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        13C輔助的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法精確分析畢赤酵母胞內(nèi)代謝物濃度

        2016-11-01 07:10:59郭孟磊劉曉云黃明志李敏超莊英萍張嗣良
        分析化學(xué) 2016年2期
        關(guān)鍵詞:畢赤胞內(nèi)代謝物

        郭孟磊 劉曉云 黃明志李敏超 儲(chǔ) 炬 莊英萍 張嗣良

        (華東理工大學(xué)國家生化工程技術(shù)研究中心(上海),上海 200237)

        13C輔助的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法精確分析畢赤酵母胞內(nèi)代謝物濃度

        郭孟磊 劉曉云 黃明志*李敏超 儲(chǔ) 炬 莊英萍 張嗣良

        (華東理工大學(xué)國家生化工程技術(shù)研究中心(上海),上海 200237)

        畢赤酵母作為一種高效的外源蛋白表達(dá)平臺(tái),其蛋白表達(dá)水平與胞內(nèi)代謝物濃度緊密相關(guān)。但胞內(nèi)代謝物種類多、物化性質(zhì)差異大、濃度低、周轉(zhuǎn)快,對其絕對濃度的精確檢測一直難于實(shí)現(xiàn)。本研究將超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法與13C同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,探索解決該難題的方法。首先,優(yōu)化了超高效液相色譜的操作條件,利用3種色譜柱實(shí)現(xiàn)了64種常見中間代謝物的分離;對三重四極桿質(zhì)譜儀的檢測離子對和碰撞電壓等操作條件進(jìn)行優(yōu)化,找到了對各種物質(zhì)具有專一性的檢測離子對。然后,利用全標(biāo)記13C標(biāo)記底物培養(yǎng)細(xì)胞,收集胞內(nèi)的全標(biāo)記代謝物用作定量內(nèi)標(biāo)物,建立了53種中間代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法不但精確性高,標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上,而且重現(xiàn)性好,受實(shí)驗(yàn)條件和儀器操作條件的影響很小。將本方法應(yīng)用于畢赤酵母胞內(nèi)代謝物濃度的絕對定量分析,成功獲得了胞內(nèi)各種代謝物的濃度水平,為后續(xù)深入研究畢赤酵母代謝調(diào)控機(jī)理,實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

        超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜;13C同位素標(biāo)記;代謝物濃度;畢赤酵母

        1 引言

        畢赤酵母是一種高效的蛋白表達(dá)平臺(tái),已用于1000多種外源蛋白的表達(dá),其表達(dá)水平與胞內(nèi)代謝物濃度緊密相關(guān)。掌握畢赤酵母胞內(nèi)中間代謝物的濃度信息對理解其代謝調(diào)控機(jī)理,實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效生產(chǎn)具有重要意義[1~4]。

        中間代謝物具有種類多、物化性質(zhì)差異大、濃度低和周轉(zhuǎn)快等特點(diǎn),色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已大量應(yīng)用于這些物質(zhì)的定性與定量分析。常用的質(zhì)譜定量方法包括氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)。氣相色譜不適于分離強(qiáng)極性代謝物,液相色譜-質(zhì)譜更適合于中間代謝物的定量分析[5,6],但其定量性能受到離子抑制效應(yīng)[7]和樣品前處理過程的影響。為彌補(bǔ)這些不足,Wu和Bennett[7,8]等提出同位素稀釋-質(zhì)譜定量法(簡稱IDMS),通過測量樣品的未標(biāo)記代謝物和作為內(nèi)標(biāo)的全標(biāo)記代謝物的比值實(shí)現(xiàn)定量分析[9]。

        IDMS已應(yīng)用于大腸桿菌和面包酵母等多個(gè)細(xì)胞體系[6,10]。已有研究者嘗試將其引入到畢赤酵母體系中,如Carnicer等[11]對比了5種淬滅方法的影響,發(fā)現(xiàn)溫度-27℃、甲醇含量60%時(shí)效果最好;Tredwell等[12]分析了不同提取方法的影響,指出沸乙醇提取方法具有優(yōu)越性;Jordà等[13]將其與非穩(wěn)態(tài)13C代謝通量分析技術(shù)相結(jié)合,探討了外源蛋白表達(dá)對畢赤酵母胞內(nèi)代謝的影響。盡管IDMS理論上是一種準(zhǔn)確度和精度較高的方法[7],仍有多種因素可能會(huì)影響其定量性能。畢赤酵母的代謝活性很強(qiáng),在定量分析其胞內(nèi)代謝物濃度時(shí),與傳統(tǒng)定量方法相比,有關(guān)IDMS方法的優(yōu)勢和不足尚缺乏深入研究。本研究優(yōu)化了LC-MS/MS檢測畢赤酵母胞內(nèi)代謝物的操作條件,建立各種代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線,評估IDMS方法在定量分析不同代謝物時(shí)具有的優(yōu)勢和不足,探討實(shí)現(xiàn)畢赤酵母胞內(nèi)代謝物濃度可靠檢測的方法。

