趙洪波　李瑞霞　張　煒

(上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院　上?！?00011)

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人絨毛膜促性腺激素通過(guò)上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子-1介導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞胎盤生長(zhǎng)因子分泌

趙洪波▲ △李瑞霞▲張煒

(上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院上海200011)

目的研究人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子-1(glial cell missing 1,Gcm-1)表達(dá)及胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor,PIGF)分泌的調(diào)控。方法人絨毛膜癌細(xì)胞株Bewo經(jīng)不同劑量HCG處理后,以實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot法分析檢測(cè)Gcm-1的表達(dá),以ELISA方法測(cè)定PIGF分泌。通過(guò)干擾小RNA下調(diào)人滋養(yǎng)細(xì)胞Gcm-1表達(dá),觀察其對(duì)HCG調(diào)控PIGF分泌的影響。結(jié)果HCG以劑量依賴的方式促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞Gcm-1表達(dá)及PIGF分泌,而HCG誘導(dǎo)PIGF分泌則由Gcm-1介導(dǎo)。結(jié)論HCG通過(guò)上調(diào)Gcm-1表達(dá)促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF分泌,提示HCG可能是一種對(duì)妊高征具有保護(hù)作用的因子。

人絨毛膜促性腺激素;滋養(yǎng)細(xì)胞;膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子-1;胎盤生長(zhǎng)因子

妊娠高血壓綜合征,簡(jiǎn)稱妊高征,是妊娠20周后出現(xiàn)的高血壓、水腫、蛋白尿等癥狀的統(tǒng)稱。妊高征發(fā)病率約為5%～8%,是導(dǎo)致產(chǎn)婦與圍生兒死亡的重要原因之一[1]。然而,妊高征可能涉及的相關(guān)分子機(jī)制目前并不完全清楚[2-4]。膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子-1 (glial cell missing 1,Gcm-1)是主要在胎盤組織表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,妊高征孕婦胎盤Gcm-1表達(dá)顯著下降,提示Gcm-1的表達(dá)下降與妊高征發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。Gcm-1調(diào)控包括胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor,PIGF)在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的水平[5]。而PIGF與早孕期胎盤血管形成密切相關(guān),妊高征孕婦PIGF的水平較正常孕婦顯著下降,且PIGF水平越低妊高征孕婦癥狀愈嚴(yán)重,而恢復(fù)PIGF水平則顯著緩解妊高征孕婦的癥狀,提示恢復(fù)PIGF水平可能是妊高征重要的治療措施[5,7-9]。

近期有研究發(fā)現(xiàn),人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)以正反饋的方式促進(jìn)Gcm-1基因表達(dá)[10],然而HCG是否通過(guò)Gcm-1調(diào)控PIGF水平目前并無(wú)報(bào)道及深入研究。 因此本文擬利用人滋養(yǎng)細(xì)胞株分析HCG對(duì)PIGF基因的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制,從而為提出妊高征治療策略提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

細(xì)胞培養(yǎng)人絨毛膜癌細(xì)胞株Bewo購(gòu)自美國(guó)美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞培養(yǎng)使用加入青霉素和鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F12 培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司,中國(guó)杭州吉諾生物技術(shù)有限公司分裝)。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱,每2～3天換液一次。細(xì)胞傳代使用0.25 %胰蛋白酶消化,按1∶3或1∶4的細(xì)胞比例傳代。

試劑PIGF細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司;HCG購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;人Gcm-1小干擾RNA(siRNA):5′-AACTCCCGCA-TCCTCAAGAAG-3′和5′-AACCTACAGTAGTG-GAG-ACCT-3′,非特異干擾siRNA (NS siRNA):5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。小鼠抗人Gcm-1抗體購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司,使用濃度按1∶1 000稀釋。小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,使用濃度按1∶2 000稀釋。標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自上海康成生物公司。

