潘　杰　王晨習(xí)　郎宇璜　劉　敏　楊麗卡　陳鳳媛△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院普外科, 2消化內(nèi)科,3急診科　上?！?00240)

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骨橋蛋白對大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響

潘杰1王晨習(xí)2郎宇璜3劉敏2楊麗卡2陳鳳媛2△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院普外科,2消化內(nèi)科,3急診科上海200240)

目的觀察骨橋蛋白(osteopontin,OPN)對大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells-6,IEC-6)分化、增殖、遷移等生物學(xué)性狀的影響。方法分別采用相差顯微鏡、細(xì)胞貼壁率檢測、噻唑藍(lán)比色法、劃痕實驗、Western blot和ELISA法,觀察不同濃度OPN對IEC-6細(xì)胞增殖、分化和遷移能力的影響,并從鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)表達(dá)變化和炎性反應(yīng)角度,探討其可能的作用機制。結(jié)果經(jīng)不同濃度的OPN處理后,IEC-6細(xì)胞形態(tài)、貼壁率和增殖率均未見明顯變化。OPN能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的移行功能,且OPN濃度越高細(xì)胞遷移速度越快。與低濃度或高濃度OPN相比,適當(dāng)濃度的OPN能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞內(nèi)ODC1蛋白表達(dá)(0.1 μg/mL和1.0 μg/mL OPN)和細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)(0.05 μg/mL OPN)。結(jié)論OPN能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的移行功能,從而促進(jìn)損傷黏膜早期修復(fù),其機制可能與特定濃度的OPN能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ODC1蛋白的表達(dá)和損傷IEC-6細(xì)胞的炎性反應(yīng)有關(guān)。

骨橋蛋白;腸上皮細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;大鼠

骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種分泌型的磷酸化蛋白質(zhì),廣泛分布于組織和細(xì)胞內(nèi),參與了包括骨代謝、慢性炎癥、免疫反應(yīng)、組織修復(fù)、腫瘤生長轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的多種生命現(xiàn)象[1]。Brown等[2]最早描述了OPN在消化道上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞中的表達(dá),正常情況下OPN廣泛分布于消化道的上皮細(xì)胞,特別是腔表面上皮細(xì)胞表面的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物(多糖包被)和細(xì)胞外基質(zhì)中,敲除OPN基因的小鼠不能維持腸黏膜屏障的完整性[3],OPN參與了腔道表面物質(zhì)的屏障功能,在消化道的固有免疫和獲得免疫中均發(fā)揮了重要作用[2,4]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),在炎癥性腸病患者的結(jié)腸組織中,OPN在受損結(jié)腸滲出細(xì)胞中的表達(dá)增加,而在結(jié)腸上皮細(xì)胞中OPN表達(dá)下調(diào)[5]。目前尚不知OPN是否參與受損腸黏膜的修復(fù)過程,故本實驗采用大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells-6,IEC-6)為研究對象,觀察OPN對IEC-6細(xì)胞增殖、分化和移行的影響,并從鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)表達(dá)變化和炎性反應(yīng)角度,探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

細(xì)胞培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞(美國ATCC公司)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(90% DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素+0.1 U/mL胰島素)置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中,次日換液,細(xì)胞生長至90%融合時,用0.25%胰酶消化,傳代。第15～20代細(xì)胞用于實驗,此時的細(xì)胞生物學(xué)功能和特性未發(fā)生明顯變化。

細(xì)胞干預(yù)與分組IEC-6細(xì)胞隨機分為6組,分別為對照組和不同濃度OPN干預(yù)組,OPN濃度分別為0.01、0.05、0.1、1和5 μg/mL,對照組加入等量PBS[6]。

OPN對IEC-6細(xì)胞的形態(tài)的影響取對數(shù)期生長的IEC-6細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL接種于6孔板(1×104個/孔),孵育24 h。加入不同濃度的OPN與IEC-6細(xì)胞孵育,對照組加入等量PBS,24 h后棄上清液,相差顯微鏡觀察IEC-6細(xì)胞的形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。

OPN對IEC-6細(xì)胞貼壁率的影響取對數(shù)期生長的IEC-6細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL接種于6孔板(1×104個/孔),孵育24 h后棄上清液,將貼壁細(xì)胞用胰酶消化后計數(shù)。公式計算:貼壁率(%)=(貼壁細(xì)胞數(shù)/種植總數(shù))×100%。

OPN對IEC-6細(xì)胞增殖影響的檢測采用噻唑藍(lán)(MTT,美國Sigma公司)比色法,收集對數(shù)期生長的IEC-6細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×102/200 μL,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,各組加入不同濃度的OPN,每孔100μL,對照組加入等量PBS,每組設(shè)置5個復(fù)孔。24 h后棄上清液,每孔加入20 μL MTT(用pH值7.4～7.5的PBS緩沖液配制成濃度為0.5% MTT的溶液,即5 mg/mL),繼續(xù)孵育4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定各孔吸光度(D),同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)。

