王　聰，董永義，賈俊英，包金花，馬玉露，鄭　毅

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042）

NaCl 脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆葉綠體抗氧化系統(tǒng)的影響

王聰，董永義，賈俊英，包金花，馬玉露，鄭毅

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042）

【目的】葉綠體是植物體產(chǎn)生活性氧（ROS）、且對鹽最敏感的細胞器，本試驗研究了外源殼聚糖對 NaCl脅迫下菜用大豆［Glycine max（L.）Merr.］葉綠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響，以期探討殼聚糖對 NaCl 脅迫下光合作用的調(diào)節(jié)機制。【方法】試驗于 2014年4 月至 6 月在內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗基地日光溫室內(nèi)進行。采用蛭石栽培，選用菜用大豆鹽敏感品種 ‘理想高產(chǎn) 95-1’（LX）、耐鹽品種‘綠領(lǐng)特早’（LL）為試材。試驗設(shè) 4 個處理：1）葉面噴灑清水，根部澆灌營養(yǎng)液（對照）；2）葉面噴灑殼聚糖溶液，根部澆灌營養(yǎng)液；3）葉面噴灑清水，根部澆灌溶有NaCl 的營養(yǎng)液；4）葉面噴灑殼聚糖溶液，根部澆灌溶有 NaCl 的營養(yǎng)液?！窘Y(jié)果】外源殼聚糖顯著降低了 NaCl脅迫下兩品種菜用大豆葉綠體 H2O2的含量，顯著提高了過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性以及脅迫中期還原型抗壞血酸（AsA）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量；與鹽敏感品種 LX 相比，耐鹽品種 LL 在脅迫 6～15 d 期間維持了相對較低的 H2O2含量，相對較高的 DHAR 活性及AsA 含量，在整個脅迫期間維持了相對較高的 APX、GR、GPX 活性，在脅迫后期（12 d、15 d）維持了相對較高的GSH含量。【結(jié)論】外源殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體內(nèi) POD 活性及AsA-GSH 循環(huán)產(chǎn)生了顯著誘導(dǎo)作用，但對不同品種的誘導(dǎo)效果不同，耐鹽品種 LL 的 AsA-GSH 循環(huán)維持了相對較強的活性氧清除能力，這可能是其維持較強光合能力，進而維持較旺盛生長的重要原因之一。

外源殼聚糖；NaCl 脅迫；葉綠體；抗氧化系統(tǒng)

殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮玫降囊环N聚氨基葡萄糖，甲殼素在自然界的合成量僅次于纖維素，是地球上第二大可再生資源，是一種非常廉價、清潔的化學(xué)物質(zhì)，被認為是很有潛力的非生物脅迫抗性誘導(dǎo)劑。有研究表明，鹽脅迫下外源殼聚糖可提高黃瓜［1］、豇豆［2］SOD、POD 等酶活性，顯著緩解鹽害癥狀。水分脅迫下噴施殼聚糖可明顯提高辣椒谷胱甘肽（GSH）及抗壞血酸（AsA）的含量，降低細胞質(zhì)膜相對透性和 MDA 的含量［3］。殼聚糖通過降低AsA-GSH 循環(huán)活性以提高 H2O2含量，進而刺激干旱脅迫下水稻的生長，這也說明 H2O2是殼聚糖誘導(dǎo)抗旱反應(yīng)過程中的信號分子［4］。上述研究也表明，外源殼聚糖對相同脅迫下不同種類植物的抗性誘導(dǎo)機制不盡相同。

葉綠體是植物光合作用最重要的細胞器，也是細胞中對鹽最敏感的細胞器［5］。鹽脅迫會導(dǎo)致植物葉綠體中 H2O2含量大幅增加［6，7］，致使膜脂過氧化，進而影響植物光合作用的正常進行。王聰?shù)龋?］研究表明，NaCl 脅迫可導(dǎo)致菜用大豆凈光合速率大幅下降，而外源殼聚糖通過誘導(dǎo)非氣孔因素顯著緩解了其凈光合速率的下降。葉綠體抗氧化系統(tǒng)是維持葉綠體內(nèi)活性氧（ROS）動態(tài)平衡，促進光合作用正常進行的重要保護系統(tǒng)。NaCl 脅迫下外源殼聚糖是否對菜用大豆葉綠體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著影響？產(chǎn)生了怎樣的影響？尚未見報道。本研究用殼聚糖處理NaCl 脅迫下不同耐鹽性菜用大豆品種，測定其葉綠體中抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的變化，以探討外源殼聚糖對葉綠體抗氧化系統(tǒng)的影響，進而探明殼聚糖調(diào)控光合作用的生理機制。

1　材料與方法

1.1試材培育

菜用大豆［Glycine max（L.）Merr.］品種選用鹽敏感品種‘理想高產(chǎn) 95-1’（LX）、耐鹽品種‘綠領(lǐng)特早’（LL）［9］，試驗于 2014年4 月至 6 月在內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗基地日光溫室內(nèi)進行。干種子直播于上直徑25 cm、下直徑 15 cm、高 20 cm 的塑料盆中，蛭石作基質(zhì)，澆灌日本園試營養(yǎng)液，每盆定苗 4 株。真葉展開后每 3 d 澆 1/4 濃度（是菜用大豆苗期的適宜濃度，不會影響其抗鹽性）日本園試營養(yǎng)液1次，每盆澆液 0.5 L。