RNA抽提及實(shí)時(shí)定量RT-PCRBewo細(xì)胞經(jīng)HCG處理48 h后加入TRIzol裂解液(美國(guó)Invitrogen 公司),靜置5 min后于4 ℃下12 000×g離心10 min(下同),上清中加入氯仿,充分混勻后離心,轉(zhuǎn)移水相至離心管加入等體積異丙醇,離心后取沉淀并加入75%乙醇,再離心取沉淀于室溫靜置5 min,以使RNA沉淀充分干燥。用無(wú)菌水溶解抽提物的樣品濃度,測(cè)定在260 nm和280 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(D),確定RNA含量。取0.5 μg的RNA加入5 ×PrimeScriptTMRT Master Mix (實(shí)時(shí)定量PCR) 37 ℃下15 min,85 ℃下5 s,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)以上述的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用SYBR Premix Ex TaqII (實(shí)時(shí)定量PCR) 進(jìn)行定量PCR。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃ 30 s、72 ℃延伸45 s。Gcm-1及 GAPDH引物序列如下:Gcm-1正義鏈,5′-GCCATGCGCAAT-ACCAACAA-3′,Gcm-1反義鏈,5′-TCACAGTTGGGACAG-CGTTT-3′;GAPDH正義鏈,5′-GCCGCTTC-TTCTCGTGCAG-3′,GAPDH反義鏈,5′-ATGGATCATTGATGGC-GACAACAT-3′。Gcm-1和GAPDH的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別是:144 bps和173 bps。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 (美國(guó)Invitrogen公司)試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞2×105個(gè)接種到6孔板中,培養(yǎng)24 h 以使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)到30%～50%。分別平行配制轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine的無(wú)血清DMEM/Ham’s F12稀釋液(每孔250 μL無(wú)血清DMEM/Ham’s F12和10 μL Lipofectamine)和重組質(zhì)粒的無(wú)血清稀釋液(在250 μL無(wú)血清DMEM/Ham′s F12中加入4 μg siRNA),室溫靜置,5 min內(nèi)混合上述兩管液體,室溫靜置20 min形成DNA-Lipofectamine復(fù)合物,并將DNA-Lipofectamine復(fù)合物加入培養(yǎng)細(xì)胞中。37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 h后,更換新鮮培液。轉(zhuǎn)染48 h,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot蛋白質(zhì)印跡及ELISA測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

ELISA測(cè)定Bewo細(xì)胞接種于6孔板,以無(wú)血清培養(yǎng)液處理8 h,隨后加入HCG或轉(zhuǎn)染小干擾RNA處理48 h,取上清離心后儲(chǔ)存于-80 ℃。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書對(duì)上清PIGF進(jìn)行檢測(cè),具體操作如下:根據(jù)待測(cè)樣品量,截取相應(yīng)酶標(biāo)板孔數(shù),每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μL及樣品稀釋液100 μL,室溫孵育2 h,以400 μL洗滌液洗滌3次,每孔加入PIGF抗體工作液(PIGF conjugate) 200 μL,室溫孵育1 h。再次以400 μL洗滌液洗滌3次,每孔加入200 μL新鮮配置的底物溶液,室溫避光孵育30 min,加入反應(yīng)終止液50 μL。搖勻后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值(D),計(jì)算培養(yǎng)上清中PIGF的濃度。

Western blot法取2×106個(gè)細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,以預(yù)冷的PBS洗滌,加入相應(yīng)體積的蛋白質(zhì)裂解液,冰上放置30 min。然后以刮棒刮下細(xì)胞,收集到1.5 mL的離心管中。加入上述蛋白質(zhì)裂解液后沸水浴10 min,然后于4 ℃下12 000×g離心10 min。取上清,用蛋白質(zhì)定量試劑盒(K3001-BCA,上海申能博采生物有限公司)進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量。根據(jù)測(cè)定的總蛋白質(zhì)濃度,對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別取50 μg總蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)及內(nèi)參蛋白質(zhì)GAPDH的表達(dá)檢測(cè),檢測(cè)內(nèi)參蛋白質(zhì)的目的是確保每個(gè)樣品孔上樣的總蛋白質(zhì)樣品量一致,以進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較。上述50 μg總蛋白質(zhì)樣品分別加入相應(yīng)體積 β-巰基乙醇及1× SDS上樣緩沖液,于100 ℃變性10 min,繼而10 000×g離心5 min,取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌,加入相應(yīng)二抗,室溫放置1 h,用增強(qiáng)型化學(xué)超敏發(fā)光液(天根生化科技有限公司)在暗室中壓片曝光,顯影定影后膠片保存。

