濃度、稀釋液濃度、以及平衡時(shí)間等因素對(duì)細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞保護(hù)劑添加過(guò)程與去除過(guò)程的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1主要試劑

組織 培 養(yǎng) 液 （tissueculturemedium199，TCM199）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，Me2SO）、蔗糖，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Gibco公司，美國(guó)。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑除特別說(shuō)明外，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2玻璃化冷凍液、解凍液、稀釋液

一步法:基礎(chǔ)液:TCM199+20%FBS；玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS2）:基礎(chǔ)液 +30% （v/ v）Me2SO；解凍液（thawing solution，TS）:基礎(chǔ)液+ 0.5 mol/L蔗糖；稀釋液（dilution solution，DS2）:基礎(chǔ)液。兩步法:基礎(chǔ)液:TCM199+20%FBS；玻璃化冷凍液1（VS1）:基礎(chǔ)液 +15% （v/v）Me2SO；玻璃化冷凍液2（VS2）:基礎(chǔ)液 +30% （v/v）Me2SO+0.5 mol/L蔗糖；解凍液（TS）:基礎(chǔ)液+0.5 mol/L蔗糖；稀釋液1（DS1）:基礎(chǔ)液 +0.25mol/L蔗糖；稀釋液2（DS2）:基礎(chǔ)液。

1.3豬卵母細(xì)胞的采集與體外成熟

實(shí)驗(yàn)中所用的豬卵母細(xì)胞取自上海市嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)采集的新鮮卵巢，放在37℃的保溫杯中1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，選擇卵巢表面直徑為2～6 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器將卵母細(xì)胞復(fù)合體連同卵泡液一起吸出。將抽出的液體置于10 mL的離心管中，在39.5℃的恒溫水浴中靜置15～20 min，移除上清液。取胞質(zhì)均勻且有3層以上致密卵丘細(xì)胞包裹的細(xì)胞，即GV期卵母細(xì)胞。

將GV期卵母細(xì)胞在TCM199中洗滌三次后，置于已經(jīng)平衡4 h以上的成熟培養(yǎng)液中，成熟液是TCM199+10%FBS+10%豬卵泡液 +0.1%孕馬血清促性腺激素（PMSG）+0.1%人體毛膜促性腺激素（hCG），然后再放入CO2培養(yǎng)箱（39±0.5℃、5%CO2，BC-J160S，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó)）中，成熟培養(yǎng)44～46 h，得到MII期卵母細(xì)胞。MII期卵母細(xì)胞用0.1%透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘細(xì)胞，再用TCM199洗滌3～5次，備用。

1.4玻璃化冷凍液、解凍液、稀釋液的滲透壓測(cè)定

室溫下，每次取已配制好的玻璃化冷凍液、解凍液、稀釋液200～250μL，放入滲透壓計(jì)（Model-3250冰點(diǎn)滲透壓計(jì):Advanced，美國(guó)）的檢測(cè)管內(nèi)測(cè)量其滲透壓。每組溶液重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值。

1.5細(xì)胞滲透損傷的逐步確定

為了準(zhǔn)確了解細(xì)胞滲透損傷發(fā)生在哪個(gè)階段，實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞依次經(jīng)過(guò)不同溶液，每轉(zhuǎn)移一次，檢測(cè)一次細(xì)胞存活率。每組所用卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)約為60個(gè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次。對(duì)照組:新鮮細(xì)胞，不經(jīng)過(guò)任何處理。一步法:將卵母細(xì)胞從基礎(chǔ)液中移至玻璃化冷凍液中平衡1 min，完成冷凍保護(hù)劑的加載。接著將卵母細(xì)胞移至解凍液中，浸沒(méi)時(shí)間3min，然后移至37℃的基礎(chǔ)液中，浸沒(méi)時(shí)間6 min，完成保護(hù)劑的去除。兩步法:將卵母細(xì)胞從基礎(chǔ)液中移至VS1中，平衡時(shí)間3 min，然后快速轉(zhuǎn)移至VS2中，平衡時(shí)間30 s，完成保護(hù)劑的加載。接著將卵母細(xì)胞移至TS中，浸沒(méi)時(shí)間3 min，然后移至DS1中，浸沒(méi)時(shí)間3 min，然后再放入DS2中，平衡時(shí)間3 min。逐級(jí)脫除冷凍保護(hù)劑。

1.6兩步法解凍液濃度與平衡時(shí)間的優(yōu)化確定

采用兩步法添加保護(hù)劑后，選擇不同濃度的解凍液以及在其中的平衡時(shí)間，卵母細(xì)胞的存活率會(huì)有較大差異。為了選擇合適的解凍液濃度和平衡時(shí)間，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):首先將卵母細(xì)胞按照1.5中的兩步法完成冷凍保護(hù)劑的添加，然后將卵母細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至含0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四種不同濃度蔗糖的解凍液中，每種濃度解凍液中停留60 s、120 s、180 s三個(gè)平衡時(shí)間，從解凍液中取出后，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。