1.2殼聚糖誘導(dǎo)及NaCl 處理

試驗設(shè)如下處理：1）對照（CK）葉面噴灑清水，根部澆灌營養(yǎng)液；2）處理 1（T1）葉面噴灑殼聚糖溶液，根部澆灌營養(yǎng)液；3）處理 2（T2）葉面噴灑清水，根部澆灌溶有 NaCl 的營養(yǎng)液；4）處理 3（T3）葉面噴灑殼聚糖溶液，根部澆灌溶有 NaCl 的營養(yǎng)液。每處理 15 盆，3次重復(fù)。NaCl 處理的適宜濃度為100 mmol/L［8］；殼聚糖處理的適宜濃度為 200 mg/L（2013年預(yù)備試驗篩選）。

2 片真葉完全展開后，用手持小型噴霧器將殼聚糖溶液均勻噴灑在幼苗葉片的正面和背面，以量足但不下滴為宜，對照和處理 3 噴灑清水。誘導(dǎo)處理 5 d后進行 NaCl 處理，NaCl 溶于 1/4 濃度日本園試營養(yǎng)液，均勻澆入處理 2 和處理 3 基質(zhì)中，每 3 d 澆液一次，澆液量同上。對照和處理 1 僅澆營養(yǎng)液。

1.3測定項目及方法

NaCl 處理 0d 開始取葉測定，以后每 3 d 測定一次，共測定6次。處理 15 d（T2 處理植株葉片出現(xiàn)明顯褪綠、黃化癥狀）后測幼苗全株干重。

1.3.1葉綠體制備參照孫錦［10］的方法提取，在Takeda 等［11］的基礎(chǔ)上略作改動。10 g 去葉脈的新鮮葉片加 20 mL 提取緩沖液（MES 50 nmol/L， pH 6.1 ，含山梨糖醇 0.33 mol/L、NaCl 10 mol/L 、MgCl22 mol/L、EDTA 2 mol/L、KH2PO40.5 mol/L、AsA-Na 2 mol/L，AsA-Na 使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）快速研磨，使葉片碎成綠豆粒大小，4 層紗布過濾，濾液 2000×g 離心 3 min，倒出上清液，沉淀用 l mL 提取緩沖液漂洗表面懸浮物；然后用 1 mL 懸浮液（HEPES 50 mmol/L，pH 7.6，含山梨糖醇 0.33 mmol/L、NaCl 10 mmol/L、MgCl22 mmol/L、 EDTA 2 mmol/L、KH2PO40.5 mmol/L、AsA-Na 2 mmol/L，AsA-Na 使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）將沉淀懸浮。為保證葉綠體純度，用Percol 試劑進行梯度離心，完整率可達 90%。

1.3.2酶活性、抗氧化物質(zhì)、H2O2及蛋白質(zhì)含量測定過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性及還原型抗壞血酸（AsA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、H2O2、蛋白質(zhì)含量均采用試劑盒測定（購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。以試劑盒提供的提取液懸浮葉綠體后，按試劑盒所述方法測定。

測定原理：POD 催化 H2O2氧化特定底物后在470 nm 下有特定吸收峰，通過測定 470 nm 光吸收度的變化值計算 POD 的活性；APX 催化 H2O2氧化AsA，通過測定 AsA 氧化速率來計算 APX 活性；MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和NAD+，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD+沒有，通過測定 340 nm 光吸收下降速率，來計算MDHAR 活性；DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成AsA，通過測定 DHA 減少速率，計算 DHAR 活性；GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生 GSH，同時NADPH 脫氫生成 NADP+，NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP+在該波長下無吸收峰，通過測定 340 nm 吸收度下降速率來測定 NADPH 脫氫速率，從而計算 GR 活性；GPX 催化 H2O2氧化 GSH，產(chǎn)生 GSSG，GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生GSH，通過測定 340 nm 吸收度下降速率來計算 GPX活性；抗壞血酸氧化酶催化 AsA 生成 DHA，通過測定 AsA 的氧化速率可計算出AsA含量；二硝基苯甲酸與 GSH 反應(yīng)生成復(fù)合物，在 412 nm 處有特征吸收峰，其吸光度與GSH含量成正比；H2O2與硫酸鈦生成黃色過氧化鈦復(fù)合物，在 415 nm 有特征吸收，吸光度與 H2O2成正比；蛋白質(zhì)含量采用 BCA 法測定。

1.3.3葉綠素含量測定以丙酮懸浮葉綠體后，按Arnon［12］的方法測定。

1.4數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用 SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆幼苗干重的影響

由圖1可知，NaCl 脅迫 15 d后，鹽敏感品種（LX）及耐鹽品種（LL）經(jīng)葉面噴灑殼聚糖溶 液，根部澆灌營養(yǎng)液的 T1處理后的干重均與對照無顯著差異；葉面噴灑清水， 根部澆灌溶有 NaCl 的營養(yǎng)液的T2條件下，兩品種的干重均顯著低于對照，降幅分別為 28%、19%，葉面噴 灑殼聚糖溶液，根部澆灌溶有 NaCl 的營養(yǎng)液的T3處理顯著提高了 LX及LL品種的干重，較 T2的增幅分別為 15%、25%，且 LL品種的干重達對照水平。表明外源殼聚糖可緩解或阻止鹽脅迫對菜用大豆生長的抑制作用，但對耐性不同的品種其誘導(dǎo)效果不同，LL 品種維持了相對較高的干質(zhì)量；無鹽條件下，外源殼聚糖對菜用大豆干質(zhì)量的誘導(dǎo)作用不顯著。

