黃海霞　張明星　張　萌　盧　沖　彭　靖　李桂玲

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科-上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　上?！?00011)

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掌葉半夏提取物對(duì)宮頸癌荷瘤小鼠脾臟免疫的作用

黃海霞張明星張萌盧沖彭靖李桂玲△

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科-上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海200011)

目的觀察掌葉半夏提取物(Pinellia extracts,PE)對(duì)HPV+TC-1荷瘤小鼠T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。方法宮頸癌荷瘤小鼠建模后隨分成4組:機(jī)對(duì)照組(生理鹽水,0.2 mL/d，灌胃)、PE低劑量組(10 mg/kg, 0.2 mL/d，灌胃)、PE高劑量組(20 mg/kg,0.2 mL/d，灌胃)、CDDP組(4 mg/kg,0.2 mL/3 d,腹腔注射)。給藥期間測(cè)瘤、描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線，21天后處死小鼠并計(jì)算抑瘤率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟CD4+和CD8+T細(xì)細(xì)胞以及Th1、Th2、Treg和Th17亞群的比例。結(jié)果抑瘤率:CDDP組(29.82%)>PE高劑量組(21.73%)>PE低劑量組(8.23%);PE高劑量組和CDDP組CD4+和CD8+T細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組均顯著增多(P<0.01);PE兩組Th1比例顯著升高、Th2和Th17比例顯著下降(呈現(xiàn)劑量依賴性),Treg亞群分泌TGF-減少,而FOXP3水平增高。結(jié)論P(yáng)E能通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1型分化,抑制Th1/Th2漂移,改善Treg和Th17的比例,發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。

掌葉半夏提取物;宮頸癌;TC-1細(xì)胞株;細(xì)胞免疫

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤,且發(fā)病年齡逐漸年輕化,嚴(yán)重威脅女性的生命健康。研究表明高危型人乳頭瘤狀病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)是宮頸癌發(fā)生的最主要病因,其中大多數(shù)宮頸鱗癌與HPV16型感染有關(guān)。多數(shù)宮頸HPV感染可通過(guò)機(jī)體免疫應(yīng)答而被清除,但HR-HPV能夠通過(guò)不同方式逃避宿主的免疫識(shí)別,荷瘤機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制和免疫耐受,主要表現(xiàn)為脾臟內(nèi)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞比值下降[1-2]。因此,如何激活和增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng),使其特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),是目前腫瘤領(lǐng)域研究者關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。本研究重點(diǎn)關(guān)注掌葉半夏脂溶性提取物(Pinellia extracts,PE)對(duì)宮頸癌荷瘤小鼠的免疫學(xué)影響。CD4+T細(xì)胞是效應(yīng)T細(xì)胞的重要成分,根據(jù)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子和效應(yīng)細(xì)胞的生物功能特征,分為Th1、Th2、Treg和Th17亞群。本研究選用IFN-和T-bet代表Th1、IL-4,GATA3代表Th2、IL-17,RoRt代表Th17[3],TGF-和FOXP3代表調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)[4],通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析PE治療后荷瘤機(jī)體T細(xì)胞亞群的改變,推測(cè)PE能夠通過(guò)增強(qiáng)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)抑制宮頸癌的生長(zhǎng),為PE用于臨床宮頸病變的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)材料與試劑細(xì)胞株:TC-1細(xì)胞[HPV16 E6、E7和ras基因共轉(zhuǎn)化的C57BL/C(H-2b)小鼠肺上皮細(xì)胞]由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。動(dòng)物:6周齡雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2012-0002,飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部(SPF級(jí))。藥物:PE由中科院上海藥物所天然藥化研究室贈(zèng)送,用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO,美國(guó)Sigma公司,D-2650)溶解后稀釋于無(wú)菌生理鹽水中,現(xiàn)配現(xiàn)用;順鉑[cis-diamineplatinum(II) dichloride,CDDP,美國(guó)Sigma-Aldrich公司,批號(hào):479306],無(wú)菌生理鹽水稀釋后用。主要耗材及試劑:超凈工作臺(tái)(香港Heal Force公司,safe-1200),二氧化碳培養(yǎng)箱(香港Heal Force公司,90/HF240),全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Bio-Rad公司,TC-10),微量電子天平(德國(guó)Sartorius公司,BSA224S),絕對(duì)原點(diǎn)游標(biāo)卡尺(桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司,型號(hào):111-101-40),Beckman流式細(xì)胞儀。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)、胎牛血清、胰蛋白酶、二抗(青-鏈霉素)均購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司。免疫熒光抗體:FITC鼠抗CD45,PerCP鼠抗CD4,APC鼠抗CD8,BV421鼠抗IFN-γ,APC鼠抗IL-4,PE鼠抗IL-17,BV421鼠抗TGF-β,PE-Texas鼠抗T-bet,Alexa Fluor?647鼠抗GATA3,PE 鼠抗RoR γt,BV421鼠抗FOXP3,Cell Activation Cocktail (含BFA),FOXP3 Fix/Perm 緩沖液(4x)均購(gòu)于北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。免疫組化抗體:鼠抗T-bet (ab91109)、兔抗GATA3 (ab199428)、兔抗RORgama (ab78007)和鼠抗Foxp3 (ab20034)均為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)取出凍存于-80 ℃冰箱中的宮頸癌TC-1細(xì)胞,快速?gòu)?fù)蘇后用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清+1%二抗)培養(yǎng),置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度孵箱常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞并常規(guī)傳代。

