李德文，付金穎，魏曉雪，唐中華，祖元?jiǎng)?/p>

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學(xué)院火山與礦泉研究所，黑龍江五大連池 164155)

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外源NO調(diào)控紅松幼苗光合作用與抗氧化酶活性的濃度效應(yīng)

李德文1，付金穎1，魏曉雪2*，唐中華1，祖元?jiǎng)?

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省科學(xué)院火山與礦泉研究所，黑龍江五大連池 164155)

[目的]探討不同濃度外源NO對(duì)紅松針葉光合色素和抗氧化酶活性的影響。[方法]以3年生紅松針葉為試驗(yàn)材料，測(cè)定噴施不同濃度外源NO供體硝普鈉溶液(0、0.01、0.10、0.50和1.00 mmol/L SNP)處理下其光合色素含量、抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量和過(guò)氧化氫(H2O2)含量等生理指標(biāo)。[結(jié)果]凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和呼吸速率(Rd)會(huì)隨著SNP濃度增加而增加，分別在SNP噴施0.10和0.50 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值；噴施0.01 mmol/L SNP有效提高了氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、光合色素含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性，而超氧化物歧化酶(SOD)活性、H2O2含量和MDA含量在噴施外源NO時(shí)顯著降低。[結(jié)論]施加適量濃度外源NO會(huì)顯著增加光合參數(shù)、光合色素含量、CAT活性、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性、POD活性，但施加外源NO降低了SOD活性、H2O2含量、MDA含量，從而降低了細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，減輕了紅松幼苗受到的傷害。

紅松；外源NO；生理指標(biāo)

NO是一種廣泛存在于生物體的氣體活性分子，既是氧化還原信號(hào)分子和毒性分子，也是一種活性氮(RNS)。NO在植物體內(nèi)主要通過(guò)一氧化氮合成酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)催化形成[1]。NO對(duì)植物的種子萌發(fā)、根和葉的生長(zhǎng)發(fā)育、植物組織的成熟和衰老、呼吸作用、光形態(tài)建成、脅迫響應(yīng)、逆境誘發(fā)的細(xì)胞性程序死亡等生理過(guò)程均有調(diào)節(jié)作用，尤其是在植物抗病防御反應(yīng)中的作用引人注意，研究表明NO在植物細(xì)胞中是一種重要的第二信使[2]。Beligni等[3]認(rèn)為植物NO具有雙重生理效應(yīng)，高濃度NO具有生理毒性，低濃度NO具有保護(hù)作用[4]，并與細(xì)胞的微環(huán)境和NO的實(shí)際濃度有關(guān)，如高濃度NO抑制玉米[5]、豌豆[6-7]、水稻[8]等植物細(xì)胞的生長(zhǎng)，低濃度NO則促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

紅松(Pinuskoraiensis)是我國(guó)寒溫帶針闊混交林的主要樹(shù)種，以紅松為主的針闊葉混交林是東北地區(qū)最具有代表性的森林類型。紅松以樹(shù)干通直高大、材質(zhì)優(yōu)良、壽命長(zhǎng)、生產(chǎn)力高、種子營(yíng)養(yǎng)豐富等獨(dú)特的用途和價(jià)值而聞名于世，是目前世界上珍貴而稀有的多用途樹(shù)種之一[9]。由于天然紅松林分布的局限性，人們對(duì)其的研究主要集中在中國(guó)、俄羅斯、日本和韓國(guó)。目前，紅松的研究主要集中在紅松個(gè)體、群落生態(tài)及天然闊葉紅松林生態(tài)系統(tǒng)合理經(jīng)營(yíng)和恢復(fù)等方面[10-11]，對(duì)紅松生理學(xué)的研究很少，主要集中在干旱、地溫、大氣CO2濃度升高等環(huán)境因子對(duì)紅松生理生化指標(biāo)的影響方面，但關(guān)于外源物質(zhì)對(duì)紅松生長(zhǎng)及生理影響的研究較少。鑒于此，筆者選用不同濃度的NO供體SNP對(duì)紅松幼苗進(jìn)行處理，探討了不同濃度的外源NO信號(hào)對(duì)紅松針葉光合特性和生理指標(biāo)的影響，明確了外源NO優(yōu)化調(diào)控紅松幼苗生長(zhǎng)生理的最適濃度。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況試驗(yàn)于2010年4月21日開(kāi)始，在東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室進(jìn)行。試驗(yàn)材料為3年生紅松幼苗，于帽兒山林場(chǎng)苗圃區(qū)移取，并采用盆栽的方式在東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的溫室內(nèi)進(jìn)行日常管理和培育。供試土壤的基本理化性狀為：pH 5.6、有機(jī)質(zhì)25 g/kg、速效氮200 mg/kg、速效磷90 mg/kg、速效鉀200 mg/kg。

