張繼東 ， 魏　河 ， 李勇強

(1.寧夏公安廳 物證鑒定中心 ， 寧夏 銀川　750011 ； 2.陜西師范大學 化學化工學院 ， 陜西 西安　710062)

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二氧化硅/磁性石墨烯復合材料的制備及在MALDI-TOF MS檢測喹諾酮類藥物中的應(yīng)用

張繼東1， 魏河2， 李勇強1

(1.寧夏公安廳 物證鑒定中心 ， 寧夏 銀川750011 ； 2.陜西師范大學 化學化工學院 ， 陜西 西安710062)

采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜方法，以二氧化硅/磁性氧化石墨烯復合材料為富集和檢測平臺，建立了復雜樣品中環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星三種藥物的測定方法。實驗結(jié)果表明二氧化硅/磁性石墨烯復合材料(Fe3O4/GO/SiO2)與傳統(tǒng)基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)相比，對小分子的檢測具有更好的靈敏度和信噪比。而且對于復雜樣品無需預(yù)處理過程，可以對實際樣品中的三種藥物直接進行富集檢測。

磁性石墨烯復合材料 ； 喹諾酮類藥物 ； MALDI-TOF MS ； MALDI基質(zhì)

喹諾酮類抗菌藥是一種廣譜的抗菌類藥物，在臨床治療、魚牧業(yè)養(yǎng)殖以及食品等方面具有廣泛應(yīng)用，為我們的健康和生活起到了積極作用[1-3]。然而，近年來由于我國抗生素的使用越來越頻繁，人們對抗生素的耐受性逐漸提高，造成了免疫力下降，抗生素療效減退的情況，對我國人民的生活健康產(chǎn)生了負面影響，同時在水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)牧業(yè)、乳制品等行業(yè)也存在一定的抗生素殘留問題，嚴重威脅著人們的飲食安全和健康。因此建立復雜樣品中喹諾酮類抗生素的簡單、靈敏檢測方法具有重要的意義[4]。

與LC-MS、GC-MS等質(zhì)譜技術(shù)相比，MALDI MS對樣品的前處理更簡單，同時MALDI MS對鹽的耐受性較高，對實際樣品的分析便捷。

本研究利用二氧化硅/磁性石墨烯復合材料(Fe3O4/GO/SiO2)作為富集和檢測平臺，選取了環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星作為喹諾酮類藥物代表物，對生物復雜樣品中的多種喹諾酮類藥物進行了快速檢測。

1　儀器與試劑

儀器：德國Bruker公司MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀。

試劑、藥物：甲醇(分析純)、乙醇(分析純)、乙腈(色譜純)；環(huán)丙沙星鹽酸鹽、諾氟沙星和氧氟沙星(標準品，美國Sigma試劑公司)；α-氰基-4-羥基肉桂酸CHCA(標準品，美國Bruker公司)。

2　方法與結(jié)果

2.1質(zhì)譜條件

本研究采用德國Bruke的MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀，配有波長為337 nm的脈沖氮氣激光光源，應(yīng)用模式為正離子反射模式，所有質(zhì)譜圖的激光照射次數(shù)皆為100次。儀器條件為：激光重復頻率為50 Hz，延遲時間為190 ns，加速電壓為20 kV。

2.2溶液配制

準確稱取5 mg的環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星，分別配置成濃度為1 mg/mL的儲備液，放于冰箱中備用。其中環(huán)丙沙星使用超純水配制，諾氟沙星和氧氟沙星使用乙腈/水(1∶1，體積分數(shù))配制。稱取1.0 mg Fe3O4/GO/SiO2，將其分散于1.0 mL的乙醇/水中，超聲30 min得到均勻溶液。用乙腈/水(1∶1，體積分數(shù))做溶劑，配制CHCA的飽和溶液。

2.3材料的制備

通過Hummers法合成制備了氧化石墨烯(GO)，得到的GO與FeCl2·H2O通過氧化還原經(jīng)過一步反應(yīng)得到Fe3O4/GO，利用TEOS作為硅烷化試劑將SiO2包覆于Fe3O4/GO，得到 Fe3O4/GO/SiO2[5-8]。利用紅外光譜(FTIR)對其官能團進行表征。

2.4紅外光譜(FT-IR)表征

采用德國布魯克紅外光譜儀測試樣品的組成。具體步驟：將溴化鉀與干燥的GO和Fe3O4/GO/SiO2分別均勻混合后壓片測試。紅外光譜(FT-IR)的紅外特征峰如圖1所示。