荷瘤小鼠建模、分組及藥物處理C57BL/6雌小鼠適應(yīng)環(huán)境7天后右側(cè)頸背部備皮,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TC-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后228×g離心3 min,用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液配置成1×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液,消毒備皮區(qū)后用1 mL注射器每只皮下接種0.2 mL。接種后6天瘤體直徑長(zhǎng)到約6 mm,隨機(jī)將其分成4組(8～10只/組)并藥物處理21天。陰性對(duì)照組:生理鹽水(NS)0.2 mL/d,灌胃;PE低劑量組:10 mg/kg,0.2 mL/d,灌胃;PE高劑量組:20 mg/kg,0.2 mL/d,灌胃;CDDP陽(yáng)性對(duì)照組:4 mg/kg,0.2 mL,3天腹腔注射1次。

觀測(cè)指標(biāo)給藥后每3天稱重1次,用以評(píng)估藥物毒性;每5天游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小,制繪腫瘤生長(zhǎng)曲線。計(jì)算腫瘤體積(mm3)=長(zhǎng)徑(mm)×短徑2(mm)/2。

給藥結(jié)束后,頸椎脫臼法處死小鼠,75%酒精消毒皮膚毛發(fā)10 mim,無(wú)菌操作下獲取小鼠完整的皮下移瘤和脾臟,冰上操作,腫瘤拍照、稱重并記錄,計(jì)算抑瘤率=(陰性對(duì)照組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/陰性對(duì)照組平均瘤重×100%。切取1/4瘤塊放入4%甲醛溶液固定后石蠟包埋,HE染色,2 μm連續(xù)切片,備用。

制備單細(xì)胞懸液每只小鼠脾臟獨(dú)立無(wú)菌操作,置于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清+1%二抗)中研碎,400目篩網(wǎng)過(guò)濾,細(xì)胞懸液329×g離心5 min后PBS洗滌2次,每份細(xì)胞調(diào)整濃度至6×106個(gè)/L后加入適量Cell Activation Cocktail,置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。

樣本檢測(cè)每個(gè)樣本平分3管(A、B、C),每組8個(gè)樣本,其余樣本用于建立空白對(duì)照管和單色熒光素對(duì)照管。PBS洗滌2次(228×g,5 min),按說(shuō)明書用量加入CD8/CD45/CD4抗體,混勻,4 ℃避光靜置30 min。PBS洗滌2次(228×g,5 min),加入適量FOXP3 Fix/Perm緩沖液(1×),混勻,室溫避光靜置30 min。PBS洗滌2次(228×g,5 min)。A、B組按說(shuō)明書用量分別加入IFN-γ/IL-17和IL-4/TGF-β抗體,4 ℃避光靜置30 min。C組繼續(xù)加入適量FOXP3 Fix/Perm緩沖液(1x),混勻,室溫避光20 min,PBS洗滌2次(228×g,5 min),按說(shuō)明書用量加入T-bet/GATA3/RoRγt/FOXP3抗體,混勻,4 ℃避光靜置30 min。PBS洗滌2次(228×g,5 min),用Beckman流式細(xì)胞儀檢測(cè)和Flowjo軟件分析。