1.2材料試劑包括硝普鈉(SNP，上海國(guó)藥集團(tuán))。儀器包括LI-6400便攜式光合儀(美國(guó)LI-COR公司)和UV-2550型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)將紅松幼苗隨機(jī)分為5組，每組50株，外源NO供體采用硝普鈉，先用蒸餾水配制1.00 mmol/L的母液，4 ℃保存，用時(shí)按試驗(yàn)所需的濃度進(jìn)行稀釋。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理：CK(對(duì)照，0 mmol/L SNP)、T1(0.01 mmol/L SNP)、T2(0.10 mmol/L SNP)、T3(0.50 mmol/L SNP)、T4(1.00 mmol/L SNP)，CK用100.0 mL 清水均勻噴施于葉面，T1、T2、T3、T4分別使用響應(yīng)濃度的100.0 mL SNP溶液噴施于葉面。處理7 d后測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，每個(gè)處理均隨機(jī)取樣，重復(fù)3次。

1.4測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1光合參數(shù)測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)室處理周期內(nèi)，在晴天9：00～11：00選取完全展開(kāi)、生長(zhǎng)狀況良好、葉位一致的葉片，使用LI-6400便攜式光合儀，在人工紅藍(lán)光源、氣溫24～27 ℃、相對(duì)濕度50%～70%、CO2濃度為400 μmol/(m2·s)條件下測(cè)定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理測(cè)定5株，每株重復(fù)測(cè)定5次，取平均值。

1.4.2光合色素含量測(cè)定。參照前人的試驗(yàn)方法[12-13]。取0.05 g樣品，剪碎，加入5.0 mL二甲基亞砜(DMSO)，黑暗條件下60 ℃水浴反應(yīng)直至樣品組織完全變白，以DMSO為空白，使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)分別測(cè)定提取液在480、649、665 nm波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量。

1.4.3H2O2含量測(cè)定。稱取新鮮植物組織0.50 g，按材料與提取劑1∶1的比例加入4 ℃預(yù)冷的丙酮和少許石英砂，研磨成勻漿，3 000 r/min離心10 min，棄殘?jiān)锨逡杭礃悠诽崛∫?。吸取樣品提取?.0 mL，向試管中分別加入0.1 mL 5%硫酸鈦和0.2 mL濃氨水，待沉淀形成后，3 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌3～5次直至去除植物色素，向洗滌后的沉淀中加入2 mol/L硫酸5.0 mL，待沉淀完全溶解后，將其轉(zhuǎn)入10.0 mL容量瓶中，并用少量蒸餾水多次沖洗離心管，合并洗滌液后定容，測(cè)定415 nm波長(zhǎng)處吸光值[14]。

1.4.4抗氧化酶活性測(cè)定。取0.50 g葉片，液氮研磨，參照文獻(xiàn)[15]方法測(cè)定抗氧化酶活性。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性：以1 minA240的變化值表示酶活性大??；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的活性：以1 minA290的變化值表示酶活性大??；過(guò)氧化物酶(POD)活性：以1 minA470的變化值表示酶活性大??；超氧化物岐化酶(SOD)活性：以單位時(shí)間內(nèi)抑制氮藍(lán)四唑光化還原50%為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.4.5丙二醛(MDA)含量測(cè)定。稱取0.50 g樣品于預(yù)冷的研缽中，液氮研磨，轉(zhuǎn)入離心管中，加入預(yù)冷的10%三氯乙酸(TCA)5.0 mL提取，混合液在4 ℃下4 000 r/min離心10 min，合并上清液[16]。從玻璃試管中吸取3.0 mL上清液，與2.0 mL 0.5%TBA混勻，加塞?；旌弦涸诜兴≈兄蠓?5～30 min(出現(xiàn)氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí))，迅速放入冷水中冷卻，8 000 r/min離心15 min。取上清液測(cè)定532、450、600 nm波長(zhǎng)處吸光值，空白為0.5%的TBA。

1.5數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用單因素方差分析檢驗(yàn)各處理組間差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度SNP對(duì)紅松針葉光合參數(shù)的影響由表1可知，不同濃度SNP處理對(duì)Pn、Gs、Ci和Tr的影響不同。Pn、Tr最大值出現(xiàn)在0.10 mmol/L濃度SNP處理，Ci、Gs最大值出現(xiàn)在0.01 mmol/L 濃度SNP處理。與對(duì)照相比，低濃度SNP(≤0.50 mmol/L)顯著提高了Pn、Gs、Tr；高濃度SNP(≥0.50 mmol/L)顯著提高了Rd。

表1　不同濃度SNP對(duì)紅松幼苗Pn、Gs、Ci、Tr和Rd的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

Note：Different lowercase letters in the same column mean significant differences at 0.05 level.