圖1　殼聚糖對 NaCl 脅迫下兩個品種菜用大豆干重的影響Fig.1　Effect of chitosan on dry biomass of soybean under NaCl stress

2.2殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 H2O2含量的影響

圖2　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 H2O2含量的影響Fig.2　Effect of chitosan on H2O2content of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

2.3殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 POD活性的影響

POD 是植物細胞內(nèi)重要的保護酶，在清除 H2O2中起重要作用。圖3顯示，T1 處理顯著提高了 LX及LL 品種在 0、3 d 時的 POD 活性。T2 處理后，LX 品種在 3 d 時的活性未受顯著影響，隨后均較對照顯著下降，T3 處理顯著提高了脅迫 6～15 d 期間的活性，其中 6、15 d 時達對照水平，9、12 d 時顯著高于對照。LL 品種的 POD 活性在 T2 處理 3 d 時顯著高于對照，但隨著脅迫時間的延長，之后各期的活性均受到顯著抑制，T3 處理使其活性在整個脅迫期間均較 T2 處理顯著升高，其中 6～15 d 期間均達對照水平?？梢娡庠礆ぞ厶菍Σ煌贩N POD 活性的誘導(dǎo)時期及效果不同，LL 在脅迫早期（3 d）維持了相對較高的 POD 活性，但在中、后期并未表現(xiàn)出優(yōu)勢。

圖3　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 POD 活性的影響Fig.3　Effect of chitosan on POD activity of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

2.4殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 AsAGSH 循環(huán)的影響

2.4.1對葉綠體AsA含量的影響AsA 是葉綠體內(nèi)重要 的抗氧化劑，在清除 H2O2過程中發(fā)揮著重要作用。圖4顯示，T1 處理使 LX 在 0d 、3 d 時的 AsA含量顯著高于對照；T2 條件下，3 d、9 d 時的含量較對照顯著升高，6 d 時接近對照水平，12 d 、15 d時則顯著低于對照；T3 處理顯著提高了脅迫 3 d、6 d 、9 d 時的AsA含量，但 12 d、15 d 時未產(chǎn)生顯著影響。LL 品種的AsA含量在 T1 處理 0d 時較對照顯著升高，3 d 時則顯著下降；T2 處理條件下，3 d時的含量顯著高于對照，12 d、15 d 時受到顯著抑制，但降幅低于同期的 LX 品種；T3 處理顯著提高了脅迫 6 d、9 d 時的AsA含量，且其較對照的增幅高于同期的 LX 品種，12 d、15 d 時維持在 T2 處理水平。表明殼聚糖使 LL 品種在脅迫 6～15 d 期間維持了相對較高的AsA含量；無鹽條件下，殼聚糖對兩品種早期 AsA 的形成產(chǎn)生了不同的影響。

圖4　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 AsA、GSH 含量的影響Fig.4　Effect of chitosan on AsA and GSH content of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

2.4.2對葉綠體GSH含量的影響GSH 通過促進AsA 再生參與清除 H2O2。由圖4可知，與對照相比，T1 處理顯著降低了 LX 品種在 0 d、3 d 時的含量；T2 處理后，脅迫 6 d 時的含量顯著升高，其余時期均較對照顯著降低；T3 處理 3 d 時的含量未受顯著影響，之后各期均顯著高于 T2 處理，且 6 d、9 d 時的含量顯著高于對照。T1 處理下，LL 品種在 0 d、3 d 時的含量顯著低于對照，其余時期均維持在對照水平；T2 處理使 LL 品種在整個脅迫期間的含量均顯著降低，T3 處理顯著提高了脅迫各期的 GSH含量，其中 6～9 d 時維持在對照水平，其余各期均顯著低于對照，但 12 d、15 d 時的降幅低于同期的LX 品種。表明外源殼聚糖使 LL 品種在脅迫后期（12 d、15 d）維持了相對較高的GSH含量，對無鹽條件下早期 GSH 的形成產(chǎn)生了顯著抑制作用。

2.4.3對葉綠體 APX 活性的影響APX 可以 AsA 為電子供體直接清除 H2O2。T1 處理條件下，兩品種的APX 活性在 0 d、3 d 時均顯著高于對照。LX 品種在T2 處理 3 d 時的活性與對照無顯著差異，其余時期均顯著降低，T3 處理使脅迫 6 d、9 d、12 d 時的活性顯著提高，但均顯著低于對照。LL 品種的 APX活性在 T2 處理 3～9 d 期間維持在對照水平，12 d 時出現(xiàn)下降趨勢，至 15 d 時降幅達 19%，T3 處理使整個脅迫期間的 APX 活性顯著升高，且 3～12 d 期間均顯著高于對照，15 d 時回落至對照水平（圖5）。表明外源殼聚糖使 LL 品種在整個脅迫期間均維持了相對較高的 APX 活性。

