趙晨潤夏煥春馬　曦

（1.北京第一零一中學(xué)北京100091；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院北京100193）

熊果酸減肥作用的研究△

趙晨潤1夏煥春1馬曦2*

（1.北京第一零一中學(xué)北京100091；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院北京100193）

研究表明熊果酸（UA）對脂肪代謝有一定的影響，但研究多數(shù)采用UA食物添加或灌胃方式進(jìn)行，而實(shí)際應(yīng)用中飲用方式更為方便。因此，本論文研究飲用UA對脂肪產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明飲用UA后雌性小鼠體重及脂肪量顯著下降，雄性小鼠變化不顯著；利用體外培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞系加入U(xiǎn)A，發(fā)現(xiàn)其分化受到抑制，脂滴顯著減少。本論文首次發(fā)現(xiàn)飲用UA對雌性小鼠效果減肥優(yōu)于雄性小鼠，為UA的生物功能開發(fā)及應(yīng)用提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)參考。

熊果酸 小鼠 前脂肪細(xì)胞系 脂肪產(chǎn)生

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸，是廣泛存在于苦丁茶和山楂葉等天然植物中的一種化合物[1]。UA從天然植物中的提取工藝有很多的研究報(bào)道[2～5]，目前已有商品化的產(chǎn)品。研究表明熊果酸具有抗炎[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]及抗癌[9]等多種生物學(xué)效應(yīng)。此外，研究表明UA對脂質(zhì)代謝有重要作用。2007年，林科等通過UA灌胃高脂模型小鼠，發(fā)現(xiàn)UA可以有效降低膽固醇及甘油三酯指數(shù)[10]。2010年，張杰等利用UA對胰島素抵抗模型大鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)UA能夠減少腹腔脂肪堆積[11]。2014年，日本的Markwick NP等發(fā)現(xiàn)蘋果皮中含有UA，并人工添加UA飼喂鱗翅類昆蟲的幼蟲，發(fā)現(xiàn)其體重顯著減輕[12]。2009年，劉志芳等研究表明UA能夠抑制胰脂肪酶的活性及構(gòu)象[13]。2014年，單萍等研究發(fā)現(xiàn)熊果酸是一種胰脂肪酶抑制劑[14]。UA作為一種有潛在應(yīng)用價(jià)值的植物活性成分，受到了科研工作者的關(guān)注。

目前大多以飼料添加或灌胃方式研究UA對脂肪的作用[10～12]，但在實(shí)際生活中UA以飲用方式來攝入更為方便。因此，本論文通過在飲用水中添加UA，探討其對小鼠體重、腹部脂肪及脂肪細(xì)胞的影響。

1　材料

1.1試驗(yàn)動物：2月齡雌性及雄性Balb/c小鼠購于協(xié)和實(shí)驗(yàn)動物研究所。30只雌性或雄性小鼠各隨機(jī)分為三組，每組10只：①正常飲水組，不添加UA；②飲用質(zhì)量濃度為1μg·mL-1UA組；③飲用質(zhì)量濃度為5μg·mL-1UA組。

1.2材料：高脂飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，各組小鼠自由攝取高脂飼料。UA購于Sigma公司，純度≧98.5％，用礦泉水配制為1μg·mL-1及5μg·mL-1供小鼠飲用，每隔2d更換飲水。

2　方法

2.1記錄飲水量：每個(gè)水瓶均加100mL水，每隔2d換水時(shí)用量筒稱量水瓶中剩余的水，減少水量即為每3d小鼠的飲水量，記錄后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2小鼠體重稱量：每隔2d用天平稱量小鼠的體重，記錄體重變化，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3小鼠脂肪的稱量：飲用UA一個(gè)月后處死小鼠，用解剖鍵和鑷子打開腹腔，取出腹部脂肪置于培養(yǎng)皿中用天平進(jìn)行稱量，記錄脂肪的質(zhì)量。

2.4前脂肪細(xì)胞系3T3-L1的培養(yǎng)：前脂肪細(xì)胞系3T3-L1為美國菌種保藏中心產(chǎn)品，此細(xì)胞的維持、擴(kuò)增及分化培養(yǎng)需用3種培養(yǎng)基。①維持培養(yǎng)基：90％DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清，1.0μg/mL胰島素；②擴(kuò)增培養(yǎng)需用前脂肪細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基：90％ DMEM培養(yǎng)基，10％小牛血清；③分化培養(yǎng)基：90％DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清，1.0μM地塞米松；0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤；1.0μg/mL胰島素。3T3-L1脂肪細(xì)胞是貼壁生長，實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)室無菌條件下進(jìn)行，細(xì)胞于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