結(jié)　　　果

HCG以劑量依賴方式促進(jìn) Gcm-1基因表達(dá)為了分析不同劑量HCG對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞Gcm-1表達(dá)的影響,在用不同濃度HCG處理人滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后,以實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blot分別鑒定在mRNA及蛋白質(zhì)水平的Gcm-1基因表達(dá)。人滋養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)HCG處理48 h后,Gcm-1的mRNA水平隨著HCG處理濃度增加而增高(圖1A);Gcm-1蛋白質(zhì)水平上調(diào)也呈現(xiàn)HCG劑量依賴關(guān)系,提示HCG能以劑量依賴的方式上調(diào)Gcm-1基因表達(dá)(圖1B)。

A:mRNA level of Gcm-1;B:Protein level of Gcm-1.GAPDH is the loading control in Western blot.

圖1不同濃度HCG對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞Gcm-1基因表達(dá)的影響

Fig 1The influence of different HCG concentration on Gcm-1 gene expression in human trophoblast cells

HCG以劑量依賴方式促進(jìn)PIGF分泌為了分析不同劑量HCG對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF表達(dá)的影響,用不同濃度的HCG處理人滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清被收集用于ELISA檢測(cè)。PIGF水平隨著HCG處理濃度的增加而提高,證實(shí)HCG以劑量依賴的方式促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF分泌(圖2)。

Gcm-1 介導(dǎo)HCG促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF分泌以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HCG可促進(jìn)Gcm-1基因表達(dá)和PIGF分泌,已知Gcm-1是調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞增殖及分化的重要轉(zhuǎn)錄因子,其可調(diào)控PIGF的表達(dá)[5]。為了驗(yàn)證HCG是否通過(guò)Gcm-1來(lái)介導(dǎo)PIGF分泌,本研究增加了用HCG、Gcm-1 siRNA同時(shí)(或)單獨(dú)處理人滋養(yǎng)細(xì)胞的6組實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCG及Gcm-1 siRNA同時(shí)處理組(圖 3A,Lane 5)與HCG單獨(dú)處理組(圖3A,Lane 4)相比,Gcm-1 siRNA顯著抑制HCG對(duì)于Gcm-1表達(dá)的促進(jìn)作用(圖3A)。采用HCG及Gcm-1 siRNA同時(shí)處理人滋養(yǎng)細(xì)胞后,HCG單獨(dú)處理組(圖3B,Lane 4)與HCG及Gcm-1 siRNA同時(shí)處理組(圖3B,Lane 5)相比,PIGF分泌的抑制率約為45%(圖3 B)。與HCG單獨(dú)處理組相比,HCG及對(duì)照siRNA(NS siRNA)同時(shí)處理組并不影響HCG介導(dǎo)的Gcm-1的表達(dá)(圖3A Lane 6)及PIGF的分泌(圖3 B,Lane 6),提示HCG促進(jìn)PIGF的分泌確實(shí)由Gcm-1介導(dǎo)。

圖2不同濃度HCG對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF分泌的影響

Fig 2The effect of different HCG concentration on PIGF secretion in human trophoblast cells

A:Gcm-1 siRNA inhibits HCG-induced PIGF secretion;B:Gcm-1 siRNA inhibits HCG-induced Gcm-1 gene expression.GAPDH is the loading control in Western blot.

