蘇 雪，何逸婷，林俊生

(華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021)

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適體和蛋白質(zhì)解離常數(shù)檢測(cè)方法比較分析*

蘇 雪，何逸婷，林俊生

(華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021)

對(duì)基于石英晶體微天平(QCM)生物傳感器的兩種檢測(cè)核酸適體與蛋白質(zhì)解離常數(shù)方法進(jìn)行了比較，提出來一種更加精確合理的檢測(cè)流程。以凝血酶和凝血酶適體TBA15為模型，耗散型石英晶體微天平(QCM-D)為傳感器，實(shí)時(shí)檢測(cè)末端修飾巰基適體的固定、表面封閉劑對(duì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉以及兩種不同的蛋白進(jìn)樣方式引起的頻率響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到解離常數(shù)。不同蛋白的進(jìn)樣方式得到的解離常數(shù)不同，非特異性位點(diǎn)的封閉也同樣影響解離常數(shù)的檢測(cè)。從低濃度到高濃度依次通入固定體積蛋白的進(jìn)樣方式，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高且消耗樣品量小于1 μg，是較為理想的檢測(cè)方式。

石英晶體微天平傳感器； 核酸適體； 蛋白質(zhì)； 解離常數(shù)

0 引 言

石英晶體微天平 (quartz crystal microbalance，QCM) 傳感器是一種以壓電效應(yīng)為理論基礎(chǔ)的壓電傳感器，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)分子與分子間、分子與細(xì)胞間的相互作用，檢測(cè)限可達(dá)到ng級(jí)[1]。由于具備無需標(biāo)記、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[2]，石英晶體微天平傳感器已廣泛應(yīng)用于材料化學(xué)、高分子、分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[3],檢測(cè)靶標(biāo)涉及蛋白[4]、小分子[5]、細(xì)菌[6]等。

適體是一種新型的功能性分子，經(jīng)過近30年的發(fā)展，由于其特異性和與靶標(biāo)的親和性可與現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的抗體相媲美，同時(shí)具有分子量小、免疫原性低、穩(wěn)定性高、易于修飾等特點(diǎn)，在傳感器方面的應(yīng)用[7]已越來越受到人們的關(guān)注。適體一般是短鏈的核酸分子或者多肽分子，靶標(biāo)可為小分子化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至特異性組織[8]。適體篩選傳統(tǒng)方法是指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)或其改進(jìn)技術(shù)，篩選完成后往往需要對(duì)適體的性能進(jìn)行表征。親和性是適體優(yōu)劣評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)之一[9]，不同的表征方法或者相同的方法不同的檢測(cè)方案均會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的差異。以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的適體分子的親和力檢測(cè)中，常用的方法有透析法、硝酸纖維素濾膜法、凝膠電泳法毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)等，表面等離子共振、石英晶體微天平、等溫滴定量熱法、熒光強(qiáng)度檢測(cè)等，其中表面等離子共振、硝酸纖維素濾膜法、石英晶體微天平三種方法的檢測(cè)限均在10-10～10-12mol，但硝酸纖維素濾膜法和表面等離子共振法的重復(fù)性較低，穩(wěn)定性差，實(shí)驗(yàn)過程和制備樣品復(fù)雜[10]。石英晶體微天平由于其實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性高，無需標(biāo)記且可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，正在越來越受到關(guān)注[11]。現(xiàn)有的石英晶體微天平傳感器檢測(cè)適體和靶標(biāo)蛋白的親和力的方法中存在兩種檢測(cè)方法，一種是使用不同芯片，單次固定核酸適體在芯片上，通入不同濃度固定體積的靶標(biāo)蛋白[12]；另一種是使用同一芯片，從低濃度到高濃度依次通入固定體積的靶標(biāo)蛋白[13]。