接種細(xì)胞到培養(yǎng)皿進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞長到細(xì)胞培養(yǎng)皿的70％前進(jìn)行傳代。細(xì)胞長到培養(yǎng)皿的70％～80％時(shí)棄掉上清，加入相同體積的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，48h后棄掉上清，利用脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48h更換脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基；細(xì)胞誘導(dǎo)后7～10d完全分化。加入分化培養(yǎng)基48h后，分別加入1μg·mL-1或5μg·mL-1UA進(jìn)行培養(yǎng)，d7后進(jìn)行觀察拍照。

2.5統(tǒng)計(jì)分析：采用一尾二型Student-t檢驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對照組數(shù)據(jù)的顯著性差異分析。*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3　結(jié)果與分析

3.1UA對小鼠飲水量及體重的影響：小鼠飲用UA后狀態(tài)良好，與正常飲水組小鼠比無明顯變化。雌性小鼠每3d飲用水量的結(jié)果如圖1所示，飲用1μg·mL-1的UA組小鼠的飲水量比對照組（P<0.01）及飲用5μg·mL-1的UA組（P<0.01）顯著增加。飲用5μg·mL-1的UA組小鼠的飲水量與對照組相比無顯著變化。雄性小鼠每3d飲用水量的結(jié)果如圖2所示，飲用1μg·mL-1的UA組及5μg·mL-1UA組小鼠與對照組相比均無顯著變化。以上結(jié)果表明雌性及雄性小鼠飲用UA的量有顯著不同，提示UA對雌性作用可能會更顯著。

有研究報(bào)道UA飼食糖尿病模型小鼠能顯著改善小鼠體重[15]。為了探討UA對小鼠體重的影響，每隔2d稱量小鼠體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖3所示，飲用1μg·mL-1UA雌性小鼠18d后體重與對照組相比明顯下降（18d：P<0.05；21～30d：P< 0.01），飲用5μg·mL-1UA的雌性小鼠體重與對照組相比無明顯變化；飲用UA對雄性小鼠體重?zé)o明顯變化（圖3），表明質(zhì)量濃度為1μg·mL-1的UA只對雌性小鼠體重減輕有顯著作用，對雄性小鼠無此作用。

3.2UA對小鼠脂肪產(chǎn)生的影響

有研究報(bào)道UA能夠降低細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成酶的表達(dá)量及活性，進(jìn)而影響脂肪的合成[15]。飲用UA1個(gè)月后處死小鼠，取出腹部脂肪利用天平進(jìn)行稱量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖5所示，飲用質(zhì)量濃度為1μg·mL-1UA雌性小鼠脂肪重量與其他兩組相比顯著下降（P<0.01）；飲用5μg·mL-1UA的雌性小鼠腹部脂肪與對照組相比顯著下降（P<0.01），表明飲用質(zhì)量濃度為1μg· mL-1UA效果最好。雄性小鼠結(jié)果如圖6所示，只有飲用質(zhì)量濃度為1μg·mL-1UA的小鼠腹部脂肪比對照組顯著減少（P< 0.05），與飲用5μg·mL-1UA組無差異。

3.3UA對前脂肪細(xì)胞系3T3-L1的影響：將未分化3T3-L1細(xì)胞加入24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)空。未分化的前脂肪細(xì)胞系3T3-L1形態(tài)如圖5所示。細(xì)胞長到培養(yǎng)皿的70％～80％時(shí)棄上清加入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，48h后棄掉上清，利用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48h更換脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基；細(xì)胞誘導(dǎo)后7～10d完全分化，可看到有脂滴形成（圖7）。

加入分化培養(yǎng)基48h后，加入1μg·mL-1或5μg·mL-1UA進(jìn)行培養(yǎng)，d7后進(jìn)行觀察拍照。結(jié)果如圖8所示，加入1μg·mL-1UA的脂肪細(xì)胞分化受到抑制，且形成大脂滴明顯少于其他兩組，而加入5μg·mL-1的UA的脂肪細(xì)胞組與對照組相比無顯著差異。以上結(jié)果表明1μg·mL-1的UA能夠抑制脂肪細(xì)胞分化，并減少脂肪細(xì)胞脂滴的形成。

