羅　婷李書淵

（1.廣東藥科大學(xué)藥科學(xué)院廣州510006；2.廣州市藥品檢驗所廣州510160；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院廣州510006）

阿加曲班細菌內(nèi)毒素檢查法研究

羅婷1,2李書淵3*

（1.廣東藥科大學(xué)藥科學(xué)院廣州510006；2.廣州市藥品檢驗所廣州510160；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院廣州510006）

目的：對阿加曲班進行細菌內(nèi)毒素檢查法的研究，建立阿加曲班細菌內(nèi)毒素檢查法。方法：按《中國藥典》2010年版附錄XI E進行實驗，確立阿加曲班細菌內(nèi)毒素檢查法。結(jié)果：阿加曲班細菌內(nèi)毒素不得過1.85EU/mg。結(jié)論：建立的阿加曲班細菌內(nèi)毒素檢查方法可行。

阿加曲班 細菌內(nèi)毒素 干擾試驗

阿加曲班是一種凝血酶抑制劑，可逆地與凝血酶活性位點結(jié)合。阿加曲班注射液作為靜脈注射液用于對慢性動脈閉塞癥（血栓閉塞性脈管炎、閉塞性動脈硬化癥）患者的四肢潰瘍、靜息痛及冷感等的改善[1]。阿加曲班原料藥細菌內(nèi)毒素檢查方法現(xiàn)行版各國藥典均未收載，阿加曲班作為阿加曲班注射液的原料，進行細菌內(nèi)毒素檢查十分必要[2]。

1　儀器和試藥

1.1儀器：ET-96內(nèi)毒素凝膠法測定儀，天平，其他玻璃實驗儀器包括移液管、25mL三角燒瓶、試管，所有使用的玻璃儀器經(jīng)過250℃2h滅菌處理后使用。

1.2試藥

1.2.1樣品：阿加曲班（意大利Italy EUTICALS S.P.A.，規(guī)格/劑型：原料藥，批號：ARGAT0017T；ARGAT0015T；ARGAT0016T）。

1.2.2試劑：見表1

表1　試劑Table1 Reagent

2　方法與結(jié)果

2.1限值的確定

公式：L=K/M，根據(jù)阿加曲班注射液說明書：成人用量：一次10mg（一次一支），一日2次，每次用輸液稀釋后，進行2～3h的靜脈滴注。由此確定M為10mg/（60kg·2h），注射劑K取5EU/（kg·h），由上述公式可得出L=60EU/mg。

由于阿加曲班原料藥細菌內(nèi)毒素檢查方法現(xiàn)行版各國藥典均未收載，日本三菱制藥廠生產(chǎn)的阿加曲班注射液（2mL：10mg）在進口藥品注冊標準JX20090312中規(guī)定細菌內(nèi)毒素不得過5EU/mL，根據(jù)注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則規(guī)定：細菌內(nèi)毒素檢查限值按規(guī)定要求計算，據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄XIX M化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則細菌內(nèi)毒素或熱原檢查：“若屬于心血管藥的限值可嚴格至計算值的1/3～1/2，以保證用藥安全?！盠=1.85EU/mg。

2.2鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗：按照《中國藥典》2010年二部附錄XI E細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定[2]，進行鱟試劑的標示靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表2。

表2　鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Table2 Results of the tachypleus amebocyte lysate sensibility review

兩批鱟試劑經(jīng)用細菌內(nèi)毒素工作標準品檢查，λc均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，結(jié)果符合規(guī)定。

2.3干擾實驗預(yù)試驗

2.3.1阿加曲班有效稀釋濃度（MVC）的計算

公式：MVC=λ/L，其中L為細菌內(nèi)毒素限值1.85EU/mg，λ為鱟試劑標示靈敏度，根據(jù)目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03EU/mL。

阿加曲班的對應(yīng)有效稀釋濃度為：C0.5=0.5/1.85=0.27mg/ mL；C0.25=0.25/1.85=0.135mg/mL；C0.125=0.125/1.85=0.068mg/mL；C0.06=0.06/1.85=0.032mg/mL；C0.03=0.03/1.85=0.016mg/mL

2.3.2供試品溶液、細菌內(nèi)毒素標準溶液的配制：將阿加曲班供試品用細菌內(nèi)毒素用水溶解，制成初始濃度為50mg/mL混懸液，再用細菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋成濃度為10mg/mL；1.0mg/mL；0.5mg/mL；0.25mg/mL；0.125mg/mL；0.0625mg/mL；0.031mg/mL；0.016mg/mL的一系列溶液（NPC）。

另制備相同濃度的系列供試品溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2λ濃度的細菌內(nèi)毒素，作為陽性對照溶液（PPC）[3]。設(shè)立細菌內(nèi)毒素工作標準品陽性對照管（PC）和陰性對照管（NC），然后按細菌內(nèi)毒素檢查法操作，進行預(yù)干擾實驗。結(jié)果見表3、表4。