        2 實(shí)驗(yàn)部分

        2.1 儀器與試劑

        超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(Thermo Fisher公司),ACQUITY UPLC?RBEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm,Waters公司);XselectTMHSS T3色譜柱(150 mm ×2.1 mm,3.5μm,Waters公司);XselectTMHSS T3色譜柱(100 mm ×2.1 mm,1.8μm);振蕩器(Thermo Fisher公司);移液器(GILSON公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(上海予華儀器設(shè)備有限公司);纖維濾膜(Millipore公司);pH計(jì)(Mettler Toledo公司)。

        標(biāo)準(zhǔn)品和甲酸、乙酸、二甲基己二胺、三丁胺、甲酸銨等試劑(Sigma公司);流動(dòng)相甲醇、異丙醇、乙腈、超純水(Fisher Chemical公司)。U13C葡萄糖(Cambridge Isotope Laboratories公司)。

        2.2 菌種和培養(yǎng)條件

        畢赤酵母β-半乳糖苷酶生產(chǎn)菌株GHL。培養(yǎng)基組成為葡萄糖20 g/L,MgSO4·7H2O 14.9 g/L,K2SO418.2 g/L,85%H3PO426.8 mL/L,無水Ca2SO40.93 g/L,KOH 4.13 g/L,消泡劑(1∶1000,V/V)。微量元素溶液(12∶1000,V/V)其中微量元素:KI 0.08 g/L,CuSO4·5H2O 6.0 g/L,MnSO4·H2O 3.0 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0 g/L,H2SO4(1∶200,V/V),NaMoO4·2H2O 0.2 g/L,CoCl20.5 g/L,ZnCl220.0 g/L,H3BO40.02 g/L,生物素0.2 g/L。培養(yǎng)條件:接種量10%,溫度30℃,pH 5.5,每升發(fā)酵液的通氣量1 L/min。

        13C全標(biāo)記菌體的培養(yǎng)采用U13C葡萄糖為唯一碳源,接種量1%,空氣中CO2用NaOH溶液除去,其它條件與上述相同。提取菌體胞內(nèi)代謝物檢測U13C代謝物所占比例,發(fā)現(xiàn)其中僅含有極微量的12C代謝物,不影響化合物濃度的定量分析。

        2.313C全標(biāo)菌體樣品的處理

        發(fā)酵結(jié)束后,將100 mL發(fā)酵液加入-20℃預(yù)冷的含有500 mL 60%甲醇的補(bǔ)料瓶中,攪拌混勻后分裝到30個(gè)試管中,每個(gè)試管20 mL,4℃,12000 r/min離心10 min,棄上清液。在試管加入70℃預(yù)熱的20 mL 75%乙醇,95℃保溫10 min。冷卻至室溫后,4℃、以12000 r/min離心10 min,取上清液,將30支試管中上清液混合后再分裝。

        2.4 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)樣品的處理

        樣品取出后直接放入27℃預(yù)冷的含有3 mL 60%甲醇的試管滅活[10],取樣量為1 mL。用0.8μm纖維濾膜過濾,去離子水清洗菌體;濾膜與菌體均加入70℃預(yù)熱的含有30 mL 75%乙醇的試管中,95℃保溫10 min,用于定量分析的樣品同時(shí)還加入100 μL內(nèi)標(biāo)。提取代謝物后將濾膜取出,4℃,以12000 r/min離心10 min,取上清液。上清液用快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后-80℃保存待測。

        2.5 色譜條件

        2.5.1 有機(jī)酸與磷酸糖類 采用 Acquity T3色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.8μm)。流動(dòng)相 A: 5 mmol/L三丁胺,15 mmol/L乙酸,5% 甲醇;流動(dòng)相B:異丙醇。柱溫:40℃。梯度洗脫:0~5 min,100%A;5~16 min,100%~91%A;16~19 min,91%~50%A;19~25 min,50%A;25~26 min,50%~100%A。流速0.2 mL/min。

        2.5.2 核苷酸類 采用XselectTMHSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)。流動(dòng)相A:5 mmol/L三丁胺,以甲酸調(diào)至pH 4.95;流動(dòng)相B:5 mmol/L三丁胺,100%ACN,0.5%甲酸。柱溫:40℃。梯度洗脫:0~30 min,100%~50%A。流速0.2 mL/min。

        2.5.3 氨基酸類 采用ACQUITY UPLCR BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)。流動(dòng)相A:5 mmol/L三丁胺,以甲酸調(diào)至pH 3.0;流動(dòng)相B:5 mmol/L三丁胺,85%ACN,0.5%甲酸。柱溫:40℃。梯度洗脫:0~30 min,100%~75%B。流速0.2 mL/min。