免疫組化SP法烤片:60 ℃烤片2 h。脫蠟及水化:二甲苯10 min×2次,梯度濃度乙醇水化(100%乙醇2次,95%乙醇2次,75%乙醇1次,各5 min),PBS洗3 min×3次。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H2O2孵育10 min,PBS洗3 min×3次?？乖迯?fù):電磁爐0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)25 min。室溫自然冷卻,PBS洗3 min×3次。封閉:滴加封閉液室溫孵育20 min,甩干,不洗。一抗按說(shuō)明書稀釋后滴加,4 ℃過(guò)夜,次日室溫復(fù)溫1 h,PBS洗3 min×3次。滴加二抗,室溫孵育1h,PBS洗3 min×3次。光鏡下DAB顯色滿意后,自來(lái)水沖洗。蘇木精復(fù)染2 min,自來(lái)水沖洗1 min,1%鹽酸乙醇分化10 s,自來(lái)水沖洗2 min,冰水返藍(lán)2 min。封片:逆梯度濃度乙醇脫水后,二甲苯5 min×2次,中性樹膠封片。

結(jié)　　　果

小鼠成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)情況及抑瘤率小鼠在接種TC-1細(xì)胞懸液后5～7天即可見明顯皮下瘤結(jié)節(jié),成瘤率97.5% (39/40),結(jié)果顯示,用藥結(jié)束后各組小鼠移植瘤體積和離體瘤重量變化為:陰性對(duì)照組>PE低劑量組>PE高劑量組>CDDP組(圖1A、C),和陰性對(duì)照組比較,PE高劑量組和CDDP組抑瘤效果較好,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05。比較各組小鼠除瘤后凈重(給藥結(jié)束后小鼠體質(zhì)量-離體瘤重量)發(fā)現(xiàn),在統(tǒng)計(jì)學(xué)上CDDP組小鼠凈重較其余3組均顯著下降(P<0.01,圖 1B),推測(cè)與其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性有關(guān)。腫瘤抑制率比較(表1):CDDP組>PE高劑量組>PE低劑量組。

(1)vs.Control group, P <0.05;(2)vs.CDDP group, P <0.05.TIR:Tumor inhibitory rate.

各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的比例本實(shí)驗(yàn)小鼠接種TC-1細(xì)胞,藥物處理21天后檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn):陰性對(duì)照組

Th1、Th2、Treg和Th17的水平采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)T細(xì)胞亞群在各組中的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于陰性對(duì)照組,PE兩組Th1比例顯著升高、Th2和Th17比例顯著下降(呈現(xiàn)劑量依賴性),CDDP組Th1和Th2比例均顯著下降(P<0.01,圖 3、4)。但PE低劑量組和陰性對(duì)照組IFN-水平及PE低劑量組和PE高劑量組IL-4表達(dá)(圖 3)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相比于陰性對(duì)照組,在流式分析Treg亞群時(shí)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子TGF-和轉(zhuǎn)錄因子FoxP3水平變化趨勢(shì)不一致,提示該兩類指標(biāo)在抗腫瘤中的角色不同。各組間TGF-水平均數(shù)比較:CDDP組>陰性對(duì)照組>PE高劑量組>PE低劑量組,PE組和陰性對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但PE低劑量組相比CDDP組顯著低表達(dá)TGF-(P<0.05)。各組間FoxP3水平均數(shù)比較(圖 4):PE高劑量組>PE低劑量組>陰性對(duì)照組>CDDP組,相比陰性對(duì)照組和CDDP組,PE低劑量組和PE高劑量組均顯著高表達(dá)FoxP3 (P<0.01),呈現(xiàn)劑量依賴性。

A:Subcutaneous transplantation tumor growth curve;B:Weight challenge of the mice eliminated the tumor;C:Photograph of tumor node.vs.control group,(1)P <0.05,(2)P <0.01.