圖1　GO和Fe3O4/GO/SiO2的紅外光譜圖

2.5Fe3O4/GO/SiO2對環(huán)丙沙星吸附性能的研究

2.5.1磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料的吸附動力學

為了研究得到的材料對藥物的吸附速率，以環(huán)丙沙星為目標分子，繪制了其吸附動力學曲線，如圖2所示。

圖2　Fe3O4/GO/SiO2對環(huán)丙沙星吸附的動力學曲線

從圖2中可以看出，在吸附開始階段，磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料對環(huán)丙沙星的吸附量迅速增加，此后隨著時間的推移，吸附量的增速減緩，在110～120 min時已經(jīng)基本達到平衡。在吸附過程的初始階段，磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料表面具有大量的吸附位點，環(huán)丙沙星分子能夠迅速地吸附在Fe3O4/GO/SiO2表面，具有較大的吸附速率。然而隨著時間的推移，磁性氧化石墨烯表面的吸附位點逐漸減少，被目標分子占據(jù)，材料對環(huán)丙沙星分子的吸附速率逐漸減小，吸附速率的增加也趨于平緩，最終達到平衡。

2.5.2靜態(tài)吸附實驗

為了研究磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料對喹諾酮類藥物的吸附性能，選取了環(huán)丙沙星作為喹諾酮類藥物的代表，以磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料作為吸附劑對環(huán)丙沙星進行吸附試驗。圖3為一定量的Fe3O4/GO/SiO2對梯度濃度的環(huán)丙沙星吸附2 h的吸附等溫線，從圖3中可以看出，F(xiàn)e3O4/GO/SiO2對環(huán)丙沙星的吸附量隨著環(huán)丙沙星的濃度增大而增加，而當環(huán)丙沙星的濃度達到一定程度時，F(xiàn)e3O4/GO/SiO2對環(huán)丙沙星的吸附量保持不變，說明環(huán)丙沙星在Fe3O4/GO/SiO2表面的吸附趨于飽和。在環(huán)丙沙星的測量濃度范圍內(nèi)，根據(jù)Langmuir等溫吸附方程，對環(huán)丙沙星的吸附等溫曲線進行擬合，得到線性方程相關(guān)系數(shù)R=0.988 4。Langmuir方程擬合的良好的線性關(guān)系，說明環(huán)丙沙星在Fe3O4/GO/SiO2的吸附符合Langmuir吸附規(guī)律，表明環(huán)丙沙星在Fe3O4/GO/SiO2上的吸附過程以單分子層吸附為主。經(jīng)過進一步的計算，得出磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料對環(huán)丙沙星的最大吸附量為44.3 mg/g。

圖3　Fe3O4/GO/SiO2對環(huán)丙沙星的吸附等溫線

2.6分析喹諾酮類藥物

以CHCA和Fe3O4/GO/SiO2作為MALDI基質(zhì)，分別以環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星作為喹諾酮藥物的分析對象，采用MALDI-TOF MS分點法分別點樣，待其干燥后直接對其進行MALDI質(zhì)譜分析。圖4為Fe3O4/GO/SiO2作為MALDI基質(zhì)檢測三種藥物的質(zhì)譜圖。從圖4中可以觀察到，CHCA作為基質(zhì)時背景具有很強的離子干擾峰，由于樣品信號峰淹沒在大量強度較強的背景峰中，因而難以從圖中準確歸屬信號峰。當以Fe3O4/GO/SiO2作為MALDI基質(zhì)時，幾乎沒有產(chǎn)生背景離子干擾峰，同時三種藥物的檢測效果良好。其中環(huán)丙沙星的分子離子峰為[M+K]+， 諾氟沙星的兩個分子離子信號峰分別為[M+Na]+和[M+K]+，而氧氟沙星的分子離子信號峰則為[M+Na]+的分子離子信號峰。實驗結(jié)果表明，本試驗所采用的Fe3O4/GO/SiO2作為MALDI 基質(zhì)用于檢測喹諾酮類抗菌藥物具有良好的效果。

a.基質(zhì)Fe3O4/GO/SiO2　b.環(huán)丙沙星　c.諾氟沙星　d.氧氟沙星；CHCA作為MALDI基質(zhì)檢測喹諾酮類藥物　e.基質(zhì)CHCA　f.環(huán)丙沙星　g.諾氟沙星　h.氧氟沙星

2.7實際樣品中喹諾酮類藥物的富集檢測

將15%的TCA水溶液與牛奶按照1∶3的比例混合，加入藥品，將渦旋振蕩器調(diào)至五檔后震蕩1 min，然后靜置10 min，使蛋白完全沉淀，再以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液待用。