        2.6 質(zhì)譜條件

        氨基酸的檢測采用正離子模式:噴霧電壓3.5 kV,汽化溫度300℃,鞘氣壓15 psi,離子掃描氣壓0 psi,輔助氣壓10 psi,毛細(xì)管溫度300℃。

        有機(jī)酸、磷酸糖和核苷類物質(zhì)的檢測采用負(fù)離子模式:噴霧電壓 -3.0 kV,汽化溫度200℃,鞘氣壓15 psi,離子掃描氣壓0 psi,輔助氣壓10 psi,毛細(xì)管溫度200℃。

        2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

        分別采用傳統(tǒng)方法和IDMS方法進(jìn)行胞內(nèi)代謝物濃度的絕對定量分析。傳統(tǒng)方法只利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積之間的對應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用IDMS方法時(shí),將不同濃度梯度的化合物標(biāo)準(zhǔn)品(未標(biāo)記)與U13C內(nèi)標(biāo)按4∶1比例混合,根據(jù)未標(biāo)記代謝物與全標(biāo)記代謝物的峰面積比值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

        回收率(R)定義為:

        其中,ΔCm是添加已知濃度12C標(biāo)準(zhǔn)品后與添加前測定值之差,ΔC是理論上添加前后的差值,

        其中C0為未添加前代謝物濃度;V0為未添加前樣品體積;Ca和Va分別是添加標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和體積。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 色譜操作條件優(yōu)化

        胞內(nèi)有機(jī)酸、磷酸糖和核苷類物質(zhì)由于極性大,pKa值低,存在同分異構(gòu)體,使得對該類化合物的分離成為難題,而氨基酸類物質(zhì)極性差異大,pKa值范圍廣,也成為分離氨基酸的最大障礙。根據(jù)這3類物質(zhì)性質(zhì)的不同,首先利用選擇離子掃描模式[14]對色譜分離方法進(jìn)行了優(yōu)化,利用3根色譜柱有效分離了包括有機(jī)酸、磷酸糖、核苷類物質(zhì)和氨基酸在內(nèi)的64種常見胞內(nèi)代謝物(圖1~圖3)。質(zhì)譜通過質(zhì)荷比來鑒別化合物,但是不能區(qū)分同分異構(gòu)體,因此色譜分離至關(guān)重要,本研究有效分離了上述幾種化合物,尤其是實(shí)現(xiàn)了G6P、F6P、M6P等同分異構(gòu)體的分離,為更有效鑒別代謝物奠定了基礎(chǔ)。

        圖1 有機(jī)酸、磷酸糖選擇離子掃描總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of sugar phosphates and carboxylic acids

        3.2 質(zhì)譜儀操作條件優(yōu)化

        用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜操作條件優(yōu)化,獲得了64種代謝物的專一檢測離子對及最佳操作條件,如表1所示?;衔镌谂鲎渤刂邪l(fā)生電離,雖然不同的化合物電離方式不同,但相似化合物電離方式具有相似性,例如磷酸糖類化合物特征離子多為,有機(jī)酸類化合物以羧基為主,表1給出了所有化合物子離子分子式,為后續(xù)代謝物的檢測和合理選擇標(biāo)記化合物離子對提供了依據(jù)。

        圖2 核苷類物質(zhì)選擇離子掃描總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of nucleosides

        圖3 20種氨基酸物質(zhì)選擇離子掃描總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of 20 amino acids

        3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        從表2可見,對于大多數(shù)物質(zhì)而言,基于13C內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性系數(shù)要好于傳統(tǒng)的12C方法。但是部分物質(zhì),如CDP,SUC,OXA和部分氨基酸,13C方法所得的線性系數(shù)反而小于12C方法。究其原因,可能是這些物質(zhì)提取時(shí)在胞內(nèi)降解太快,可保留用作13C內(nèi)標(biāo)物的量較少,導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積的測定誤差變大,使得其線性系數(shù)反而變小,有些化合物的IDMS標(biāo)準(zhǔn)曲線甚至無法建立。

        理論上,標(biāo)記代謝物與未標(biāo)記代謝物具有色譜同一性,因此基于13C內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率只與該U13C代謝物在標(biāo)記細(xì)胞中的含量和稀釋比例有關(guān)。在進(jìn)樣量確定時(shí),兩者保持不變,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率就不會(huì)發(fā)生變化,因此該斜率不會(huì)隨儀器狀態(tài)和不同的分析樣品批次的變化而變化,而12C方法因缺少內(nèi)標(biāo)物,峰面積會(huì)發(fā)生一些變化,從而影響其斜率。為了驗(yàn)證,依照上述方法做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,連續(xù)測量4次,得到不同進(jìn)樣批次之間標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的變化情況(表3)。從表3可知,13C法標(biāo)準(zhǔn)曲線比12C法具有更好的穩(wěn)定性。