2.4.4對葉綠體 MDHAR 活性的影響MDHAR 催化單脫氫抗壞血酸（MDHA）還原形成 AsA，在 AsA 還原過程中發(fā)揮著重要作用。由圖5可知，T1 處理使LX 品種在 0 d、3 d 時的 MDHAR 活性顯著升高；T2處理條件下，脅迫 3 d 時的活性顯著升高，12 d、15 d 的活性則受到顯著抑制，T3 處理顯著誘導(dǎo)了脅迫 6 d、9 d、12 d 時的 MDHAR 活性。LL 品種T1 處理 0d 時的 MDHAR 活性顯著升高；T2 處理后，12 d、15 d 時的活性受到顯著抑制，T3 處理顯著提高了脅迫 3～12 d 時的活性，但與 LX 品種相比，其在中、后期（6～15 d）的活性并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

圖5　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 APX 和 MDHAR活性的影響Fig.5　Effect of chitosan on APX and MDHAR activity of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

2.4.5對葉綠體 DHAR 活性的影響DHAR 催化脫氫抗壞血酸（DHA）還原形成 AsA，是 AsA-GSH 循環(huán)的關(guān)鍵酶。圖6顯示，T1 處理使 LX 品種在 0 d、3 d 時的 DHAR 活性顯著高于對照；T2 處理在脅迫 3 d 時的活性顯著升高，但 6 d 時開始顯著下降，至 15 d 時降幅達 38%，T3 處理使脅迫 3 d、6 d、9 d 時的活性顯著高于 T2 處理，但 6 d、9 d 時的活性顯著低于對照。LL 品種在 T1 處理 0d 時的 DHAR 活性顯著升高；T2 處理后，3 d 時的活性顯著升高，6 d、9 d 時回落至對照水平，之后開始顯著下降，至 15 d時降幅達 37%；T3 處理對脅迫 6～15 d 時的活性產(chǎn)生了持續(xù)誘導(dǎo)作用，其中 6 d、9 d 時顯著高于對照，12 d 時仍維持在對照水平，15 d 時顯著低于對照，但降幅低于同期的 LX 品種。說明外源殼聚糖使LL 品種在脅迫中、后期（6～15 d）維持了相對較高的DHAR 活性。

圖6　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 DHAR 活性的影響Fig.6　Effect of chitosan on DHAR activity of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

2.4.6對葉綠體 GR 活性的影響GR 催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原形成 GSH，是 AsA-GSH 循環(huán)的關(guān)鍵酶。由圖7可看出，T1 處理使 LX 品種在 0、3 d時的 GR 活性顯著升高；T2 處理導(dǎo)致整個脅迫期間的活性均顯著降低；T3 處理后 GR 活性的起伏較大，脅迫 3 d 時處于 T2 水平，之后大幅上升，9 d 時達峰值，且 6 d、9 d 時的活性均顯著高于對照，之后又大幅下降，但 12 d、15 d 時的活性仍顯著高于T2處理。LL 品種在 T1 處理 0d 時的活性顯著高于對照；T2 處理 3～9 d 時的活性維持在對照水平，之后均顯著下降；T3 處理使整個脅迫期間的 GR 活性均大幅升高，其中 6 d、9 d 時較對照的增幅高于同期的 LX 品種，15 d 時回落至對照水平。說明殼聚糖作用下，LL 品種在整個脅迫期間均維持了相對較高的 GR 活性。

圖7　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 GR 活性的影響Fig.7　Effect of chitosan on GR activity of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

2.4.7對葉綠體 GPX 活性的影響GPS 是機體抗氧化防御體系中的重要酶之一，其以 GSH 為底物清除H2O2。由圖8可知，T1 處理條件下，LX 品種的GPX 活性在 0 d、3 d 時顯著高于對照；T2 處理使整個脅迫期間的活性均較對照大幅下降；T3 處理后，脅迫 3 d 時的活性維持在 T2 處理水平，之后各期均較 T2 處理顯著升高，其中 6 d、12 d 時接近對照水平，9 d 時顯著高于對照。LL 品種的 T1 處理在整個期間未對 GPX 活性產(chǎn)生顯著影響；T2 處理使其活性在脅迫 3～12 d 期間顯著高于對照，15 d后受到顯著抑制；T3 處理使整個脅迫期間的 GPX 活性均較 T2 處理大幅升高，且均顯著高于對照，其中 9 d 時較對照的增幅高于同期的 LX 品種。說明外源殼聚糖使 LL 品種在整個脅迫期間均維持了相對較高的 GPX 活性。

圖8　殼聚糖對 NaCl 脅迫下菜用大豆葉綠體 GPX 活性的影響Fig.8　Effect of chitosan on GPX activity of vegetable soybean chloroplast under NaCl stress