OPN對IEC-6細(xì)胞遷移能力的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞,以5×102/200μL濃度接種于6孔板,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育,待長成單細(xì)胞層后,用移液器槍頭(規(guī)格200 μL)劃出缺損區(qū),造成IEC-6細(xì)胞機械損傷,立即更換培養(yǎng)液,用PBS沖洗細(xì)胞表面2次,以去除細(xì)胞殘骸和碎片。各組加入不同濃度OPN,對照組加入等量PBS,每組設(shè)置3個復(fù)孔。分別在加入OPN后0、4、8、12、16、20、24、28、32 h用倒置顯微鏡下拍照,觀察細(xì)胞遷移情況,采用圖像分析儀對缺損區(qū)隨時間的變化進(jìn)行定量分析。

Western blot法檢測ODC1蛋白表達(dá)各組加入不同濃度OPN,對照組加入等量PBS,與IEC-6細(xì)胞孵育24 h。去除培養(yǎng)液,用PBS清洗1遍,每孔加入100 μm Western及IP細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取總蛋白,14 000×g離心5 min,取上清。采用BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白(每組設(shè)2個復(fù)孔,每份樣本加總蛋白20 μg,分離膠電壓60 V,濃縮膠電壓120 V)。半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜(恒壓15 V,90 min)。TBST中振蕩洗膜3次(每次15 min),用含5% BSA的TBST溶液室溫封閉1.5 h。兔多克隆ODC1抗體(1:500)室溫孵育1.5 h。用TBST洗滌3次(每次15 min)。山羊抗兔辣根過氧化物酶二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌4次(每次10 min)。加顯色液,采用LAS3000成像系統(tǒng)(日本FUJIFILM公司)進(jìn)行攝像分析。

ELISA法檢測骨髓過氧化物酶(MPO)水平取對照組和不同濃度OPN干預(yù)組細(xì)胞的總蛋白,根據(jù)試劑盒說明書檢測骨髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)水平。

結(jié)　　　果

OPN對IEC-6細(xì)胞形態(tài)的影響相差顯微鏡下觀察IEC-6細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,IEC-6細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞群體,多為不規(guī)則多角形,邊界清楚,細(xì)胞核較大,呈卵圓形,細(xì)胞間相互連接,呈現(xiàn)旺盛的增殖活性,貼壁生長。不同濃度OPN干預(yù)組與對照組相比IEC-6細(xì)胞無明顯細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(圖1)。

OPN對細(xì)胞貼壁率的影響對照組和不同濃度OPN干預(yù)組的細(xì)胞貼壁率的具體值見表1。與對照組相比,不同濃度OPN對IEC-6細(xì)胞遷移率的影響無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

OPN對IEC-6細(xì)胞增殖的影響對照組和不同濃度OPN干預(yù)組IEC-6細(xì)胞MTT的具體值見表1。對照組相比,不同濃度OPN對IEC-6細(xì)胞增殖率的影響無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

表1　OPN對IEC-6細(xì)胞貼壁率、增殖率和MPO的影響

vs.Control group,(1)P<0.05.MPO:Myeloperoxidase.

OPN對IEC-6細(xì)胞遷移的影響對照組與不同濃度OPN干預(yù)組IEC-6細(xì)胞遷移情況如圖2所示。5 μg/mL OPN處理培養(yǎng)的小腸上皮細(xì)胞遷移速度較其他濃度OPN組明顯增快,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2OPN對IEC-6細(xì)胞遷移的影響(×40)

Fig 2Effects of OPN on migration of IEC-6 cells (×40)

OPN對IEC-6細(xì)胞ODC1蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測發(fā)現(xiàn)IEC-6細(xì)胞中可見ODC1蛋白的表達(dá),ODC1蛋白主要條帶定位于53 KD,內(nèi)參GAPDH條帶定位于36 KD。與對照組相比各OPN干預(yù)組的ODC1蛋白表達(dá)增強,其中OPN 1.0和0.1 μg/mL干預(yù)組的ODC1蛋白表達(dá)最強,而OPN 0.01、0.05和5.0 μg/mL干預(yù)組的ODC1蛋白表達(dá)較弱(圖3)。

OPN對IEC-6細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響對照組和不同濃度OPN干預(yù)組MPO蛋白活性量值具體數(shù)如表1所示。與對照組相比,0.05 μg/mL OPN干預(yù)組的MPO蛋白活性量表達(dá)最高(P<0.05)。