        表1 SIM檢測離子對Table 1 Ion pair of SIM

        續(xù)表1(Continued to Table 1)

        表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2值)Table 2 Correlation coefficients(R2values)of calibration lines

        表3 4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及其95%的置信區(qū)間Table 3 Slopes and their 95%confidences intervals in four LC-ESI-MS/MS runs

        3.4 回收率

        表4給出了部分化合物的回收率偏差,從回收率偏差上可以看出,IDMS方法回收率偏差小于傳統(tǒng)12C方法,證明本方法的優(yōu)越性和重要性。

        3.5 畢赤酵母胞內(nèi)代謝物定量分析結(jié)果

        不同菌株的細(xì)胞在不同生長狀態(tài)下其胞內(nèi)代謝物濃度存在一定的差異,但是對于特定種類生物而言,其胞內(nèi)代謝物濃度水平和細(xì)胞的容量具有相似性。將IDMS方法與傳統(tǒng)12C(Lac,Asp等)方法相結(jié)合,能更完整地測定畢赤酵母胞內(nèi)代謝物。圖4給出了畢赤酵母胞內(nèi)代謝物的定量結(jié)果,無論是胞內(nèi)各種代謝物的濃度水平,例如有機(jī)酸、磷酸糖(0.01~50μmol/g細(xì)胞干重(DCW))、核苷類物質(zhì)(0.01~10μmol/g DCW)、游離氨基酸(0.1~100μmol/g DCW),還是胞內(nèi)游離氨基酸的總量(378.02μmol/g DCW),或者不同氨基酸在畢赤酵母胞內(nèi)的百分含量,都與文獻(xiàn)[12,15,16]報(bào)道一致,說明了本定量方法的可靠性。

        表4 部分化合物的回收率偏差Table 4 The recovery deviation for some compounds

        圖4 畢赤酵母GHL胞內(nèi)代謝物濃度(μmol/g細(xì)胞干重)Fig.4 Intracellular metabolites concentration in Pichia pastoris GHL.Intracellular concentration of metabolites pools are given inμmol/g DCW

        4 結(jié)論

        比較了IDMS方法與傳統(tǒng)定量方法在畢赤酵母胞內(nèi)代謝物定量分析方面的優(yōu)劣,說明了IDMS方法的優(yōu)越性,但是也不能忽略傳統(tǒng)方法在測量可快速降解代謝物方面的作用,將兩者結(jié)合,將使得畢赤酵母胞內(nèi)代謝物的定量分析更加精確完整,為后續(xù)深入研究畢赤酵母代謝調(diào)控機(jī)理,實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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        13C-assisted Ultra-high Performance Liquid Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry Method for Precise Determination of Intracellular Metabolites in Pichia pastoris

        GUO Meng-Lei,LIU Xiao-Yun,HUANG Ming-Zhi* ,LI Min-Chao,CHU Ju,ZHUANG Ying-Ping,ZHANG Si-Liang
        ( National Engineering Research Center for Biotechnology ( Shanghai) ,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

        The yeast Pichia pastoris is an effective host for recombinant protein production and the recombinant protein production level is tightly related to the concentrations of intracellular metabolites.The intracellular metabolites have the features of wide range of types,distinct variation in physical and chemical properties,rapid turning-over and low concentration,so it is difficult to quantify their concentrations precisely.In this experiment,we tried to make it possible by combining ultra-high performance liquidchromatography(UPLC)-triple quadrupole mass spectrometry and13C isotope labeling techniques.64 metabolites including organic acids,sugar phosphate,nucleoside substance,amino acid were successfully separated by UPLC with three kinds of chromatography column.The appropriate and unique ion pairs and collision voltages were found after the mass spectrometry condition optimization.By using the U13C metabolites as internal standards collected from the cells growing on U13C-glucose as sole carbon source,the standard curves of 53 metabolites were established.The results showed that the method presented here had a high accuracy.The correlation coefficients were above 0.99.The method also had a good reproducibility,and the influence of experimental and equipment operating condition was very small.Reliable and accurate determination of the concentrations of intracellular metabolites in Pichia pastoris was obtained.The works lays the foundation for comprehensive regulation mechanism research and efficient recombinant protein production in Pichia pastoris.

        Ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry;Carbon-13 isotope labeling;Absolute quantification of intermediate metabolites concentration;Pichia pastoris

        10 August 2015;accepted 29 October 2015)

        10.11895/j.issn.0253-3820.150635

        2015-08-10收稿;2015-10-29接受

        *E-mail:249533969@qq.com

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