3　討論

ROS 的過量產(chǎn)生是環(huán)境脅迫導(dǎo)致植物次生氧化損傷的主要誘因之一。本試驗結(jié)果表明，外源殼聚糖顯著緩解了 NaCl 脅迫 15 d 時兩品種菜用大豆干重的下降，且耐鹽品種 LL 維持了相對較高的干質(zhì)量（圖1）；顯著抑制了脅迫期間兩品種葉綠體 H2O2的產(chǎn)生，且 LL 品種維持了相對較低的 H2O2含量（圖2）。表明外源殼聚糖對菜用大豆葉綠體的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著誘導(dǎo)作用，及時清除了過量的 H2O2；LL 品種由于維持了相對較強的 H2O2清除能力，緩解了鹽脅迫對其造成的傷害，使光合系統(tǒng)能夠正常運轉(zhuǎn)，進而維持了相對較高的干質(zhì)量。

由于葉綠體內(nèi)不含過氧化氫酶（CAT），因此葉綠體內(nèi) H2O2清除主要依賴于 POD及AsA-GSH 循環(huán)［13］。SOD 將 O2-歧化生成 H2O2和 O2，然后由POD、AsA-GSH 循環(huán)等將 H2O2分解成無毒的 H2O和 O2。本研究中，外源殼聚糖顯著提高了鹽脅迫下兩品種菜用大豆葉綠體的 POD 活性（圖3）。暗示在殼聚糖誘導(dǎo)下，POD 在清除葉綠體 H2O2過程中可能發(fā)揮了積極作用，但與鹽敏感品種 LX 相比，耐鹽品種 LL 的 POD 活性在脅迫中、后期并未表現(xiàn)出優(yōu)勢，因此，POD 活性在 LL 品種維持較強抗氧化能力過程中并未發(fā)揮重要作用。

AsA-GSH 循環(huán)是一個復(fù)雜的酶促循環(huán)系統(tǒng)，而APX、MDHAR、DHAR 是 AsA-GSH 循環(huán)的關(guān)鍵酶。APX 以 AsA 為電子供體實現(xiàn)對 H2O2的清除，因此 APX 活性與AsA含量在某種程度上呈負相關(guān)關(guān)系［14］。被氧化的 AsA 形成 MDHA，進而歧化形成DHA，MDHAR及DHAR 分別將 MDHA及DHA 還原生成 AsA。王玉等［15］研究表明，UV-B 脅迫下葉綠體 MDHAR 基因（LeMDHAR）過表達番茄植株的MDHAR 活性及AsA 含量均顯著高于野生型番茄，表明葉綠體 MDHAR 對 AsA 再生具有重要作用。DHAR 同樣在葉綠體 AsA 再生過程中發(fā)揮著重要作用［16］。AsA 是葉綠體內(nèi)重要的抗氧化劑，存在于類囊體膜和葉綠體的基質(zhì)中［17］，能夠直接或間接地清除O2、O2-、·HO及H2O2［18］。本研究結(jié)果顯示，外源殼聚糖顯著提高了兩品種菜用大豆在脅迫前、中期的AsA 含量，此外還顯著誘導(dǎo)了 APX、MDHAR及DHAR 等活性的增加。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在 APX及MDHAR 未受顯著影響、DHAR 活性顯著升高的情況下，外源殼聚糖使 LX 品種在脅迫 3 d 時的 AsA含量顯著升高，說明 DHAR 在 LX 品種的 AsA 再生過程中發(fā)揮著重要作用；12 d 時，在 DHAR 未受顯著影響，APX、MDHAR 活性均受殼聚糖誘導(dǎo)較鹽脅迫顯著升高的情況下，AsA 的含量維持在鹽脅迫水平，說明 MDHAR 在 LX 品種的 AsA 再生過程中同樣發(fā)揮了重要作用（圖4、圖5、圖6），這與王玉等［15］及Asada［16］的結(jié)果相符。同樣，根據(jù)殼聚糖處理后LL 品種在脅迫 3 d、15 d 時 APX、MDHAR、DHAR活性及AsA 含量的變化情況可推測 MDHAR及DHAR 在 LL 品種的葉綠體 AsA 再生過程中均發(fā)揮著重要作用（圖4、圖5、圖6）。據(jù)此可認為，APX、MDHAR及DHAR 等的綜合作用是影響AsA含量的一個重要因素。NaCl 脅迫下，外源殼聚糖通過誘導(dǎo)APX、MDHAR及DHAR 等的活性，并且維持各酶活性協(xié)調(diào)變化，促進 AsA 的氧化、再生，進而加速對 H2O2的清除。LL 品種由于維持了相對較高的APX、DHAR 活性及AsA 含量（圖4、圖5、圖6），進而使 AsA-GSH 循環(huán)能更為持久快速、有效運轉(zhuǎn)，這可能是其產(chǎn)生較強 H2O2清除能力的重要原因之一。