將1.0 mg/mL的Fe3O4/GO/SiO2基質(zhì)儲備液超聲10 min，得到均勻的基質(zhì)溶液，取10 μL懸浮液立即加入到500 μL的分析溶液中，將混合的溶液超聲15 min，利用磁性進行分離，移去上清液，將富集到分析物的Fe3O4/GO/SiO2再次懸浮于10 μL的乙醇/水(1∶1，體積分數(shù))溶液中。最后，取1 μL的懸浮液直接點樣于樣品板上，在室溫下自然揮干，進行MALDI-TOF MS分析。圖5展示了牛奶中環(huán)丙沙星，以及尿液樣品中的諾氟沙星和氧氟沙星在富集前后的質(zhì)譜圖。三種藥物的信號強度與富集前相比顯著增加，此現(xiàn)象表明了Fe3O4/GO/SiO2對環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星具有一定的吸附富集能力。環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星的富集倍數(shù)皆達到了50倍。因此，本研究所應(yīng)用的Fe3O4/GO/SiO2，對于復雜樣品中的多種喹諾酮類藥物，作為富集材料和檢測平臺，在MALDI MS檢測過程中展現(xiàn)出雙平臺的功能，簡化了樣品的預(yù)處理步驟，為喹諾酮類藥物的快速檢測提供了新的手段。

a.牛奶中環(huán)丙沙星富集前　b.尿樣中諾氟沙星富集前　c.尿樣中氧氟沙星富集前　d.牛奶中環(huán)丙沙星富集后　e.尿樣中諾氟沙星富集后　f.尿樣中氧氟沙星富集后

3　討論

MALDI質(zhì)譜常用的點樣方法有兩種：①分點法，即先將基質(zhì)點于靶板上，待自然風干后再將待測樣品點于板上；②混合點樣法，將基質(zhì)與樣品溶液等量混合均勻，然后直接點于靶板上，待自然干燥后測量。相對于石墨烯作為基質(zhì)，本研究使用的磁性氧化石墨烯/二氧化硅復合材料點板后能形成更加均勻的基質(zhì)薄層，因而能量的吸收較好，同時能量的分布更加均勻，本實驗采用分別點樣法進行試驗。

以Fe3O4/GO/SiO2作富集和檢測的雙功能平臺對復雜樣品中的喹諾酮類藥物進行快速檢測。Fe3O4/GO/SiO2基于氧化石墨烯功能化而來，具有和氧化石墨烯相同的二維層狀結(jié)構(gòu)，因此具有良好的吸附性能和能量傳導性。與傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA相比，F(xiàn)e3O4/GO/SiO2對小分子的檢測具有更好的靈敏度和信噪比。同時由于功能化過程中引入了Fe3O4磁性顆粒，與石墨烯和氧化石墨烯相比，F(xiàn)e3O4/GO/SiO2大大縮短了樣品的富集和前處理的時間，為復雜樣品的應(yīng)用提供了可能。同時，本研究制備的Fe3O4/GO/SiO2在最外層有硅包覆，因此在使用過程中磁性顆粒不易脫落，磁性不易衰減。因此，F(xiàn)e3O4/GO/SiO2對復雜體系中的多種喹諾酮類藥物進行富集，并直接用于MALDI-TOF MS檢測，為喹諾酮類藥物小分子快速分離檢測和MALDI-TOF MS高通量分析提供了基礎(chǔ)。

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Preparation of SiO2/ Magnetic Gagnetic Graphene Composites and Application in the Detection of Quinolones Drugs by MALDI-TOF MS

ZHANG Jidong1, WEI He2, LI Yongqiang1

(1.Institute of Forensic Science , Ningxia Public Security Bureau , Yinchuan750011 , China ；2.School of Chemistry and Chemical Engineering , Shanxi Normal University , Xi′an 710062 , China)

SiO2/Magnetic gagnetic graphene is applied as a MALDI matrix for the analysis of quinolones antibacterial drugs.The results show that these compounds could be successfully analyzed by MALDI -TOF-MS using the reported method. The new method not only shows good performance in quinolones drug analysis but also is a directly analysis method for complicated sample without any pretreatment.

magnetic graphene composites ; quinolone drugs ; MALDI-TOF MS ; MALDI matrix

2016-06-20

張繼東(1970-)，男，高級工程師，從事刑事技術(shù)理化(毒物、毒品及微量物證)檢驗鑒定工作，電話：0951-6136223。

TQ050.43，TQ463.24

A

1003-3467(2016)09-0026-05