討　　　論

經(jīng)不同濃度的OPN處理后,OPN能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的移行功能,從而促進(jìn)細(xì)胞缺損區(qū)的修復(fù),且OPN濃度越高細(xì)胞遷移速度越快,而IEC-6細(xì)胞形態(tài)、貼壁率和增殖率均未見明顯變化。我們也發(fā)現(xiàn),OPN能增加IEC-6細(xì)胞內(nèi)ODC1蛋白的表達(dá),同時還能促進(jìn)損傷后IEC-6細(xì)胞內(nèi)的炎性反應(yīng),這兩種現(xiàn)象在適當(dāng)濃度的OPN處理IEC-6細(xì)胞時比低濃度或高濃度OPN處理細(xì)胞時更明顯。

胃腸道黏膜經(jīng)常受到機械性和化學(xué)性(特別是強酸堿物質(zhì))的損傷,并時常遭受有害物質(zhì)的攻擊,與其他器官相比受損機會更多。因此,在長期的進(jìn)化過程中,胃腸道形成了一套完善的自我保護(hù)機制,以修復(fù)受損的黏膜。胃腸黏膜的修復(fù)依賴于正常細(xì)胞增殖和移行,特別是作為快速修復(fù)機制的細(xì)胞遷移,在胃腸黏膜細(xì)胞的保護(hù)中具有更為重要的意義[7-8]。當(dāng)上皮細(xì)胞連續(xù)性受到破壞后,細(xì)胞在損傷后數(shù)分鐘內(nèi)收縮創(chuàng)口,細(xì)胞膜的突起部分開始延伸,跨過損傷的上皮,它不依賴于細(xì)胞再生,但需要上皮細(xì)胞高度協(xié)調(diào)的自發(fā)性應(yīng)答反應(yīng)[9]。OPN參與細(xì)胞存活、炎性反應(yīng)的發(fā)展和創(chuàng)傷修復(fù),提示可能影響?zhàn)つそM織的修復(fù)[4]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),炎癥性腸病患者結(jié)腸上皮細(xì)胞中OPN的表達(dá)下降[5],Gassler等[10]也發(fā)現(xiàn)活動期克羅恩病患者末端回腸潰瘍性病變附近腸上皮細(xì)胞中OPN表達(dá)缺失,化生隱窩中OPN呈輕度過表達(dá)。此種OPN表達(dá)的不一致性可能與克羅恩病的慢性病變過程有關(guān),腸上皮細(xì)胞中OPN表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致黏膜屏障受損,并促進(jìn)炎癥進(jìn)程[10]。本研究的體內(nèi)細(xì)胞損傷實驗?zāi)Ｐ椭?經(jīng)OPN處理后,細(xì)胞缺損區(qū)的修復(fù)明顯快于對照組,說明OPN可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的移行,從而促進(jìn)損傷腸黏膜的修復(fù),且IEC-6細(xì)胞遷移速度隨OPN濃度增高而增快。

圖3OPN對IEC-6細(xì)胞ODC1蛋白表達(dá)的影響

Fig 3Effects of OPN on ODC1 protein levels in IEC-6 cells

與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的分子是多胺,包括精胺、亞精胺和腐胺,這些分子存在于多種飲食中,也可在胃腸道黏膜中合成,當(dāng)細(xì)胞中多胺水平由于抑制劑、突變或轉(zhuǎn)染而下降后,則細(xì)胞分裂、分化及移行等均會被嚴(yán)重抑制。實驗性結(jié)腸炎模型動物予以多胺可加速細(xì)胞遷移,加快黏膜修復(fù),而抑制多胺合成會減慢細(xì)胞遷移[11]。研究表明,ODC是多胺生物合成的重要酶,是促進(jìn)DNA復(fù)制所需,而多胺對正常黏膜生長和損傷后黏膜修復(fù)具有重要作用,細(xì)胞內(nèi)多胺水平則由ODC調(diào)節(jié)。在靜息細(xì)胞中ODC的量很少,但當(dāng)暴露于營養(yǎng)物質(zhì),例如激素、藥物、組織再生刺激物和生長因子時其活性可在數(shù)小時中提高7倍;吸煙會降低ODC活性,延緩潰瘍修復(fù),而這一過程又會被給予多胺所逆轉(zhuǎn)[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn),各OPN干預(yù)組的ODC1蛋白表達(dá)均較對照組增強,其中以0.1 μg/mL和1.0 μg/mL OPN干預(yù)組的ODC1蛋白表達(dá)最強,并非隨OPN濃度的增加而加重;而本研究中的劃痕試驗提示,OPN濃度越高對IEC-6細(xì)胞移性功能的促進(jìn)越明顯,說明仍有其他機制參與促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的移行,尚待進(jìn)一步研究。