本文以凝血酶和凝血酶適體TBA15為模型，耗散型石英晶體微天平(quartz crystal microbalance with dissipation，QCM-D)傳感器為表征方法，對(duì)現(xiàn)有的石英晶體微天平檢測(cè)適體—蛋白的親和性的兩種方法進(jìn)行了對(duì)比。文獻(xiàn)查閱表明，Chen等人[14]和Jane Poloti等人[15]的研究中各使用了其中一種方法，但檢測(cè)得到的解離常數(shù)相差近一個(gè)數(shù)量級(jí)，存在較大差異，本文就這兩種方法及得到的結(jié)果差異進(jìn)行了探究，提出了一種更加合理，更加精確的檢測(cè)方法。

1 方法和材料

如圖1所示，運(yùn)用石英晶體微天平進(jìn)行核酸適體和蛋白質(zhì)接力常數(shù)檢測(cè)。首先，采用金硫鍵自組裝的方法進(jìn)行功能化芯片構(gòu)建，隨后利用封閉劑進(jìn)行封閉，最后通入靶標(biāo)蛋白檢測(cè)相互作用。

圖1 傳感器檢測(cè)流程簡(jiǎn)圖Fig 1 Flow chart of sensor detection

1.1 構(gòu)建核酸適體適體功能化芯片

AT切割的標(biāo)準(zhǔn)芯片(瑞典百歐林),基頻為5 Hz,在使用前用UV表面照射箱照射10 min后，用30 %過氧化氫：濃氨水：水= 2∶2∶10的溶液在75 ℃的條件下進(jìn)行水浴10 min，用18.0 Ω的超純水冷卻重懸后，氮?dú)獯蹈?，置于耗散型石英晶體微天平(瑞典百歐林，E4)模塊內(nèi)，實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置為20 ℃，流動(dòng)泵流速為20 μL/min。設(shè)置后，通入超純水穩(wěn)定系統(tǒng)后，再通入適體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合用的緩沖溶液(20 mmol Tris,pH 7.4,140 mmol NaCl,5 mmol KCl,5 mmol MgCl2,1 mmol CaCl2)，檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定后，在線通入300 μL(0.5 μmol)緩沖溶液配置的凝血酶特異性適體TBA15(SH—C6—TTT TTT TTT TTT TTT GGT TGG TGT GGT TGG，上海生工)，通入完成后，通入10 min緩沖液去除未結(jié)合在芯片表面的適體，實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)適體在芯片表面的固定量。

1.2 抗蛋白非特異性吸附表面構(gòu)建

由于蛋白質(zhì)在金芯片表面存在非特異性吸附，因此,需要在適體功能化的芯片表面進(jìn)行封閉。經(jīng)過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，常用的封閉劑為牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)[16]和6—巰基己醇(6—mercapto—1—hexanol,MCH)[17](sigma)。通入濃度為5 μM的BSA和MCH進(jìn)行芯片表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉，QCM-D實(shí)時(shí)表征封閉劑效果，并對(duì)比BSA、MCH和未封閉引起的信號(hào)差異。選擇合適的封閉劑，以直接在芯片表面構(gòu)建封閉劑組裝膜為blank，溶解素(北京索萊寶)為陰性蛋白對(duì)照組，Control(SH—C6—ATA CGA GCT TGT TCA ATA CCG ATA GGC GCG TCA GGG AGA CTG AAT CTC TG，上海生工)為陰性適體對(duì)照組，buffer組為空白組,對(duì)封閉劑的性能進(jìn)行表征。

1.3 適體與蛋白質(zhì)解離常數(shù)的檢測(cè)

運(yùn)用石英晶體微天平傳感器檢測(cè)適體與靶標(biāo)分子的解離常數(shù)，文獻(xiàn)中常用的方法有兩種，一種是使用不同芯片，單次固定核酸適體在芯片上，通入不同濃度固定體積的靶標(biāo)蛋白，根據(jù)濃度依賴曲線計(jì)算適體與靶標(biāo)的平衡力結(jié)合常數(shù)[18]；另外一種是使用同一芯片，單次固定核酸適體在芯片上，通入不同濃度固定體積的靶標(biāo)蛋白，根據(jù)濃度依賴曲線計(jì)算適體與靶標(biāo)的平衡力結(jié)合常數(shù)[19]。本文以凝血酶為模型，分別用文獻(xiàn)中已報(bào)道的兩種方法進(jìn)行凝血酶適體TBA15與靶標(biāo)蛋白質(zhì)凝血酶的親和力進(jìn)行檢測(cè)，以此比較兩種檢測(cè)方法的優(yōu)劣并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 核酸適體功能化芯片表征