圖1各組小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況及體重變化

Fig 1Changes of tumor size and the weight of mice in different groups

Plot individual values indicated the total cellularity of T lymphocytes in mice′s sleepn from flow cytometer (A) and the proportions of CD4+ and CD8 +T cells,respectively (B,C)(n=8 for each group).(1)P <0.05,(2)P <0.01.

圖2各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的比例

Fig 2Proportions of T lymphocytes in mice′s spleen of different groups

Flow cytometer analyzing the expression of cytokines as IFN-(represented Th1 subset),IL-4 (represented Th2 subset),TGF-β (represented Treg subset) and IL-17 (represented Th17 subset) in CD4+ T cell of the mice′s spleen in different groups.(1)P <0.05,(2)P <0.01.

圖3給藥后IFN-、IL-4、TGF-和 IL-17水平比較

Fig 3Comparison of IFN-γ,IL-4,TGF-β and IL-17 levels after administration

Flow cytometer analyzing the expression of cytokines as T-bet (represented Th1 subset),GATA3 (represented Th2 subset),RoRγt (represented Th17 subset) and Foxp3 (represented Treg subset) in CD4+ T cell of the mice′s spleen in different groups.(1)P <0.01.

圖4給藥后T-bet、GATA3、RoRγt和Foxp3水平比較

Fig 4Comparison of T-bet,GATA3,RoRγt and Foxp3 levels after administration

病理形態(tài)學(xué)變化HE染色顯示(圖5)小鼠荷瘤后脾臟形態(tài)破壞、白髓區(qū)淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)不清，PE低劑量組、PE高劑量組和CDDP組脾臟形態(tài)逐漸恢復(fù),白髓區(qū)淋巴結(jié)形態(tài)逐漸清楚。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步提示(圖5),相比對(duì)照組,PE低劑量組和PE高劑量組T-bet表達(dá)顯著升高而GATA3表達(dá)明顯下降(均呈現(xiàn)劑量依賴性)，F(xiàn)oxP3和RORγt表達(dá)也顯著下降(P<0.05)。但是組間RORγt表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CDDP組T-bet表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，GATA3、FoxP3和RORγt變化趨勢(shì)同PE組(P<0.01)。

(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖5小鼠脾臟組織HE染色和免疫組化結(jié)果分析(×400)

Fig 5HE staining and immunohistochemical analysis of mice′s spleen (×400)

討　　　論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,在發(fā)展中國(guó)家每年宮頸癌新增病例約10萬(wàn),死亡人數(shù)約3萬(wàn),發(fā)病率和死亡率在婦科惡性腫瘤中均占據(jù)首位,且發(fā)病年齡逐漸年輕化,嚴(yán)重威脅女性的生命與健康[5]。研究已明確HPV是宮頸癌發(fā)生的主要病因,宮頸鱗癌多與HPV16型相關(guān)。多數(shù)宮頸 HPV 感染可通過(guò)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答而被清除,但免疫缺陷是高危型HPV感染持續(xù)存在的重要特點(diǎn),在某些情況下,HPV(+)腫瘤能夠通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊,如腫瘤細(xì)胞免疫原性下降、產(chǎn)生血清封閉因子、CD4/CD8 倒置、Th1/Th2 漂移、分泌免疫抑制因子等[6]。以宮頸癌疫苗為代表的免疫治療雖然正在進(jìn)行臨床前或臨床試驗(yàn),但現(xiàn)階段疫苗的發(fā)展仍面臨著一些挑戰(zhàn):腫瘤治療性疫苗的作用機(jī)制不同于細(xì)胞毒藥物,其特殊之處在于誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)須經(jīng)一定的時(shí)間,才能轉(zhuǎn)化為臨床效應(yīng);并且復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者通常都接受了多輪治療,可能影響免疫系統(tǒng),降低疫苗療效[7];其次,Treg產(chǎn)生的免疫抑制[8]也是目前宮頸癌免疫治療面臨的瓶頸,使得宮頸癌疫苗在最初臨床試驗(yàn)中未獲得預(yù)想結(jié)果。此外,如何提高疫苗的安全性和免疫原性等問題也是HPV 治療性疫苗上市之前亟待解決的問題。