OPN又稱為早期T淋巴細(xì)胞活化因子1,在局部炎癥中,它是免疫細(xì)胞募集及啟動Th1細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子[1]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)[5],OPN介導(dǎo)的Th1免疫反應(yīng)參與了小鼠結(jié)腸炎的免疫反應(yīng),OPN可促進(jìn)Th1細(xì)胞因子的表達(dá),但抑制Th2細(xì)胞因子的表達(dá),對機體Th1/Th2細(xì)胞分化的平衡調(diào)節(jié)有著重要的作用。多種組織和細(xì)胞可表達(dá)OPN,包括腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞,OPN在腸道固有免疫和獲得免疫中起重要作用。Toyonage等[13]發(fā)現(xiàn),腸道炎癥早期,腸上皮細(xì)胞是OPN的主要來源,此時OPN產(chǎn)生增加,有利于巨噬細(xì)胞募集。Toyonage等[13]還發(fā)現(xiàn),低劑量的OPN(1、10和100 ng/mL)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,而1000 ng/mL OPN對巨噬細(xì)胞的吞噬功能無明顯促進(jìn)作用。Heilmann等[14]在實驗中也有類似的發(fā)現(xiàn),低劑量OPN(100 ng/mL)可以增強人巨噬細(xì)胞吞噬E.coli的能力,而高劑量OPN(500 ng/mL)卻無此功能。本研究通過劃痕實驗造成IEC-6細(xì)胞損傷,在損傷修復(fù)過程中僅在OPN濃度為0.05 μg/mL時檢測到MPO的水平明顯增加,過低或過高OPN濃度干預(yù)組的MPO水平增加并不明顯。說明此時IEC-6細(xì)胞的炎性反應(yīng)可能有助于對抗損傷反應(yīng),有利于損傷修復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同濃度的OPN處理后,IEC-6細(xì)胞遷移功能增強,而在這些濃度的OPN作用下,IEC-6細(xì)胞的形態(tài)、貼壁率和增殖率均未見明顯變化。對于細(xì)胞增殖或分化影響的觀察時間往往需要1周、數(shù)周或更長時間,而我們的實驗尚未觀察這么長時間,已經(jīng)可以發(fā)現(xiàn)OPN能增強IEC-6細(xì)胞遷移的功能,提示OPN可能并非通過促進(jìn)細(xì)胞增殖或分化來促進(jìn)黏膜修復(fù),OPN在促進(jìn)受損腸上皮細(xì)胞早期重建中的主要機制可能為促進(jìn)細(xì)胞遷移能力。但隨著作用時間的延長,OPN是否會對IEC-6的增殖與分化產(chǎn)生影響,仍需進(jìn)一步研究。另外,IEC-6具有正常的未分化的腸上皮隱窩細(xì)胞的特征,因而廣泛用于腸上皮細(xì)胞損傷的相關(guān)研究。本研究僅就OPN對IEC-6細(xì)胞功能的影響進(jìn)行了研究,而OPN是否會對腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生同樣作用,仍需用消化系統(tǒng)其他細(xì)胞系或原代細(xì)胞分離的細(xì)胞來驗證。

綜上所述,OPN能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的移行功能,從而促進(jìn)損傷黏膜早期修復(fù),其機制可能與特定濃度的OPN能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ODC1蛋白的表達(dá)和損傷IEC-6細(xì)胞的炎性反應(yīng)有關(guān)。

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E-mail:cfy429@163.com

The effect of osteopontin on the biological characteristics of intestinal epithelial cells in rats

PAN Jie1, WANG Chen-xi2, LANG Yu-huang3, LIU Min2, YANG Li-ka2, CHEN Feng-yuan2△

(1Department of General Surgery,2Department of Gastroenterology,3Department of Emergency, Shanghai Fifth People’s Hospital,Fudan University,Shanghai 200240,China)

ObjectiveTo investigate the effect of osteopontin on rat intestinal epithelial cells differentiation,proliferation and migration.MethodsBy using phase contrast microscope,cell adhesion rate detection,MTT,scratch test,Western blot and ELISA,we observed the function of different concentrations of OPN on IEC-6 cells proliferation,differentiation and migration.Then we explored its possible mechanism from the difference on ornithine decarboxylase (ODC) expression and inflammation.ResultsThe morphology,adhesion rate and proliferation rate of IEC-6 cells had no significant change after treated with different concentrations of OPN.Interestingly,we found OPN could promote the migration of IEC-6 cell with higher concentrations.An appropriate concentration of OPN could promote the expression of ODC1 protein (0.1 μg/mL and 1.0 μg/mL OPN) and intracellular inflammation (0.05 μg/mL OPN) in IEC-6 cells.ConclusionsOPN could promote the migration of IEC-6 cells by promoting the expression of ODC1 proteins and inflammatory response.

osteopontin;intestinal epithelial cells;cell proliferation;cell migration;rat

Q291

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.012

2016-01-27;編輯:王蔚)

*This work was supported by Scientific Research Foundation of Health Bureau of Minhang District,Shanghai (2011MW01).

上海市閔行區(qū)衛(wèi)生局科研課題(2011MW01)