2.3.3鱟試劑：福州新北生化工業(yè)有限公司批號：12110912靈敏度：0.25EU/mL

表3　干擾預(yù)試驗結(jié)果Table3 Pre interference test results

2.3.4鱟試劑：湛江博康海洋生物有限公司批號：1110181靈敏度：0.25EU/mL

表4　干擾預(yù)試驗結(jié)果Table4 Pre interference test results

由此可見，阿加曲班在0.5mg/mL以下的濃度時對鱟試劑的凝集反應(yīng)無干擾作用。

2.4正式干擾試驗：根據(jù)預(yù)干擾實驗結(jié)果，取該濃度溶液和細菌內(nèi)毒素檢查用水分別將細菌內(nèi)毒素標準品制成0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL的一系列溶液。陰性對照：用細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照，記為NC。將上述溶液分別與靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑進行反應(yīng)，每一濃度平行做4管。按《中國藥典》2010年版二部附錄中的“細菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗項”進行實驗。結(jié)果見表5、表6。

2.4.1鱟試劑：福州新北生化工業(yè)有限公司批號：12110912靈敏度：0.25EU/mL

表5　正式干擾試驗結(jié)果Table5 Results of the interference test

2.4.2鱟試劑：湛江博康海洋生物有限公司批號：1110181靈敏度：0.25EU/mL

表6　正式干擾試驗結(jié)果Table6 Results of the interference test

由上表可見，Es/Et均在0.5～2.0之間，表明濃度為0.5mg/ mL的供試品溶液與細菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)無干擾，可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

2.5樣品細菌內(nèi)毒素檢查：阿加曲班有效稀釋濃度（MVC）的計算：

MVC=λ/L=0.25/1.85=0.135mg/mL，其中L為細菌內(nèi)毒素限值1.85EU/mg，λ為鱟試劑標示靈敏度0.25EU/mL。

按《中國藥典》細菌內(nèi)毒素檢查法，使用兩批不同廠家的鱟試劑分別對樣品進行細菌內(nèi)毒素檢查，并同時設(shè)立樣品的自身陽性對照管，結(jié)果見表7、表8。

2.5.1鱟試劑：福州新北生化工業(yè)有限公司批號：12110912靈敏度：0.25EU/mL

表7　細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Table7 Results of the bacterial endotoxins test

2.5.2鱟試劑：湛江博康海洋生物有限公司批號：1110181靈敏度：0.25EU/mL

表8　細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Table8 Results of the bacterial endotoxins test

3　討論

3.1由干擾預(yù)試驗結(jié)果可以得知阿加曲班在0.5mg/mL以上的稀釋濃度對鱟試劑的凝集反應(yīng)存在干擾作用，稀釋濃度至0.5mg/mL以下則與鱟試劑的凝集反應(yīng)無干擾影響。

3.2正式干擾試驗使用0.5mg/mL濃度，且用兩個廠家鱟試劑結(jié)果Es/Et均在0.5～2.0之間無干擾影響。

3.3由于本品供試品溶液為混懸液，試驗中發(fā)現(xiàn)制成100mg/mL混懸液時樣品極難均勻分布在水中，混懸液中還存在不少較大的顆粒，影響下一步的稀釋。經(jīng)試驗，使用50mg/mL溶液作為起始濃度，可得到相同結(jié)果。建議初始濃度使用50mg/mL或10mg/ mL再作進一步稀釋，避免混懸液中顆粒堵塞移液管口。

3.4經(jīng)測定，樣品濃度在0.5mg/mL時的pH值為6.9～7.1，符合《中國藥典》規(guī)定（規(guī)定pH值為6.0～8.0），不影響該樣品的凝集試驗[4]。

[1]莊源，魏廣寬.阿加曲班聯(lián)合丁苯酞治療進展性腦梗死療效分析[J].中國實用醫(yī)藥，2016，3（11）：121-122.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄85.

[3]劉海疆，陳志勇，田冰，等.長春西汀氯化鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（1）：108.

[4]張云平，陳啟釗.建立血栓通凍干粉針細菌內(nèi)毒素檢查方法[J].醫(yī)療裝備，2016，2（29）：111-112.

Study on Bacterial Endotoxin test of Argatroban

Luo Ting1，2Li Shuyuan3*（1.School of Pharmacy,Guangdong Parceutical University,Guangzhou Guangdong 510006；2.Guangzhou Institut for Drug Control,Guangzhou Guangdong 510160；3.School of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Parceutical University,Guangzhou Guangdong 510006）

Objective：To establish a method for bacterial endotoxin test of Argatroban．Methods：According to the method for bacterial endotoxin test in Ch.P2010（Appendix XI E），the study was performed．Results：The sample solution of Argatroban at1.85EU/mg or lower concentration could eliminate the interference factors.Conclusion：To establish the method of Bacterial Endotoxin of Argatroban is feasible.

Argatroban Method for bacteria endotoxin test Interference test

R927.2

A

1672-8351（2016）10-0009-03