惠　放，馬韞韜，朱晉宇，蔣衛(wèi)杰

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

利用多視角圖像法分析番茄幼苗根構(gòu)型對氮水平的響應(yīng)

惠放1，馬韞韜1，朱晉宇2*，蔣衛(wèi)杰2

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

【目的】根系作為植物從環(huán)境中獲取氮素的重要器官，如何無損并高效地獲取其特征參數(shù)值是當(dāng)今研究熱點。隨著高清成像技術(shù)的迅速發(fā)展，基于多視角圖像法是研究植株根構(gòu)型無損測量的新型方法。本研究對根系多視角成像系統(tǒng)和 GIARoot 軟件平臺相結(jié)合的多視角圖像分析法精度進行了較系統(tǒng)的評估。并利用此套系統(tǒng)動態(tài)定量分析了不同氮素水平對番茄幼苗根構(gòu)型的影響，為進一步研究植物根構(gòu)型與礦質(zhì)元素互作提供新的手段和依據(jù)?！痉椒ā勘狙芯恳浴爸须s 109”番茄為材料進行水培試驗，設(shè)置 4、12、20 mmol/L 3 個氮處理，分別以 N4、N12、N20 表示，定植于透明玻璃柱中 16 d。利用自行設(shè)計的根系多視角成像系統(tǒng)獲取每天根系 360°圖像序列，并基于 GIARoot 軟件平臺對圖像序列進行根系特征參數(shù)的定量計算，在第 16 d 時將根系進行破壞性取樣，將 GIARoot 基于無損測定分析的圖像系列結(jié)果與 WinRHIZO Pro 的破壞性取樣根系掃描圖的計算結(jié)果進行對比評估。【結(jié)果】GIARoot 與 WinRHIZO Pro 根系特征參數(shù)評估結(jié)果總體上線性回歸斜率在 0.96～0.99，R2均為 0.99，RE 為 2.95%～12.69%，根總長、根總表面積、根總體積和根平均直徑的 RMSE 分別為 44.73 cm、4.96 cm2、0.09 cm3、0.05 mm，各個根系特征參數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。在 N4、N12、N20 3 個氮處理下，番茄幼苗定植 16 d 內(nèi)各根系特征參數(shù)值均為 N12 處理最大，且 N20 的根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積分別比 N4 的高 14.2%、13.2%、35.8%、27.7%，而 N4 的橫截面最大根個數(shù)、一級側(cè)根個數(shù)分別比 N20 的高 28.2%、30.4%。不同氮水平間，第 4 d 根總長、根總表面積、根垂直投影面積出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），N12 分別比 N20 顯著高 113.9%、153.7%、113.8%。第 12 d 根總體積、橫截面最大根個數(shù)出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），N12 分別比 N20 顯著高 57.0%、117.9%。而根平均直徑 16 d 內(nèi)無明顯差異（P＞0.05），均在0.42～0.54 mm?！窘Y(jié)論】利用將多視角成像系統(tǒng)和 GIARoot 軟件平臺結(jié)合的多視角圖像法，進行無損測量獲取根系特征參數(shù)值是可行的。通過對不同氮水平下番茄幼苗各根系特征參數(shù)分析表明，適當(dāng)提高氮濃度可以促進番茄幼苗根系生長，20 mmol/L 的高氮對根系生長具有抑制作用，且相對于根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積，這種抑制對側(cè)根數(shù)量尤為明顯，氮素濃度對根平均直徑影響最小。

番茄幼苗；氮；根系特征參數(shù)；GIARoot；無損測量

氮是植物生長不可缺少的營養(yǎng)元素之一，根際氮素與植株根系構(gòu)型密切相關(guān)［1-3］，植株根系體積、長度、側(cè)根數(shù)量等根系特征參數(shù)均影響植株根際氮素吸收利用效率［4］。但是，研究氮素對植株根系構(gòu)型的難點之一就是生長介質(zhì)不透明、根系取樣不完整性。以往研究根系的方法是進行破壞性取樣，再用儀器設(shè)備掃描分析，這種方法破壞了根系在介質(zhì)中生長的原有構(gòu)型，無法完整獲取根系構(gòu)型與氮素互作的動態(tài)規(guī)律。近年來，隨著高清成像光學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，自動化圖像處理分析平臺也不斷涌現(xiàn)。GIARoot 軟件平臺［5］采用全局、自動適配與雙自動適配三種根系與背景分割方法，通過分析根系高清成像序列圖能夠提取長度、高度、寬度、投影面積等信息，可以評估分析 20 種二維根系特征參數(shù)。