1.7兩步法去除與添加過(guò)程的優(yōu)化匹配

卵母細(xì)胞在玻璃化溶液中平衡不同的時(shí)間后，其所對(duì)應(yīng)的優(yōu)化解凍條件也會(huì)有所改變。為了探討添加過(guò)程和去除過(guò)程之間的匹配關(guān)系，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):將卵母細(xì)胞從基礎(chǔ)液中移至VS1中平衡3 min，然后快速轉(zhuǎn)移至VS2中，平衡時(shí)間分別為30 s、45 s、60 s、90 s、120 s、180 s，接著將細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至含0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四種不同濃度蔗糖的解凍液中，平衡時(shí)間120 s，從解凍液中取出后，檢測(cè)卵母細(xì)胞的存活率。

1.8細(xì)胞存活率的判斷

卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后，立即用熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）染色 5 min，再用TCM199洗滌3～4次，在倒置熒光顯微鏡（TS100倒置熒光顯微鏡:Nikon，日本）下觀察是否著色。有強(qiáng)熒光反應(yīng)的細(xì)胞認(rèn)為是活卵，無(wú)熒光反應(yīng)或弱熒光反應(yīng)的細(xì)胞認(rèn)為是死卵?；盥褦?shù)與細(xì)胞總數(shù)之比為細(xì)胞存活率，以此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算卵母細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件SPSSStatistics13.0進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1所用溶液的滲透壓

一步法與兩步法所用冷凍液、解凍液、及稀釋液的滲透壓值如表1所示。從表中可以看出，玻璃化冷凍液的滲透壓值遠(yuǎn)大于解凍液與稀釋液，兩種方法中，玻璃化冷凍液VS2與解凍液之間的滲透壓差均達(dá)到了 5 000 mOsm/kg左右。含 0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四種不同濃度的蔗糖解凍液的滲透壓值如表2所示，溶液的滲透壓隨著蔗糖濃度的增加而增加，形成滲透壓梯度。

2.2保護(hù)劑添加與去除過(guò)程對(duì)卵母細(xì)胞存活率的影響

為了對(duì)滲透損傷發(fā)生在哪個(gè)階段有更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，將卵母細(xì)胞依次經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍液、解凍液、稀釋液的處理，探究每一步對(duì)細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1（a）可知，卵母細(xì)胞經(jīng)一步法添加30%Me2SO后，細(xì)胞的存活率為83.9%，顯著低于對(duì)照組的95.2%。細(xì)胞不經(jīng)過(guò)冷凍保存，然后經(jīng)過(guò)解凍液和稀釋液處理后，細(xì)胞的存活率分別為58.4%、58.7%。從圖1（b）可知，卵母細(xì)胞經(jīng)兩步法添加冷凍保護(hù)劑，每一步添加后的細(xì)胞存活率分別為91.9%、92.1%，較對(duì)照組的98.5%有所降低。然后卵母細(xì)胞從冷凍液VS2中轉(zhuǎn)移至解凍液中，細(xì)胞存活率減小至84.0%，再經(jīng)稀釋液WS1、WS2去除保護(hù)劑后，細(xì)胞存活率有顯著減小，分別為 74.2%和69.8%。

表1　一步法和兩步法所用溶液的滲透壓值/（mOsm/kg）Tab.1 The osmotic p ressure values of the solutions used in one-step method and two-step m ethod

與一步法相比，兩步法處理增加了卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑添加與去除的步數(shù)，縮小了溶液間的滲透壓差，從而減輕了溶液對(duì)細(xì)胞的滲透損傷，有利于細(xì)胞的冷凍保存。此外，對(duì)于一步法和兩步法來(lái)說(shuō)，卵母細(xì)胞從冷凍液轉(zhuǎn)移至解凍液，以及冷凍保護(hù)劑去除的過(guò)程中，細(xì)胞的存活率會(huì)顯著降低，說(shuō)明溶液對(duì)卵母細(xì)胞的滲透損傷主要發(fā)生在這個(gè)階段，這是因?yàn)榧?xì)胞從冷凍液轉(zhuǎn)移至解凍液中，細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)了極大的滲透壓差，使得溶液跨膜擴(kuò)散具有了更大的驅(qū)動(dòng)力，導(dǎo)致大量水或冷凍保護(hù)劑快速流出/流入細(xì)胞，從而引起細(xì)胞體積的膨脹或收縮，對(duì)細(xì)胞造成致命的滲透損傷［13］。