石英晶體微天平可對(duì)適體在芯片表面的固定進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，如圖1所示。石英晶體微天平是以壓電效應(yīng)為理論基礎(chǔ)的傳感器，根據(jù)Sauerbrey方程可知，其頻率變化與芯片表面的質(zhì)量變化存在線性關(guān)系，芯片表面固定的質(zhì)量增大，其頻率降低[20]。從圖2中可看出，適體通入后在芯片固定，芯片表面的質(zhì)量增加，頻率下降，表示適體在芯片表面固定成功；本實(shí)驗(yàn)采用的是最經(jīng)典的金硫鍵自組裝膜的固定方法，末端—SH修飾的適體可在較短時(shí)間內(nèi)(幾分鐘)在金表面進(jìn)行固定，構(gòu)建完成核酸適體功能化的芯片。

圖2 適體固定實(shí)時(shí)檢測(cè)Fig 2 Immobilization of aptamer monitored in real time

2.2 抗蛋白非特異性吸附表面表征

由于適體的進(jìn)樣量有限，核酸適體功能化的芯片表面仍存在裸露的結(jié)合部位，蛋白在這些區(qū)域容易進(jìn)行非特異性的吸附，因此,需要加入封閉劑對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行封閉處理，本研究中探討了石英晶體微天平中兩種常用的封閉劑MCH、 BSA。本實(shí)驗(yàn)使用的是耗散型的石英晶體微天平，同時(shí)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片表面制備的膜的性能變化，芯片表面分子柔性越大，耗散因子增大。如圖3(a)可知，與未封閉組相比，MCH組芯片表面結(jié)合的蛋白量比空白組少，但是耗散變化大于空白組，表面芯片表面形成的適體—蛋白的復(fù)合物的量大于空白組，反之，可以說明空白組中結(jié)合的一部分蛋白與芯片表面發(fā)生了非特異性結(jié)合。BSA組的效果比MCH組效果差，因此，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCH是較理想的封閉劑。如圖3(b)可知，buffer組，blank組，control組和溶解素組引起的信號(hào)響應(yīng)明顯低于TBA15實(shí)驗(yàn)組，因此MCH是較理想的封閉劑。

圖3 非特異性位點(diǎn)封閉劑表征Fig 3 Representation of block agent for blocking non-specific binding site

2.3 解離常數(shù)的測(cè)定

適體與靶標(biāo)的親和力的表征一般的方法是檢測(cè)適配體與靶標(biāo)的解離常數(shù)KD值。利用兩種不同的方法進(jìn)行解離常數(shù)的檢測(cè)，如圖4(a)所示,利用第一種方法(binding assay 1)，頻率的變化隨著蛋白濃度的變化而增大。但由于在檢測(cè)過程中使用了不同的芯片,適體在芯片上的狀態(tài)存在差異，如圖4(c)所示，3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的誤差較大。利用第二種方法(binding assay 2)，由圖4(b)所示，在同一核酸適體功能化的芯片表面依次通入不同濃度等體積的凝血酶蛋白，頻率依次下降。隨著濃度的增大，頻率下降的幅度先減后增。由于在同一功能化的芯片表面進(jìn)行，如圖4(d)所示，在實(shí)驗(yàn)過程中的3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)誤差較小。此外。就實(shí)驗(yàn)次數(shù)和樣品用量而言，第一種方法檢測(cè)，需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)次數(shù)是15次，而第二方法檢測(cè)需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)為 3次，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。由于靶標(biāo)分子為凝血酶蛋白，適體與蛋白的結(jié)合與其酶活有一定的關(guān)系，第一種檢測(cè)方案中，每次需要使用新配置的蛋白，蛋白消耗量大，第二種方案需要使用的蛋白量小于1 μg。運(yùn)用軟件GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一種方案檢測(cè)得到的KD值為119 nmol,第二種檢測(cè)方案得到的KD值為43.24 nmol。因此，這兩種檢測(cè)方法得到的KD值差異較大。