番茄優(yōu)質(zhì)幼苗是實現(xiàn)番茄高效生產(chǎn)的關(guān)鍵，苗期根際氮素脅迫會影響幼苗花芽分化及生育期的產(chǎn)量分布［6-7］。前人研究番茄幼苗根際氮素調(diào)控主要集中在幼苗根系生長發(fā)育方面［8-9］，對氮素與幼苗根系構(gòu)型研究較少，且研究方法均采用傳統(tǒng)破壞性取樣掃描分析，利用無破壞性光學(xué)成像方法來研究幼苗根系構(gòu)型與氮素關(guān)系還鮮見報道。

本試驗以“中雜 109”番茄為材料，采用玻璃柱營養(yǎng)液栽培方式，并設(shè)置三個氮素水平，通過固定相機獲取旋轉(zhuǎn)平臺上番茄幼苗根系多視角圖像，利用GIARoot 軟件分析平臺對獲取的根系圖像序列進行根系特征參數(shù)的定量計算，量化研究水培番茄苗期的根系特征參數(shù)的變化規(guī)律，從而為利用成像法研究植物根系生長提供新的手段，也為進一步研究番茄幼苗根系三維構(gòu)型與氮素利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗設(shè)計

試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院人工氣候室進行，人工氣候室條件為：光照 12 h/d，溫度 26～27℃，光強 550～650 μmol/（m2?s），相對濕度 65%。試驗品種為“中雜 109”番茄。將種子進行無菌催芽培養(yǎng)，在 5 d（子葉平展）后移栽到直徑 15 cm，高 30 cm的透明玻璃柱中，加入 5 L 預(yù)先配制好的營養(yǎng)液，每兩天更換一次營養(yǎng)液，所有玻璃柱外部用錫箔紙包裹以避光。

采用 Ca（NO3）2·4H2O 設(shè)置三個氮濃度：4、12、20 mmol/L（分別以 N4、N12、N20 表示），Ca2+離子用 CaCl2·2H2O 作為補充?；緺I養(yǎng)液的組成（m o l/L）為：C u S O4·5 H2O 1.6×1 0-7、（NH4）6Mo7O24·4H2O 5.0×10-9、H3BO32.0×10-5、MnSO4·H2O 4.8×10-6、ZnSO4·7H2O 3.8×10-7、EDTA-Fe 2.0×10-5、MgSO4·7H2O 2.0×10-3、KCl 5.0×10-3、KH2PO41.0×10-3，pH 為 6.0，EC 值保持2.0～2.5 mS/cm。用電動泵連續(xù)通氣供氧，每個處理40 株，3次重復(fù)，每次測定隨機選擇 4 株。

1.2根系多視角圖像采集和處理

本試驗自行設(shè)計了一套根系多視角成像系統(tǒng)，此系統(tǒng)將直徑 25 cm、1/40 r/s、中心自帶白熾燈的自動旋轉(zhuǎn)盤固定于邊長為 50 cm 的攝影棚內(nèi)，攝影棚四面涂黑以避光，上方懸掛由鐵架臺固定的四盞白熾燈為拍照提供光源。將照相機（Canon 500D、M 1/30、f 5.6-6.3）利用支架固定于攝影棚前，使用快門線設(shè)置連拍模式采集多視角圖像。在移栽后第 4、8、12、16 d 進行根系拍照，選取 4 張含有較多根系的圖片，使用 Adobe Photoshop 對挑選出的圖片進行裁剪等預(yù)處理。

1.3多視角圖像法根系特征參數(shù)精度評估

將圖像序列輸入 GIARoot 根系處理軟件，通過參數(shù)調(diào)整獲取最佳二值化處理圖片，并輸出 20 種根系特征參數(shù)，本研究主要選取根總長、根總表面積、根總體積、根平均直徑、根垂直投影面積、橫截面最大根個數(shù) 6 個代表性根系特征參數(shù)。使用ScanWizard EZ 軟件和根系掃描儀獲取第 16 d 破壞性取樣的根系二維掃描圖，并使用 WinRHIZO Pro 軟件進行根系特征分析，將 WinRHIZO Pro（像素閾值150）獲取的主要根系特征參數(shù)值與 GIARoot 計算結(jié)果進行對比驗證。具體處理流程見圖1。