對(duì)于冷凍保護(hù)劑的添加過(guò)程，研究者已經(jīng)做了大量的優(yōu)化研究，包括保護(hù)劑濃度、添加步驟、每一步的時(shí)間等［14-15］。然而，Wang L等［16］和Liu J等［17］對(duì)冷凍保護(hù)劑添加和去除的全過(guò)程進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:冷凍保護(hù)劑的去除過(guò)程對(duì)細(xì)胞的滲透損傷要遠(yuǎn)大于其他步驟，縮短冷凍保護(hù)劑的去除程序可能會(huì)減小細(xì)胞的滲透損傷。這與文中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

圖1　一步法、兩步法添加與去除保護(hù)劑對(duì)豬卵母細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of addition and rem oval of CPA w ith one-step method and two-step method onsurvival rate of porcine oocytes

2.3解凍液濃度與平衡時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞存活率的影響

以?xún)刹椒ㄌ砑永鋬霰Ｗo(hù)劑，然后將卵母細(xì)胞從冷凍液VS2中分別轉(zhuǎn)移至0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L四種不同濃度的蔗糖解凍液中，平衡時(shí)間分別為60 s、120 s、180 s，細(xì)胞的存活率如圖2所示。從圖中可以看出，解凍液濃度與平衡時(shí)間都對(duì)卵母細(xì)胞存活率有很大影響，卵母細(xì)胞在四種不同濃度解凍液中暴露60 s的細(xì)胞存活率均顯著低于暴露120 s和180 s，這是因?yàn)榧?xì)胞在溶解液中平衡時(shí)間短，胞內(nèi)外未達(dá)到滲透平衡狀態(tài)，細(xì)胞仍處于膨脹狀態(tài)，此時(shí)胞內(nèi)保護(hù)劑未能充分去除，高濃度保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞有毒性損傷。卵母細(xì)胞在解凍液中暴露180 s的存活率要低于120 s，但兩者之間無(wú)顯著性差異。

從圖中還可以看出，濃度為1 mol/L的解凍液處理后細(xì)胞存活率要高于其他實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)之前測(cè)得的溶液滲透壓值可知，濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 mol/ L的解凍液與VS2之間的滲透壓差分別是5 198、4 207、3 619、3 339 mOsm/kg，說(shuō)明并不是冷凍液VS2與解凍液間的滲透壓差越小，細(xì)胞的存活率就越高。這可能與低溫保護(hù)劑的加載過(guò)程有關(guān)，卵母細(xì)胞在VS2中僅平衡30 s，細(xì)胞內(nèi)滲透壓遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到與VS2平衡的滲透壓5 867 mOsm/kg，可能與1 mol/L的蔗糖溶液的滲透壓1 660 mOsm/kg接近。當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至不同濃度的解凍液中時(shí)，與細(xì)胞內(nèi)滲透壓最接近的解凍液，對(duì)細(xì)胞損傷最小。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)解凍液濃度為1 mol/L，平衡時(shí)間為120 s時(shí)，卵母細(xì)胞存活率最高，達(dá)到80.6%。

圖2　解凍液濃度與平衡時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of concentration of thaw ing solution and equilibration time on survival rate of porcine oocytes

2.4保護(hù)劑添加過(guò)程與去除過(guò)程的相關(guān)性

采用兩步法添加冷凍保護(hù)劑，并將卵母細(xì)胞在冷凍液VS2中分別平衡30 s、45 s、60 s、90 s、120 s、180 s，然后轉(zhuǎn)移至0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L四種濃度的解凍液中平衡120 s，卵母細(xì)胞的存活率如圖3所示。從圖中可以看出，當(dāng)卵母細(xì)胞在VS2中平衡時(shí)間為30 s時(shí)，解凍液濃度為1 mol/L處理的細(xì)胞存活率最高，2 mol/L處理的細(xì)胞存活率最低；當(dāng)卵母細(xì)胞在VS2中平衡時(shí)間為45 s、60 s、90 s、120 s、180 s時(shí)，解凍液濃度為2 mol/L和1.5 mol/L處理的細(xì)胞存活率較高。說(shuō)明卵母細(xì)胞在玻璃化溶液中的平衡時(shí)間改變后，其所對(duì)應(yīng)的解凍液條件也隨之發(fā)生變化。細(xì)胞在冷凍液VS2中平衡時(shí)間短，應(yīng)選擇低濃度的解凍液；反之，則選擇高濃度的解凍液。這可能是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)保護(hù)劑的滲透壓隨著平衡時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，增加解凍液濃度可以減小滲透壓差，從而提高細(xì)胞存活率［16］。Wang X等［18］對(duì)牛卵母細(xì)胞進(jìn)行了冷凍保護(hù)劑的分步添加和去除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明四步添加結(jié)合兩步去除的方案后細(xì)胞的卵裂率和囊胚率最高，說(shuō)明冷凍保護(hù)劑的去除與添加過(guò)程是相關(guān)的，兩者之間需要相匹配。此外，當(dāng)卵母細(xì)胞在VS2中平衡時(shí)間大于60 s時(shí)，所有濃度解凍液處理后的細(xì)胞存活率都隨著平衡時(shí)間的增加而減小，說(shuō)明細(xì)胞在高濃度冷凍液中的滲透損傷和毒性損傷很大，平衡時(shí)間不宜超過(guò)60 s。