因此,尋找一種能安全有效防治女性宮頸病變的純中藥制劑,是現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)中藥領(lǐng)域的迫切任務(wù)。掌葉半夏,即虎掌(Pinellia pedatisecta Schot),天南星科半夏屬植物,取塊莖干燥入藥,主要分布于河北和長(zhǎng)江流域及西南各地。20世紀(jì)70年代,復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院率先開展掌葉半夏在宮頸癌治療方面的臨床研究,證實(shí)其抑瘤效果確切,且未發(fā)現(xiàn)毒性作用和不良反應(yīng)[9]。隨后,本課題組研究PE在體外抑制宮頸癌細(xì)胞株增加的作用及機(jī)制,證實(shí)PE可以通過(guò)抑制ERK磷酸化、抑制Bcl-2和PCNA的表達(dá)、抑制病毒癌基因E6的表達(dá)、上調(diào)抑癌基因P53的表達(dá)等途徑來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞株CaSki和HeLa的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本課題組進(jìn)一步證實(shí)PE能夠抑制CaSki裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),推薦灌胃途徑作為體內(nèi)試驗(yàn)最佳給藥方式[11]。

本研究關(guān)注PE對(duì)正常免疫功能荷瘤小鼠體內(nèi)免疫的影響。實(shí)驗(yàn)選用宮頸癌TC-1細(xì)胞株種植于野生型C57BL/6小鼠右側(cè)頸背部皮下,建立正常免疫功能荷瘤小鼠模型,用于模擬正常機(jī)體患HPV(+)腫瘤后免疫功能狀態(tài)的改變。由于中藥的抗腫瘤或免疫作用與劑量有關(guān),對(duì)不同動(dòng)物不同瘤株的抗腫瘤作用也不同,只有在最佳劑量和最佳給藥時(shí)間,才顯示出明顯活性。因此,本研究設(shè)立高低不同劑量的實(shí)驗(yàn)組,成瘤后給藥21天。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組比較,PE高劑量組能夠較好地延緩小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng),PE高劑量組抑瘤率僅次于CDDP組。CDDP組用藥后小鼠體質(zhì)量明顯下降,這可能與其作用機(jī)制有關(guān):CDDP屬細(xì)胞周期非特異性藥物,具有細(xì)胞毒性,可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程,并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)。本研究還發(fā)現(xiàn)PE能增強(qiáng)小鼠脾臟T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的浸潤(rùn),提示PE能夠增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫在抗腫瘤中的關(guān)鍵作用。在宿主體內(nèi)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫和體液免疫的綜合結(jié)果,但細(xì)胞免疫是抗腫瘤的主力。CD8+CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是腫瘤免疫的主力,CD4+T細(xì)胞主要通過(guò)Thl亞群輔助CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化,也可通過(guò)分泌IL-4為主的Th2亞群介導(dǎo)抗胞外感染的體液免疫反應(yīng),在多種炎癥性疾病、免疫性疾病、腫瘤性疾病等的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[12]。CD4-T細(xì)胞亞群新成員Th17,特征性分泌IL-17、表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子RoRγt,具有強(qiáng)大的促炎作用[13]。Treg分泌抑制性細(xì)胞因子——轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-),特征性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3,有著強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用,介導(dǎo)外周免疫耐受,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[14]。