圖4 解離常數(shù)檢測(cè)Fig 4 Detecion of dissociated constant

2.4 分析與討論

凝血酶與TBA15的親和力檢測(cè)使用的方法很多，KD值為2～170 nmol不等[21]，結(jié)果差異較大。本文以石英微天平傳感器為表征方法，檢測(cè)后得到的解離常數(shù)分別為119,43.24 nmol。前者檢測(cè)方法與2010年Chen等人利用石英晶體微天平表征方法相同，但比其得到的解離常數(shù)(159±30) nmol小，差異在于本研究使用的是將適體固定在芯片表面后進(jìn)行非特異性位點(diǎn)的封閉，Chen的研究使用的是混合固定方法，封閉劑使用的是MCH,易揮發(fā)，因此，適體在芯片上固定量存在較大差異，導(dǎo)致解離常數(shù)較大。后者與Jane Poloti[15]檢測(cè)結(jié)果存在差異，比其檢測(cè)得到的(17.7±0.3) nmol大。對(duì)比實(shí)驗(yàn)過程，Jane Poloti在實(shí)驗(yàn)中沒有進(jìn)行非特異性位點(diǎn)封閉，因此,在適體功能化芯片上蛋白的結(jié)合量大于進(jìn)行了非特異性位點(diǎn)封閉結(jié)果，導(dǎo)致其解離常數(shù)變小。本實(shí)驗(yàn)中，將適體固定的在線定量檢測(cè)和高度精確的非特異性位點(diǎn)封閉方法結(jié)合，進(jìn)行TBA15和凝血酶的解離常數(shù)檢測(cè)，得到了一個(gè)較合理的解離常數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，能夠迅速準(zhǔn)確地得到精度較高的檢測(cè)結(jié)果。

3 結(jié) 論

綜上所述，QCM生物傳感器檢測(cè)核酸適體與蛋白質(zhì)解離常數(shù)方法可因蛋白進(jìn)樣方式，封閉劑種類及封閉劑使用發(fā)生而存在差異，可能的原因是適體與蛋白在芯片表面形成的復(fù)合物和封閉劑與適體在芯片表面的分布由于空間位阻對(duì)蛋白的結(jié)合有影響。該研究可為基于石英晶體微天平檢測(cè)適體與蛋白質(zhì)靶標(biāo)或者其他分子靶標(biāo)檢測(cè)方法的建立提供較有力的證據(jù)。

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林俊生,通訊作者，E—mail junshenglin@hqu.edu.com。

Comparative analysis of detection methods for dissociation constant of aptamer and protein*

SU Xue,HE Yi-ting,LIN Jun-sheng

(School of Biomedical Science,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

Compare the two detection methods of dissociated constant of aptamer and protein based on quartz crystal microbalance(QCM)biosensor,a protocol with high accuracy and reasonability is introduced. Thrombin and thrombin aptamer named TBA15 are used as models.The immobilization of thiolated aptamer,the block of the non-specific site and the signal response induced by two different sampling methods are monitored by QCM with dissipation(QCM-D)biosensor in real time and dissociated constant are calculated by data fitting.Dissociated constant are different when different sampling methods are used,and different block agent applied,blocking of nonspecific site.The sampling method with fixed bulk of protein from low concentration to high concentration are proved ideal method with high repeatability and fewer regents needed which is less than 1 μg.

quartz crystal microbalance(QCM)sensor;aptamer;protein;dissociated constant

10.13873/J.1000—9787(2016)11—0047—04

2016—10—14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270734)； 華僑大學(xué)高層次人才項(xiàng)目(13Y0391)

Q 31

A

1000—9787(2016)11—0047—04

蘇 雪(1991-)，女，江西撫州人，碩士研究生，研究方向?yàn)檫m體與靶標(biāo)結(jié)合表征。