圖3　解凍液濃度與豬卵母細(xì)胞在VS2中平衡時(shí)間的依賴(lài)關(guān)系Fig.3 The dependency between the concentration of thaw ing solution and the equilibration time in VS2to porcine oocytes

3　結(jié)論與展望

為了研究冷凍保護(hù)劑添加與去除過(guò)程對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞的損傷，采用了一步法和兩步法添加和去除冷凍保護(hù)劑，探究了冷凍液、解凍液、稀釋液對(duì)細(xì)胞存活率的影響。在冷凍保護(hù)劑添加和去除過(guò)程中，各溶液之間的滲透壓差是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要因素，其中溶液滲透損傷主要發(fā)生在細(xì)胞從玻璃化溶液轉(zhuǎn)移至解凍液，以及冷凍保護(hù)劑去除過(guò)程中。目前分步法是去除保護(hù)劑的常用方法，但卵母細(xì)胞保護(hù)劑的去除過(guò)程與加載過(guò)程是相關(guān)的，解凍液濃度和平衡時(shí)間的選擇依賴(lài)于細(xì)胞在冷凍液中的濃度和平衡時(shí)間。盡管優(yōu)化后的分步法減小了細(xì)胞的滲透損傷，但仍然無(wú)法避免細(xì)胞體積的驟變，而且實(shí)際操作的規(guī)范性不好掌握，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。為了彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)，提高卵母細(xì)胞低溫保存效果，微流體法能實(shí)現(xiàn)冷凍保護(hù)劑的連續(xù)性去除，可能是一種有效的去除方法。

本文受上海市自然科學(xué)基金（13ZR1429200）和上海市國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（1N15301101）項(xiàng)目資助。（The projectwas supported by the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 13ZR1429200）and the National Key Laboratory of Shanghai（No. 1N15301101）.）

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Zhou Xinli，female，associate professor，Institute of Biothermal Technology，University of Shanghai for Science and Technology，+86 21-55270218，E-mail:zjulily@163.com.Research fields: cryopreservation of biomaterials.The author takes on project supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51376132）:theoretical and experimental research on oocyte cryopreservation in microfluidic device.

Study on Injuries of Porcine M II-stage Oocytes during Cryoprotectants Addition and Removal Processes

Yang Yun1Zhou Xinli1Dai Jianjun2Zhang Defu2ShaoWenqi1Yi Xingyue1Tao Leren1

（1.Institute of Biothermal Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China；2.Animal and Veterinary Research Institute，SAAS，Shanghai，201106，China）

Cryoprotectants addition and removal are essential steps during oocytes cryopreservation，however，high concentration of cryoprotectantsmay cause osmotic and toxic injuries to oocytes.In order to study the injuries of porcine MII-stage oocytes during cryoprotectants addition and removal processes，cryoprotectantwas loaded and unloaded to/from oocytes with traditionalmethods（one-step method，two-step method），the effects of vitrification solution，thawing solution and dilution solution on the survival rate of oocyteswere investigated.The experimental results showed that the osmotic injuries to oocytes happenedmainly in two stages:the transfer process from vitrification solution to thawing solution，and the cryoprotectants removal process.The concentration of thawing solution and equilibrium time had a great influence on the survival rate of oocytes.The cryoprotectants removal processwas highly correlated with addition process，and the selection of thawing solution concentration and equilibrium time relied on the vitrification solution concentration and equilibrium time. These results could provide a reference for cryopreservation protocols of porcine MII-stage oocytes.

cryopreservation；cryoprotectants；osmotic injury；oocyte

About the

TB61+1；R318.52；Q27

A

0253-4339（2016）05-0106-06

10.3969/j.issn.0253-4339.2016.05.106

國(guó)家自然科學(xué)基金（51376132）資助項(xiàng)目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51376132）.）

2016年1月18日

簡(jiǎn)介

周新麗，女，副教授，上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所，（021）55270218，E-mail:zjulily@163.com。研究方向:生物材料的低溫保存。現(xiàn)在進(jìn)行的項(xiàng)目有:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51376132）——卵母細(xì)胞微流體低溫保存過(guò)程的理論與實(shí)驗(yàn)研究。