在HPV感染階段,Th1/Th2、Th17/Treg比值保持動(dòng)態(tài)平衡;在子宮頸上皮內(nèi)瘤變階段,開始出現(xiàn)Th1/Th2、Th17/Treg的平衡失調(diào),并隨著疾病進(jìn)展,失衡加重;在浸潤(rùn)性宮頸癌階段,機(jī)體內(nèi)存在顯著的免疫失衡,具體表現(xiàn)為:宮頸癌患者外周血中Th1水平明顯降低,Th2比率上升,Th17、Treg比例上調(diào),并隨著疾病進(jìn)展逐步積聚[15-16]。而本研究發(fā)現(xiàn),PE可誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞向分泌IFN-的Th1型分化,降低分泌特征性IL-4的Th1型細(xì)胞比例,改善Th1/Th2之間的平衡,同時(shí)改善Treg和Th17比例,使Th17細(xì)胞分泌IL-17減少、下調(diào)特異性轉(zhuǎn)錄因子RoRt;抑制Treg分泌細(xì)胞因子TGF-、下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示PE上調(diào)小鼠脾臟細(xì)胞內(nèi)Foxp3水平。眾所周知,Foxp3是外周血CD4+CD25+Treg的特異性標(biāo)志,其在Treg的分化發(fā)育及其介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但近年來(lái)發(fā)現(xiàn),腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的Foxp3+T細(xì)胞在不同種類的癌癥中表現(xiàn)不同,有研究表明其與肝細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān),但能提示結(jié)直腸癌良好預(yù)后[17]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,Foxp3還表達(dá)于腫瘤細(xì)胞及部分正常組織細(xì)胞中,并發(fā)揮抑制腫瘤作用[18]。因此,對(duì)于在移植瘤體內(nèi)Foxp3表達(dá)變化趨勢(shì)對(duì)宮頸癌預(yù)后的影響,還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。綜上所述,本研究證實(shí)PE能夠通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1型分化,抑制Th2型分化,在一定程度上改善Treg和Th17的比例,使其在抗腫瘤免疫中更好的發(fā)揮應(yīng)答反應(yīng),為掌葉半夏在宮頸癌的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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E-mail:fckzxy@126.com

Effects of Pinellia extracts on immune responds of spleen in cervical cancer-bearing mice

HUANG Hai-xia, ZHANG Ming-xing, ZHANG Meng, LU Chong, PENG Jing, LI Gui-ling△

(Department of Integrated Traditional and Western Medicine,Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University- Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo observe the role of Pinellia extracts (PE) in T cells immune response of the C57BL/6 mice bearing HPV+TC-1 tumor.MethodsAfter randomization and administration in cervical cancer-bearing mice,tumor volume was calculated and the growth of tumor was completed.After transplanting subcutaneous tumor,the mice were randomly divided into 4 groups: control group (normal saline,0.2 mL/d, gavage), PE-low group (10 mg/kg,0.2 mL/d,gavage),PE-high group (20 mg/kg,0.2 mL/d,gavage),and CDDP group (4 mg/kg,0.2 mL/3d,peritoneal injection).Besides,the jobs of calculating the volume of the tumors and drawing tumor growth curve were done.The tumor inhibitory rate was calculated after continuous dosing for 21 days,and the percentages of CD4+,CD8+ T cells and Th1,Th2,Treg and Th17 subgroup in the spleen was detected by flow cytometry.ResultsThe order of tumor inhibitory rate was:CDDP group (29.82%)>PE high dose group (21.73%)>PE low dose group (8.23%).Compared with control group,the percentage of CD4+ and CD8+ T cells of PE high dose group and CDDP group were significantly increased (P< 0.01).In both PE groups,the proportions of Th1 and Th17 were significantly increased,while Th2 significantly decreased (in dose-dependent manner).Treg subsets secreted less TGF-β,while FoxP3 level increased.ConclusionsThrough inducing the differentiation of CD4 + T cells to Th1 model,inhibiting the drift of Th1/Th2 and regulating the proportion of Treg and Th17,PE could play an important role in anti-tumor immunity.

pinellia extract fraction;cervical cancer;TC-1 cell line;cellular immunity

R711.74, R737.33

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.005

2016-03-29;編輯:王蔚)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (8137386) and the Key Project of Shanghai Municipal Health Bureau (2013).

國(guó)家自然科學(xué)基金(8137386);上海市衛(wèi)生局重點(diǎn)項(xiàng)目(2013)