與上述結(jié)果相對應(yīng)，外源殼聚糖還持續(xù)提高了鹽脅迫下菜用大豆葉綠體GSH含量及GR 活性（圖4、圖7）。GSH 可作為 DHA 再生 AsA 的電子供體，其氧化還原過程通過 AsA-GSH 循環(huán)與 AsA 相聯(lián)系，在促進 AsA 再生上具有重要作用［19］。而 GR 的活性直接影響 GSH 庫的水平，GR 活性的提高能夠維持植物體內(nèi)較高的GSH含量和合適的 GSH/GSSG 比值，并在保持細胞氧化還原勢方面發(fā)揮重要作用［20］。此外，外源殼聚糖還顯著提高了菜用大豆葉綠體 GPX 的活性（圖8）。GPX 是酶促清除機制中的關(guān)鍵酶類［21］，可以催化 GSH 與 H2O2反應(yīng)生成 GSSG及水，從而阻止 OH·自由基的產(chǎn)生［22］。研究表明，過表達 PeGPX 基因使煙草耐鹽性顯著提高［23］。降低擬南芥葉綠體中 AtGPX1 與 AtGPX7 基因的表達后，轉(zhuǎn)基因植株的抗光氧化脅迫能力顯著降低［25］?？梢姡珿PX在提高植物抗逆性方面具有重要作用。而 GSH 的抗氧化作用是通過使 DHA 還原以及作為 GPX 的催化底物實現(xiàn)的。鹽脅迫下，外源殼聚糖通過誘導(dǎo) GR及GPX 活性（圖7、圖8），以促進 GSH 的再生及AsA 的還原，加速對 H2O2的清除。值得注意的是，殼聚糖使鹽敏感品種 LX 在脅迫 6 d、9 d 時保持了相對較高的GSH含量。但進一步分析發(fā)現(xiàn)，這可能是由于此期間 GR、GPX、DHAR 三者活性變化不協(xié)調(diào)（GR 活性受誘導(dǎo)較對照大幅升高，GPX 活性僅在脅迫 9 d 時高于對照，但增幅遠小于同期 GR，DHAR活性則顯著低于對照），致使 GSH 氧化受阻所致（圖4、圖6、圖7、圖8）。而在此過程中，耐鹽品種LL 維持了相對較高且協(xié)調(diào)平衡的 GR、GPX及DHAR 活性，使GSH含量較長時期保持在適宜水平（圖4），促進了 AsA-GSH 循環(huán)持續(xù)快速、有效運轉(zhuǎn)，為 AsA 的再生及H2O2的清除提供了有力保障。外源殼聚糖誘導(dǎo) LL 品種在脅迫期間維持相對較高的AsA 含量和相對較低的 H2O2含量就充分反映了這一點。

研究表明，外源殼聚糖是通過激活甲殼素誘導(dǎo)受體激酶 1（chitin elicitor receptor kinase 1， CERK1）機理發(fā)揮作用的［27］。當(dāng)植物細胞感受到幾丁質(zhì)時，細胞表面受體-CERK1 通過其賴氨酸酸基（lysine motif，LysM）直接與甲殼素結(jié)合（含胞外段），植物細胞膜上的 CERK1 通過胞外 LysM 結(jié)構(gòu)域二聚化來完成配體感應(yīng)，使其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域磷酸化并激活下游防衛(wèi)反應(yīng)信號通路［28］。可見，殼聚糖是通過直接作用于細胞膜系統(tǒng)來誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的。NaCl 脅迫下，植物體可通過 Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、SOS 信號傳導(dǎo)［25］、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)［26］等途徑傳導(dǎo)脅迫信號，進而誘導(dǎo)植物細胞發(fā)生一系列抗鹽生理反應(yīng)。外源殼聚糖在 NaCl 脅迫下也可能是通過直接作用于膜系統(tǒng)進而誘導(dǎo)植物體抗鹽機制來發(fā)揮作用的。當(dāng)菜用大豆在逆境下受到脅迫傷害時，外源殼聚糖可誘導(dǎo)其潛在的抗逆能力，調(diào)動抗逆協(xié)調(diào)機制，以阻止傷害或降低其傷害程度。本研究中，無鹽條件下外源殼聚糖主要對兩品種菜用大豆葉綠體前期各指標(biāo)含量/活性產(chǎn)生了顯著影響，與 NaCl 脅迫下的作用不同，可能是其啟動了不同的應(yīng)答機制所致。NaCl 脅迫下，外源殼聚糖使耐鹽品種‘綠領(lǐng)特早’維持了較強的抗氧化能力，很可能是殼聚糖誘導(dǎo)激發(fā)出其較強的潛在抗鹽能力所致。

4　結(jié)論

1）外源殼聚糖在無鹽和 NaCl 脅迫下對菜用大豆葉綠體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了不同的影響；

2）NaCl 脅迫下外源殼聚糖對兩品種葉綠體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著誘導(dǎo)作用，增強了 H2O2清除能力；

3）NaCl 脅迫下，外源殼聚糖使耐鹽品種 LL 品種保持了相對較高且協(xié)調(diào)變化的 APX、DHAR、GR及GPX 活性，進而使 AsA-GSH 循環(huán)能更為持久快速、有效運轉(zhuǎn)，促進了 AsA、GSH 的再生，維持了較強的氧化還原力，使過量產(chǎn)生的 H2O2能被及時清除，這可能是其能維持光合作用正常進行，保持較強同化力，進而保持較高干質(zhì)量的重要原因之一。

［1］宋士清， 尚慶茂， 郭世榮， 等. 殼聚糖對黃瓜幼苗抗鹽的協(xié)同生理作用研究［J］. 西北植物學(xué)報， 2006， 26（3）: 435-441. Song S Q， Shang Q M， Guo S R， et al. Physiological synergisms of chitosan on salt resistance of cucumber seedlings［J］. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2006， 26（3）: 435-441.