圖1　成像系統(tǒng)技術(shù)流程Fig.1　Flowchart of the imaging system technology

GIARoot 中根系特征參數(shù)算法，如體積（V）和表面積（S）公式分別為：

式中，ri為第 i 個像素半徑；n 為像素個數(shù)。

1.4統(tǒng)計分析

采用 Microsoft Excel 2013 進行計算、作圖，采用 SPSS 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，包括方差分析（ANOVA）、線性回歸等。

WinRHIZO Pro 參照值（yi）和 GIARoot 待評估值（xi）的吻合程度用均方根誤差（RMSE）、相對誤差（RE）等進行描述：式中，yi和 xi分別為第 i 個參照值和待評估值；n 為待評估值或參照值的個數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1根系特征參數(shù)值評估結(jié)果

圖2為番茄移栽后第 16 天，對利用 GIARoot 系統(tǒng)得出的相關(guān)參數(shù)與破壞性取樣利用 WinRHIZO Pro分析的根總長、根總表面積、根總體積、根平均直徑數(shù)據(jù)進行比較的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)各數(shù)據(jù)的線性回歸斜率介于 0.9 6～0.9 9，R2均為 0.9 9，R E 為2.95%～12.69%。其中，根平均直徑與其他三個根系特征參數(shù)相比 RE 較大，這可能是由于根平均直徑均在 0.42～0.54 mm，數(shù)據(jù)較為集中，極小的誤差也會造成統(tǒng)計學(xué)評估結(jié)果較差。另外，根系在營養(yǎng)液中由于浮力作用根系集中交錯，造成數(shù)據(jù)分析具有部分誤差，但是統(tǒng)計分析結(jié)果表明差異不顯著（P＜0.05），因此總體上 GIARoot 與 WinRHIZO Pro數(shù)據(jù)吻合較好，以上說明利用多視角成像系統(tǒng)和GIARoot 軟件平臺結(jié)合的多視角圖像法分析根系生長發(fā)育準(zhǔn)確可靠。

圖2　GIARoot 與 WinRHIZO Pro 根總長、根總表面積、根總體積、根平均直徑評估結(jié)果Fig.2　Assessment of the network length， network surface area， network volume and average root diameter for the GIARoot and WinRHIZO Pro

2.2不同氮水平對番茄幼苗根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積、根平均直徑的影響

番茄幼苗不同氮水平下根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積參數(shù)值定植 16 d 內(nèi)均以N12 最大（圖3）。第 4 d，根總長、根總表面積、根垂直投影面積不同氮濃度間表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），N12 比 N20 分別顯著高出 113.9%、153.7%、113.8%。第 12 d，根總體積在不同氮濃度間表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），N12 比 N20 顯著高出57.0%。第 16 d，N12 的根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積分別比 N20 的顯著高出54.6%、66.9%、34.9%、57.7%（P＜0.05），N20 分別比 N4 高出 14.2%、13.2%、35.8%、27.7%。這說明在本試驗條件下，高氮對以上 4 個根系特征增長具有抑制作用，且根總長、根總表面積、根垂直投影面積對氮素改變較為敏感。

圖3　番茄苗期不同氮水平根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積、根平均直徑的動態(tài)變化Fig.3　Dynamic changes of the network length， network surface area， network area， network volume and average root diameter of tomato seedlings under different N treatments

而 16 d 內(nèi)根平均直徑 以 N12 最大、N4 最小，參數(shù)值在 0.42～0.54 mm（圖4），不同氮濃度間無顯著性差異，這與張蕊等［17］在施 N 0～200 kg/（hm2·a）下研究江西信豐木荷幼苗的結(jié)果基本一致。這說明在本試驗條件下雖然高氮對根平均直徑具有抑制作用，但對其無明顯影響。

2.3不同氮水平對番茄幼苗根系側(cè)根數(shù)量的影響

大部分研究認(rèn)為，適當(dāng)?shù)南跛猁}濃度對根系生長具有促進作用，尤其是在低氮脅迫（0.01～1 mmol/L）下會促進側(cè)根大量生成［11-12］，這說明側(cè)根數(shù)量對氮素改變極為敏感。一級側(cè)根個數(shù)和橫截面最大根個數(shù)這兩個根系特征參數(shù)均能較好的反映根系側(cè)根數(shù)量變化情況。