4　討論

UA廣泛存在于多種天然植物中，研究表明具有抗炎、抗菌及降血糖等多種生物學(xué)效應(yīng)[6～9]。此外，UA對動物體的脂肪代謝的影響已有報(bào)道。2003年，熊筱娟等發(fā)現(xiàn)UA能夠顯著降低急性肝損傷大鼠肝臟及血清中甘油三酯水平，促進(jìn)肝糖原產(chǎn)生，并減輕肝細(xì)胞損傷[16]。2007年，林科等提取山楂中的UA制成納米級的乳濁液，灌胃小鼠14d后誘導(dǎo)高脂模型進(jìn)行UA預(yù)防實(shí)驗(yàn)；同時(shí)誘導(dǎo)高脂模型小鼠后UA灌胃進(jìn)行治療。結(jié)果表明治療組和預(yù)防組均能一定程度降低高脂小鼠的膽固醇及甘油三酯的水平，且UA預(yù)防高脂小鼠的作用優(yōu)于高脂小鼠的治療作用[10]。2010年，張杰等發(fā)現(xiàn)UA能夠減少胰島素抵抗模型大鼠腹腔脂肪堆積，提示灌胃方式攝入U(xiǎn)A對腹腔內(nèi)脂肪重量的增加有一定的抑制作用[11]。本論文結(jié)果表明雌性小鼠飲用1μg·mL-1或5μg·mL-1UA后均能顯著減少腹部脂肪堆積，且1μg·mL-1的UA飲用小鼠效果較好（圖5）；但雄性小鼠只有飲用1μg·mL-1的UA顯著減少腹部脂肪產(chǎn)生，而且5μg·mL-1的UA飲用小鼠腹部脂肪減少不明顯（圖6），此結(jié)果與張杰等[11]等利用雄性大鼠胰島素抵抗模型的結(jié)果一致。2014年，Markwick NP等人工添加UA飼喂鱗翅類昆蟲的幼蟲發(fā)現(xiàn)其體重顯著減輕[12]。本論文結(jié)果表明雌性小鼠飲用1μg·mL-1在18d后體重顯著減少，而5μg·mL-1的UA不能減輕體重（圖3）；同時(shí)無論是1μg·mL-1的UA還是5μg·mL-1UA對雄性小鼠體重?zé)o影響（圖4），此結(jié)果與Markwick NP等[12]結(jié)果一致，但本論文研究表明UA對雌性小鼠作用強(qiáng)于雄性小鼠，存在性別差異，但具體原因還需進(jìn)行更多的研究。

UA對細(xì)胞水平的脂肪代謝有一定作用。2012年，樊慧錦等UA處理后，HepG2細(xì)胞的脂肪酸合成酶表達(dá)量及活性降低，且UA能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡[17]。3T3-L1細(xì)胞是一種具有定向分化為成熟脂肪細(xì)胞的細(xì)胞系，能充分顯示脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)，包括形態(tài)學(xué)改變、多種脂肪代謝酶的表達(dá)、廣泛的脂質(zhì)積聚等，是體外研究脂肪細(xì)胞的理想實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。2012年，李迪等發(fā)現(xiàn)10、20μmol/L的UA處理后的3T3-L1脂肪細(xì)胞分化程度低于對照組和羅格列酮組[18]。本論文發(fā)現(xiàn)3T3-L1細(xì)胞體外添加不同濃度的UA，1μg·mL-1UA能顯著抑制3T3-L1細(xì)胞分化及脂滴的產(chǎn)生（圖8），而5μg·mL-1UA效果不明顯，此結(jié)果與李迪等的發(fā)現(xiàn)一致[18]。

以往的研究大多將UA加入飼料中或進(jìn)行灌胃[11，12，15]，本論文將UA加入飲用水中讓小鼠自由攝取，飲用UA的小鼠表現(xiàn)正常，但飲用1μg·mL-1UA的雌性小鼠飲用量顯著高于對照組及飲用5μg·mL-1UA的雌性小鼠（圖1），但雄性小鼠飲用量無顯著差別，表明雌性小鼠飲用1μg·mL-1的UA對雌性小鼠的體重及脂肪減少作用顯著，提示UA對小鼠脂肪產(chǎn)生的作用有性別差異，但其原因尚不清楚。

[1]肖坤福，鄭云法，劉成左，等.熊果酸的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（12）：1298-1300.