表2　不同濃度SNP對(duì)紅松幼苗針葉光合色素的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

Note：Different lowercase letters in the same column mean significant differences at 0.05 level.

2.2不同濃度SNP對(duì)紅松針葉光合色素的影響由表2可知，不同濃度SNP處理紅松幼苗7 d后,光合色素含量在SNP濃度為0.01 mmol/L時(shí)最高，在1.00 mmol/L時(shí)最低。T1處理與其他處理組差異顯著，而其他各處理組之間差異不顯著，說(shuō)明T1處理有效提高了光合色素含量。

2.3不同濃度SNP對(duì)紅松針葉抗氧化酶活性的影響不同濃度SNP對(duì)抗氧化酶活性的影響不同(表3)，SNP濃度為0.01 mmol/L時(shí)顯著提高了CAT和POD活性，POD活性為107.441 U/(g·min)，較對(duì)照提高了130%，在 SNP濃度為1.00 mmol/L時(shí)兩者活性均最低。在SNP濃度為0.10 mmol/L APX活性有所提高但差異不顯著，SNP濃度為1.00 mmol/L時(shí)顯著降低了APX活性；不同濃度SNP對(duì)SOD活性無(wú)顯著影響。

表3　不同濃度SNP對(duì)紅松幼苗針葉抗氧化酶活性的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。

Note：Different lowercase letters in the same column mean significant differences at 0.05 level.

2.4不同濃度SNP對(duì)紅松針葉H2O2和MDA含量的影響與CK相比，不同濃度SNP都顯著降低了H2O2和MDA的含量(圖1)。

注：柱上不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。Note：Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 level.圖1　不同濃度SNP對(duì)紅松幼苗針葉H2O2和MDA含量的影響Fig.1　Effects of different concentrations of SNP on H2O2 and MDA content in the needles of P.koraiensis

3　結(jié)論

外源施加NO顯著提高了光合氣體參數(shù)。隨著施加SNP濃度的升高光合色素含量出現(xiàn)單峰現(xiàn)象，即先升高后降低，但是只有在濃度為0.01 mmol/L時(shí)與其他處理有顯著差異，故提高光合色素含量的SNP最適濃度為0.01 mmol/L。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是低濃度外源NO供體能夠激活光合色素生物合成過(guò)程中的某些酶類。

總體來(lái)說(shuō)，外源施加NO會(huì)提高抗氧化酶活性，降低H2O2含量和MDA含量，但是對(duì)超氧化物酶活性無(wú)影響；抗氧化酶系統(tǒng)能夠有效清除自由基和過(guò)氧化物的酶，可有效阻止活性氧的積累。

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Concentration Effects of Exogenous Nitric Oxide on Photosynthesis and Activity of Antioxidant Enzymes inPinuskoraiensisSeedlings

LI De-wen1, FU Jin-ying1, WEI Xiao-xue2*et al

1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology of the Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2.Institute of Volcanoes and Mineral Springs, Heilongjiang Academy of Science, Wudalianchi, Heilongjiang 164155)

[Objective] To discuss the concentration effects of exogenous nitric(NO) oxide on photosynthesis and activity of antioxidant enzymes inPinuskoraiensisseedlings.[Method] 3-year-oldP.koraiensisseedlings were treated with sodium nitroprusside (SNP), a NO donor, at 5 different concentrations (0, 0.01, 0.10, 0.50 and 1.00 mmol/L).The contents of photosynthetic pigment, malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2), and the activity of antioxidant enzymes in the needles ofP.koraiensiswere determined.[Result] Net photosynthetic rate (Pn), transpiration rate (Tr) and respiration rate (Rd) increased with the increase of SNP concentration, and reached a maximum when SNP concentration was 0.10 or 0.50 mmol/L.Spraying 0.01 mmol/L SNP would significantly increase stomatal conductance (Gs), intercellular CO2concentration (Ci) and photosynthetic pigment content, the activity of catalase (CAT) and peroxidase (POD).On the contrary, the activity of superoxide dismutase (SOD), H2O2and MDA content would decrease after the spraying of SNP.[Conclusion] Appropriate concentration of nitric oxide (NO) can significantly increase photosynthetic parameters, photosynthetic pigment content, CAT, APX and POD activity.Spraying SNP can decrease SOD activity, H2O2and MDA content.Exogenous NO can relieve the membrane lipid peroxidation ofP.koraiensisseedlings to reduce the damage to the seedlings.

Pinuskoraiensis; Exogenous nitric oxide; Physiological indicators

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2572015CA03)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000133)；黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目。

李德文(1981- )，女，黑龍江雞西人，副教授，博士研究生，從事植物逆境生理生態(tài)學(xué)研究。*通訊作者，副研究員，博士研究生，從事植物生態(tài)學(xué)研究。

2016-07-08

S 718

A

0517-6611(2016)26-0004-03