圖5為番茄定植 16 d 內(nèi)橫截面最大根個數(shù)動態(tài)變化，不同時期在不同氮濃度間均以 N12 最高、N20 最低，且在第 12 d 不同氮濃度間就表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），N12 分別比 N4 和 N20 高 60.4%和 117.9%。表1為第 16 天番茄苗期一級側(cè)根個數(shù)與橫截面最大根個數(shù)，發(fā)現(xiàn) N4 和 N12 的一級側(cè)根個數(shù)分別比 N20 的高 30.4% 和 76.4%，橫截面最大根個數(shù)分別比 N20 高 28.2% 和 74.1%。結(jié)合根總長、根總表面積、根垂直投影面積、根總體積、根平均直徑數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為過高的氮濃度對番茄根系生長具有抑制作用，這種抑制在側(cè)根數(shù)量上尤為明顯。

圖4　番茄苗期不同氮水平根平均直徑動態(tài)變化Fig.4　Dynamic changes of the average root diameters of tomato seedlings under different N treatments

圖5　番茄苗期不同氮水平橫截面最大根個數(shù)動態(tài)變化Fig.5　Dynamic change of the maximum number of roots of tomato seedlings under different N treatments

表1　番茄不同氮水平一級側(cè)根個數(shù)與橫截面最大根個數(shù)Table 1　Number of primary lateral roots and the maximum number of roots for tomato different N treatments

3　討論與結(jié)論

傳統(tǒng)根系研究方法如挖掘法、土鉆法等大多具有破壞性，實際測量誤差較大且測量時間多為根系發(fā)育后期［13，17］。即便采取不同發(fā)育期取樣的研究方法也不是同一植株，個體差異較大，研究者只能通過增加工作量來降低誤差［14-16］。本研究利用根系多視角成像系統(tǒng)和 GIARoot 軟件分析平臺能夠無損、動態(tài)和定量分析根構(gòu)型特征參數(shù)，為營養(yǎng)元素對根系表型影響機理研究提供強有力的手段和方法。

前人研究發(fā)現(xiàn)，氮素脅迫對植株根系根長、根表面積、根體積均有明顯差異變化［13-16］，但根系構(gòu)型參數(shù)對不同氮濃度差異響應(yīng)的時間未見報道。本研究利用根系多視角圖像法無損和動態(tài)地觀察及分析根構(gòu)型對氮素濃度差異響應(yīng)時間，發(fā)現(xiàn)不同氮素水平第 4 d 番茄幼苗根長、根表面積表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），第 12 d 根體積表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），這與傳統(tǒng)方法取樣時期有限相比，在獲取數(shù)據(jù)的時效性和準(zhǔn)確性上具有極大的優(yōu)勢。大部分研究表明，適量供氮對根系生長具有促進作用，過高氮濃度對根系生長有抑制作用［18-19］。本研究利用GIARoot 平臺動態(tài)和定量分析結(jié)果表明，橫截面最大根個數(shù)在第 12 d，N20 顯著低于 N12（P＜0.05）且與 N4 無顯著差異；在第 16 d，N20 顯著低于 N12 和N4（P＜0.05）；而 N20 根系根長、根表面積、根體積在第 16 d 顯著低于 N12（P＜0.05）且與 N4 無顯著差異。以上結(jié)果表明，相對根長、根體積等特征參數(shù)，高氮對側(cè)根生長的抑制作用更為明顯，這可能是因為高濃度的硝酸根會通過阻礙側(cè)根分裂組織的活性來抑制側(cè)根的生長［20］，且這種抑制作用只發(fā)生于剛剛從主根上發(fā)出的尚未成熟的側(cè)根上，進而表現(xiàn)在側(cè)根數(shù)量上的明顯減少［21］。

本研究方法原理雖然適用于番茄等須根系無土栽培蔬菜作物，但本試驗研究時間僅為根系較少的番茄苗期，若想研究多生育期，尤其是旺盛生長期的根系，可以使用尼龍網(wǎng)或塑料網(wǎng)將根系分層以便于根系分離。而對于玉米、水稻等大田作物，本試驗研究方法不能獲得有效的根寬、根深、根角度等三維根系特征參數(shù)信息，需要從栽培介質(zhì)（瓊脂等透明固體介質(zhì)）等方面進行改進，研究基因型根構(gòu)型差異［22］及理想根構(gòu)型等特定構(gòu)型育種［23］。另外，目前已有利用 RooTrak 分析 X-ray 掃描土壤獲取的根系多角度 μCT 圖像研究玉米根系構(gòu)型，與傳統(tǒng)的 X-ray分析方法相比精度顯著提高［24］。