圖3Gcm-1介導(dǎo)HCG促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF分泌

Fig 3Gcm-1 mediates HCG-induced PIGF secretion in human trophoblast cells

討　　　論

Gcm-1是主要在胎盤組織表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,其主要調(diào)控下游靶基因合胞素(syncytin)、PIGF及高溫需求蛋白A4(high-temperature requirement protein A4,HtrA4)表達(dá),參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、融合(fusion)及分化[5,11-12]。妊高征孕婦胎盤Gcm-1基因表達(dá)顯著下降、并表現(xiàn)出滋養(yǎng)細(xì)胞融合障礙及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞分化異常,提示Gcm-1的表達(dá)下降與妊高征發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。

PIGF作為Gcm-1的靶基因,主要參與滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮血管系統(tǒng)重鑄,妊高征孕婦與正常孕婦相比血清PIGF顯著下降,且下降水平越低,妊高征癥狀愈重,提示PIGF水平下降是妊高征關(guān)鍵致病因素之一[5,7-8]。已有研究證實(shí),妊高征患者PIGF降低的主要原因是可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt1)水平過(guò)度升高[13]。sFlt1雖然保持與配體PIGF結(jié)合的能力,但缺乏跨膜區(qū)和酪氨酸激酶活性。因此,過(guò)量sFlt1與游離的PIGF結(jié)合并拮抗PIGF促胎盤血管形成的能力,導(dǎo)致妊高征的發(fā)生[13]。根據(jù)孕婦血清sFlt1/PIGF比值可以有效預(yù)測(cè)短期內(nèi)妊高征的發(fā)生及嚴(yán)重程度[8,14-15];而體外分離去除血清sFlt1可以有效恢復(fù)血清PIGF的水平,明顯緩解妊高征的癥狀[9]。這些研究提示,恢復(fù)PIGF表達(dá)水平可能有助于妊高征的預(yù)防與治療。

HCG是臨床常用的促排卵及促黃體功能制劑,孕期可以安全應(yīng)用。前期研究發(fā)現(xiàn),HCG以正反饋的方式促進(jìn)Gcm-1的表達(dá)[10],而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Gcm-1活化后可促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞PIGF表達(dá)[5]。在此基礎(chǔ)上,本文利用人滋養(yǎng)細(xì)胞系,研究發(fā)現(xiàn)HCG通過(guò)上調(diào)Gcm-1表達(dá)促進(jìn)PIGF分泌,提示早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的HCG可能通過(guò)促進(jìn)PIGF表達(dá)參與妊娠早期胎盤血管重鑄。鑒于PIGF水平恢復(fù)可以很大程度上緩解妊高征的癥狀,因此HCG可能對(duì)妊高征發(fā)生發(fā)揮保護(hù)作用,并有可能成為潛在的治療手段。此外,妊高征目前并無(wú)有效的預(yù)防措施,某些妊高征高危孕婦在早孕期接受一定劑量的重組HCG以提高血清PIGF水平,這可能有助于緩解妊高征高危孕婦的癥狀,發(fā)揮一定的預(yù)防作用。HCG的這些可能的臨床應(yīng)用仍需要大量深入的研究工作驗(yàn)證。深入研究HCG對(duì)PIGF調(diào)控的分子機(jī)制,可能拓展HCG的臨床應(yīng)用,為妊高征探尋新的預(yù)防及治療策略。

[1]MOL BW,ROBERTS CT,THANGARATINAM S,et al.Pre-eclampsia[J].Lancet,2016,387(10022):999-1011.

[2]HERNANDEZ-DIAZ S,TOH S,Cnattingius S.Risk of pre-eclampsia in first and subsequent pregnancies:prospective cohort study[J].BMJ,2009,338:b2255.

[3]ILEKIS JV,REDDY UM,ROBERTS JM.Preeclampsia—a pressing problem:an executive summary of a National Institute of Child Health and Human Development workshop[J].Reprod Sci,2007,14(6):508-523.

[4]RANA S,KARUMANCHI SA,LINDHEIMER MD.Angiogenic factors in diagnosis,management,and research in preeclampsia[J].Hypertension,2014,63(2):198-202.