［2］周娟， 鄒禮平. 殼聚糖對鹽脅迫下豇豆幼苗生長發(fā)育的影響［J］. 北方園藝， 2014，（23）: 30-33. Zhou J， Zou L P. Effects of chitosan on the growth and development of cowpea seedlings under salt stress［J］. Northern Horticulture， 2014，（23）: 30-33.

［3］馬彥霞， 郁繼華， 張國斌， 等. 殼聚糖對水分脅迫下辣椒幼苗氧化損傷的保護作用［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（10）: 1964-1971. Ma Y X， Yu J H， Zhang G B， et al. Protective effects of exogenous chitosan on oxidative damage in pepper seedling leaves under water stress［J］. Scientia Agricultura Sinica， 2012， 45（10）: 1964-1971.

［4］Pongprayoon W， Roytrakul S， Pichayangkura R， et al. The role of hydrogen peroxide in chitosan-induced resistance to osmotic stress in rice（Oryza sativa L.）［J］. Plant Growth Regulation， 2013， 70: 159-173.

［5］Cheeseman J M. Mechanism of salinity tolerance in plants［J］. Plant Physiology， 1988， 87: 547-550.

［6］錢瓊秋， 宰文珊， 朱祝軍， 等. 外源硅對鹽脅迫下黃瓜幼苗葉綠體活性氧清除系統(tǒng)的影響［J］. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報， 2006， 32（1）: 107-112. Qian Q Q， Zai W S， Zhu Z J， et al. Effects of exogenous silicon on active oxygen scavenging systems in chloroplasts of cucumber（Cucumis sativus L.）seedlings under salt stress［J］. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology， 2006， 32（1）: 107-112.

［7］華春， 王仁雷， 劉友良. 外源AsA對鹽脅迫下水稻葉綠體活性氧清除系統(tǒng)的影響［J］. 作物學(xué)報， 2004， 30（7）: 692-696. Hua C， Wang R L， Liu Y L. Effect of exogenous ascorbic acid on active oxygen scavenging system in chloroplasts of rice under salt stress［J］. Acta Agronomica Sinica， 2004， 30（7）: 692-696.

［8］王聰， 楊恒山， 董永義， 等. 外源殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆光合作用及熒光特性的影響［J］. 西北植物學(xué)報， 2015， 35（6）: 1198-1205. Wang C， Yang H S， Dong Y Y， et al. Effects of exogenous chitosan on photosynthesis and fluorescence characteristics of vegetable soybean under NaCl stress［J］. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2015， 35（6）: 1198-1205.

［9］王聰， 朱月林， 楊立飛， 等. 菜用大豆耐鹽品種的篩選及其耐鹽生理特性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2009， 25（3）: 621-627. Wang C， Zhu Y L， Yang L F， et al. Screening of vegetable soybean cultivars for salt tolerance and their physiological characteristics［J］. Jiangsu Journal of Agricultural Science ， 2009， 25（3）: 621-627.

［10］孫錦. 菠菜對海水脅迫響應(yīng)的生理機制研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文， 2009. 61-62. Sun J. Studies on physiological mechanism of spinach to seawater stress［D］. Nanjing: PhD Dissertation of Nanjing Agricultural University， 2009. 61-62.

［11］Takeda K， Otaubo T， Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle GSH enzyme inspinach leaves［J］. Plant and Cell Physiology， 1982， 23: 1009-1018.

［12］Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts: polyphenol oxidase in Beta vulgaris［J］. Plant Physiology， 1949， 24: 1-5.

［13］Cakmak I. Activity of ascorbate-pendent H2O2scavenging enzymes and leaf chlorosis are enhanced in magnesium and potassium deficient leaves， but not in phosphorus deficient leaves［J］. Journal of Experiment Botany， 1994， 45: 1259-1266.

［14］秦愛國， 于賢昌. 馬鈴薯抗壞血酸含量及其代謝相關(guān)酶活性關(guān)系的研究［J］. 園藝學(xué)報， 2009， 36（9）: 1370-1374. Qin A G， Yu X C. Relationship between ascorbic acid content and the enzyme activities involved in AsA metabolism of potato［J］. Acta Horticulturae Sinica， 2009， 36（9）: 1370-1374.

［15］王玉， 孔凡英， 尹波， 等. 過表達單脫氫抗壞血酸還原酶基因提高番茄抗UV-B脅迫能力［J］. 植物生理學(xué)報， 2014， 50（1）: 95-104. Wang Y， Kong F Y， Yin B， et al. Overexpression of chloroplastic monodehydroascorbate reductase gene enhanced tolerance to UV-B stress in tomato［J］. Plant Physiology Journal， 2014， 50（1）: 95-104.

［16］Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons［J］. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1999， 50: 601-639.

［17］Shalata A， Meumann P M. Exogenous ascorbic acid（vitamin C）increases resistance to salt stress and reduces lipid peroxidation［J］. Journal of Experimental Botany， 2001， 52（364）: 2207-2211.

［18］Munne-Bosch S， Alegre L. Interplay between ascorbic acid and lipophilic antioxidant defenses in chloroplasts of water-stressed Arabidopsis plants［J］. Febs Letters， 2002， 524: 145-148.