總之，本研究利用多視角圖像法無損、動態(tài)分析根系形態(tài)，徹底改變了傳統(tǒng)根系研究所用的破壞性測量和靜態(tài)模式，對研究根構(gòu)型與營養(yǎng)元素互相響應(yīng)機理具有重要的指導(dǎo)意義。未來可利用多視角成像系統(tǒng)，基于根系三維分析平臺進行原位無損定量三維根系，為研究礦質(zhì)元素與根系三維構(gòu)型的互作關(guān)系提供新的手段和依據(jù)。

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Analysis of nitrogen effects on root system architecture of tomato seedlings using the multi-view images method

HUI Fang1，MA Yun-tao1，ZHU Jin-yu2*，JIANG Wei-jie2
（1 College of Resources and Environmental Sciences， China Agricultural University， Beijing 100193， China；2 Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

【Objectives】Root is an important plant organ of obtaining nutrient from soil. Therefore， how to obtain root parameter values nondestructively and efficiently is a current research hotspot. With the rapid development of high-throughput imaging technology， nondestructive measurement based on multi-view imageshas become a new method to study root system architecture. In this study， precision of the root multi-view imaging system combined with GIARoot parameter analysis platform was accurately assessed. Then， effects of different N levels on root system architecture of tomato seedlings were analyzed dynamically and quantitatively. This multi-view imaging system can provide the basis for further study on the interaction of root system architecture and mineral elements.【Methods】Three N treatments were designed in the experiment， namely， N concentrations of 4， 12 and 20 mmol/L， indicating as N4， N12 and N20. Under the hydroponic condition，“Zhong Za 109” tomato seedlings were planted for 16 days in transparent glass column. The self-designed root multi-view imaging system was used to obtain daily image sequences around the growing root system. Then，root characteristic parameters along the plant growth were quantitative calculated with the GIARoot platform according to the photographed root system nondestructively. At the final measurement（16 d after the planting），destructive measurements were done on root system and analyzed with WinRHIZO Pro software， and the results were compared with GIARoot plantform.【Results】There were no significant differences on each root characteristic parameter between the GIARoot and WinRHIZO Pro（P＞0.05）. The slopes of the linear regression between the parameters using the two methods were between 0.96 and 0.99， and values of R2were all 0.99 and REs ranged from 2.95% to 12.69%. The RMSEs of network length， network surface area， network volume and average root diameter were 44.73 cm， 4.96 cm2， 0.09 cm3and 0.05 mm， respectively. Each root characteristic parameter of the N12 was the largest on the16th day among the treatments of N4， N12 and N20. The network length， network surface area， network area and network volume of the N20 were 14.2%， 13.2%， 35.8% and 27.7%， respectively， higher than those of the N4. However， the maximum number of roots and the number of primary lateral roots of the N4 were 28.2% and 30.4% higher than the N20， respectively. In addition， significant differences were found on the network length， network surface area and network area between the three N treatments on the 4th day（P＜0.05）， and the values of them of the N12 were 113.9%， 153.7% and 113.8% higher than the N20， respectively. Meanwhile， significant differences were found on the network volume and the maximum number of roots between the three N treatments on the 12th day（P＜0.05）， and the values of the N12 were 57.0% and 117.9% higher than the N20， respectively. However， there were no significant differences on the average root diameter on the 16th day（P＞0.05）and all of them were between 0.42 and 0.54 mm.【Conclusions】The multi-view images method combining the root multi-view imaging system with GIARoot platform， can nondestructively obtain the root characteristic parameters. The N effects on the root architecture characteristics showed that increasing N concentration within certain range could promote root growth of tomato seedlings. However， the N concentration of 20 mmol/L had an inhibition on tomato seedling root growth， particularly on the number of lateral roots， and N concentration had the least influence on the growth of root diameter.

tomato seedling； nitrogen； root characteristic parameters； GIARoot； nondestructive measurement

S126

A

1008-505X（2016）05-1418-07

2015-08-07接受日期：2016-01-18

日期：2016-05-26

國家自然科學(xué)基金項目（31301816）；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育基金會“大北農(nóng)教育基金”項目；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目資助。

惠放（1992—），女，遼寧錦州人，博士研究生，主要從事根系與營養(yǎng)元素互作的模型研究。

E-mail：fanghui6728@gmail.com。* 通信作者 E-mail：zhujinyu@caas.cn