[5]CHANG M,MUKHERIEA D,GOBBLE RM,et al.Glial cell missing 1 regulates placental growth factor (PGF) gene transcription in human trophoblast[J].Biol Reprod,2008,78(5):841-851.

[6]CHEN CP,CHEN CY,YANG YC,et al.Decreased placental GCM1 (glial cells missing) gene expression in preeclampsia[J].Placenta,2004,25(5):413-421.

[7]KNUTH A,LIU L,NIELSEN H,et al.Placenta growth factor induces invasion and activates p70 during rapamycin treatment in trophoblast cells[J].Am J Reprod Immunol,2015,73(4):330-340.

[8]KURTOGLU E,AVCI B,KOKCU A,et al.Serum VEGF and PGF may be significant markers in prediction of severity of preeclampsia[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2016,29(12):1987-1992.

[9]THADHANI R,KISNER T,HAGMANN H,et al.Pilot study of extracorporeal removal of soluble fms-like tyrosine kinase 1 in preeclampsia[J].Circulation,2011,124(8):940-950.

[10]CHEONG ML,WANG LJ,CHUANG PY,et al.A positive feedback loop between Glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ Expression and cell differentiation[J].Mol Cell Biol,2015,36(1):197-209.

[11]BACZYK D,DREWLO S,PROCTOR L,et al.Glial cell missing-1 transcription factor is required for the differentiation of the human trophoblast[J].Cell Death Differ,2009,16(5):719-727.

[12]WANG LJ,CHEONG ML,LEE YS,et al.High-temperature requirement protein A4 (HtrA4) suppresses the fusogenic activity of syncytin-1 and promotes trophoblast invasion[J].Mol Cell Biol,2012,32(18):3707-3717.

[13]ROBERTS JM,RAJAKUMAR A.Preeclampsia and soluble fms-like tyrosine kinase 1[J].J Clin Endocrinol Metab,2009,94(7):2252-2254.

[14]ZEISLER H,LLURBA E,CHANTRAINE F,et al.Predictive value of the sFlt-1:PlGF ratio in women with suspected preeclampsia[J].N Engl J Med,2016,374(1):13-22.

[15]VERLOHREN S,HERRAIZ I,LAPAIRE O,et al.New gestational phase-specific cutoff values for the use of the soluble fms-like tyrosine kinase-1/placental growth factor ratio as a diagnostic test for preeclampsia[J].Hypertension,2014,63(2):346-352

E-mail:zhaohongbo01@sina.com

Human chorionic gonadotropin mediates the secretion of placental growth factor by promoting the expression of glial cell missing-1 gene in human trophoblast cells

ZHAO Hong-bo▲ △, LI Rui-xia▲, ZHANG Wei

(Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases-Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo study the regulation of human chorionic gonadotropin (HCG) on the expression of glial cell missing 1 (Gcm-1) gene and secretion of placental growth factor (PIGF) in human trophoblast cells.MethodsWe used realtime RT-PCR and Western blot assay to determine the mRNA and protein levels of Gcm-1,and used ELISA assay to detect PIGF secretion after human choriocarcinoma cells Bewo were treated with different doses of HCG.We applied small interfering RNA to knockdown Gcm-1 gene expression,and then observed the effect of Gcm-1 siRNA on HCG-inducing PIGF secretion.ResultsHCG promoted Gcm-1 gene expression and PIGF secretion in human trophoblast cells in a dose-dependent manner,and HCG-inducing PIGF secretion was mediated by Gcm-1.ConclusionsHCG promotes PIGF secretion by increasing the expression of Gcm-1 gene in human trophoblast cells,indicating that HCG may be a protective factor for preeclampsia.

human chorionic gonadotropin;trophoblast cells;glial cell missing 1;placental growth factor

R714.2

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.003

2016-03-14;編輯:張秀峰)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81571457) and Pujiang Talent Program of Shanghai,China (15PJ1400900).

國(guó)家自然科學(xué)基金(81571457);上海市浦江人才計(jì)劃(15PJ1400900)

▲ZHAO Hong-bo and LI Rui-xia contributed equally to the article.