[2]任秀蓮，周春山，魏琦峰，等.苦丁茶中熊果酸的分離純化研究[J].中國藥學(xué)雜志，2004，39（8）：571-574.

[3]任秀蓮，鐘世安，周春山，等.苦丁茶中熊果酸的提取工藝[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，35（1）：70-74.

[4]陳鴻英，馬雪梅.澤蘭中齊墩果酸和熊果酸的提取、分離[J].天津中醫(yī)藥，2003，20（5）：74-75.

[5]馬穩(wěn)，李丹.夏桑菊中熊果酸的提取方法及可靠性研究[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，16（3）：318-319.

[6]盧靜，張博超，姜瑋，等.熊果酸抗氧化性能的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（4）：126-127.

[7]河南大學(xué).一種天然化合物熊果酸在抗菌方面的應(yīng)用[P].中國專利：CN101543499，2009-09-30.

[8]Subbaramaiah K，Michaluart P，Sporn MB，et al.Ursolie acid inhibits cyclooxygemse-2 transcription in human mammmy epithelial cells[J].Cancer Research，2000，60（9）：2399-2404.

[9]劉瓊，葉秀峰，張徽.熊果酸抑制膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤生長及其機(jī)制的初步探討[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（11）：1041-1044.

[10]林科，張?zhí)?，張鶴云.山楂中熊果酸的提取及其對小鼠的降血脂作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19：1052-1054.

[11]張杰，吳淑艷，王琳，等.熊果酸對高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠脂質(zhì)代謝的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（5）：975-978.

[12]Christeller JT，McGhie TK，Poulton J，et al.Triterpene acids from apple peel inhibit lepidopteran larval midgut lipases and larval growth[J].Arch Insect Biochem Physiol，2014，86（3）：137-150.

[13]劉志芳，田萌，馬躍文，等.熊果酸和齊墩果酸對胰脂肪酶活性及構(gòu)象的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2600-2602.

[14]單萍，趙淑娥.紫外一熒光分光光度法聯(lián)用測定熊果酸對胰脂肪酶的抑制作用[J].江西科學(xué)，2014，32（3）：309-313.

[15]Sun Mi Jang，Sung Tae Yee，Jina Choi，et al．Ursolic acid enhances the cellular immune system and pancreatic β-cell function in streptozotocin-induced diabetic mice fed a high-fat diet[J].International Immunopharmacology，2009，9：113-119.

[16]熊筱娟，陳蔚云，崔江龍，等.烏索酸對大鼠膽汁的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003，31（4）：54.

[17]樊慧錦，田維熙，馬曉豐.熊果酸抑制脂肪酸合酶及誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，48（3）：266-269.

[18]李迪，王冠粱，山夢雅，等.熊果酸對3T3-LI脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型CAP表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2012，10（8）：886-893.

Effect of Ursolic Acid on Fat production

Zhao Chenrun1Xia Huanchun1Ma Xi2*（1.Beijing 101 high school，Beijing 100091，China；2.China Agricultural University College of animal science and technology，Beijing 100193，China）

Aim：Many studies have shown that ursolic Acid（UA）has many biological effects.Mostly studies focus on adding UAinto diet or gavage manner，but drinking UAis more convenient in real life.This study aimed at the effect of UAon losing fat.Method：The mice with high fat feedstuff was taken UAin drinking way，then the fat production was checked，and also the differentation and lipid droplets of preadipocytes cell line after UAtreatment.Results：The results showed body weights and abdominal fat from female mice drinking 1μg·mL-1UAwere significantly decreased compared with other groups.However，in female mice there was no difference of body weights.There were similar results in preadipocytes cell line treated with UA.The differentiation of preadipocytes cells was suppressed and the lipid droplets were reduced when cells were treated with 1μg·mL-1UA，but 5μg·mL-1UAtreatment had no effect on preadipocytes cells.Conclusion：In summary，right dosage of UAcould decrease fat production in female mice and cell line，but not in male mice.

Ursolic Acid Mice Preadipocytes cell line Fat production

R285

B

1672-8351（2016）10-0128-03

△國家自然科學(xué)基金（31272448）和中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會青少年后備人才計(jì)劃資助。