［19］May M J， Vernoux T， Leaver C， et al. Glutathione homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant development［J］. Journal of Experimental Botany， 1998， 49（321）: 649-667.

［20］Foyer C H， Noctor G. The molecular biology and metabolism of glutathione［A］. Grill D， Tausz M， De Kok L J， et al. Significance of glutathione in plant adaptation to the environment［M］. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers， 2001， 27-57.

［21］Arthur J R. The glutathione peroxidase［J］. Cell Molecular Life Science， 2000， 57（13-14）: 1825-1835.

［22］Berczi A， Moller I M. Redox enzymes in the plant plasma membrane and their possible roles［J］. Plant， Cell & Environment， 2000， 23（12）: 1287-1302.

［23］王菲菲， 丁明全， 鄧澍榮， 等. 胡楊谷胱甘肽過氧化物酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化植株耐鹽性分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2012， 31（3）: 231-239. Wang F F， Ding M Q， Deng S R， et al. Cloning of glutathione peroxidase gene PeGPX from populus euphratica and the salt tolerance of the transformed plants［J］. Genomics and Applied Biology， 2012， 31（3）: 231-239.

［24］Chang C C C， Slesak I， Jorda L， et al. Arabidopsis chloroplastic glutathione peroxidase play a role in cross talk between photooxidative stress and immune responses［J］. Plant Physiology，2009， 150（2）: 670-683.

［25］Povero T， Loreti E， Pucciariello C， et al. Transcript profiling of chitosan-treated Arabidopsis seedlings［J］. Journal of Plant Research，2011， 124: 619-629.

［26］Liu T T， Liu Z X， Song C J， et al. Chitin-induced dimerization activates a plant immune receptor［J］. Science， 2012， 336（6085）: 1160-1164.

［27］Chinnusamy V， Jagendorf A， Zhu J K. Understanding and improving salt tolerance in plants［J］. Crop Science， 2005， 45: 437-448.

［28］Link V L， Hofmann M G， Sinha A K， et al. Biochemical evidence for the activation of distinct subsets of mitogen-activated protein kinases by voltage and defence-related stimuli［J］. Plant Physiology， 2002，128（1）: 271-281.

Effects of exogenous chitosan on antioxidant system in chloroplast of vegetable soybean under NaCl stress

WANG Cong，DONG Yong-yi，JIA Jun-ying，BAO Jin-hua，MA Yu-lu，ZHENG Yi
（College of Agriculture， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao， Inner Mongolia 028042， China）

【Objectives】Chloroplasts are plant organelles that produce reactive oxygen species（ROS）. Chloroplasts are extremely sensitive to salt stress. In order to investigate the mechanism of chitosan on regulating photosynthesis under NaCl stress， the improvement of antioxidant system in the chloroplasts by applying exogenous chitosan on soybean ［Glycine max（L.）Merr.］was studied.【Methods】A pot experiment was conducted inside greenhouse of the Experimental Base of Inner Mongolia University from April to June 2014. Vermiculite was used as culture substrate， salt sensitive soybean cultivar of ‘Lixiang gaochan 95-1’（LX）and not tolerant one of ‘Lvling’（LL）were used as test materials. Four treatments were designed: 1）Soybean leaves were sprayed with water， and roots fed with the nutrient solution（CK）； 2）Only the leaves were sprayed with chitosan solution， and the roots fed with nutrient solution； 3）Leaves were sprayed with water， and the roots were fed with nutrient solution containing NaCl； 4）The leaves were sprayed with chitosan solution， and theroots were fed with nutrient solution with NaCl.【Results】Under NaCl stress and exogenous chitosan， the chloroplast H2O2content of two varieties was significantly decreased， while the activities of peroxidase（POD），ascorbate peroxidase（APX）， monodehydroascorbate reductase（MDHAR）， dehydro ascorbic acid reductase（DHAR）， glutathione reductase（GR）and glutathione peroxidase（GPX）were increased markedly， meanwhile the dehydroascorbic acid（AsA）and dehydroascorbic glutathione（GSH）contents during the mid-term of NaCl stress were also increased. Salt-resistant cultivar LL maintained lower H2O2content， and higher DHAR activity and AsA content in the mid and late period（6-15 d）of NaCl stress， maintained higher APX， GR and GPX activities in the whole period， and maintained higher GSH content in the late period（12 d， 15 d）of the stress， as compared with those of salt-sensitive cultivar LX.【Conclusions】Exogenous chitosan supply significantly induces POD activity and AsA-GSH cycle in the chloroplast under NaCl stress. The AsA-GSH cycle in salt tolerant cultivar LL maintain relatively stronger activity than that in salt sensitive cultivar in reactive oxygen scavenging， which might explain a reason for salt tolerant cultivar to maintain strong photosynthetic capacity， and be capable of maintaining active growth of soybean.

exogenous chitosan； NaCl stress； chloroplast； antioxidant system

Q945.78

A

1008-505X（2016）05-1356-10

2015-09-23接受日期：2016-01-21

國家自然科學(xué)基金項目（31260472， 31260483）資助。

王聰（1968—），男，內(nèi)蒙古和林格爾縣人，博士，教授，主要從事蔬菜生理生態(tài)和生物技術(shù)研究。

E-mail：tongliaowangcong@163.com