殷勤 羅火林 劉星星 黃學(xué)勇 羅麗萍

（南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330031）

基于表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速評(píng)價(jià)咖啡種子活力

殷勤 羅火林 劉星星 黃學(xué)勇 羅麗萍*

（南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330031）

為快速、無(wú)損地區(qū)分不同活力的咖啡種子，采用自行研制的表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜（DAPCIMS），在無(wú)需樣品預(yù)處理的前提下，獲得咖啡種子表面的化學(xué)指紋圖譜，并分別進(jìn)行了主成分分析（PCA）、聚類分析（CA）和判別分析（DA），獲得不同活力的咖啡種子樣品的質(zhì)譜信息特征。結(jié)果表明，在正離子模式下，DAPCI-MS結(jié)合多變量分析方法能有效區(qū)分不同活力的咖啡種子。PCA提取了3個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到92.2%；CA可以將相同活力的咖啡種子聚在一起，準(zhǔn)確率為100%；DA對(duì)訓(xùn)練樣本的回判正確率為100%，交叉驗(yàn)證分析成功率為100%，對(duì)外部驗(yàn)證樣本進(jìn)行DA，正確率95.7%。本方法具有無(wú)需樣品預(yù)處理，分析速度快，靈敏度高，對(duì)種子無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，能為其它種子活力測(cè)定提供參考。

表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜；咖啡；種子活力；多變量分析

1 引言

種子活力（Seed vigor）是指在廣泛田間條件下，決定種子迅速整齊出苗和長(zhǎng)成正常幼苗的潛在能力的種子特性，是衡量種子質(zhì)量高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的種子活力測(cè)定方法存在檢測(cè)速度慢、具有破壞性、預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜等問(wèn)題，因此快速、準(zhǔn)確和無(wú)損傷測(cè)定成為當(dāng)前種子活力測(cè)定方法的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)。表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜（Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry，DAPCI-MS）可在常溫、常壓和未經(jīng)樣品預(yù)處理的前提下對(duì)樣品表面進(jìn)行直接分析［1～3］。Chen等［4］采用DAPCI-MS對(duì)茶葉樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，成功區(qū)分了40種茶葉樣品。Wu等［5］采用DAPCI-MS對(duì)干海參樣品進(jìn)行檢測(cè)，成功區(qū)分了不同生境下的干海參樣品。羅麗萍等［6］采用DAPCI-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了新鮮和陳年蓮子的快速鑒別。

咖啡（Coffee arabica L.）屬于茜草科（Rubiaceae）咖啡（Coffee）屬植物，有103種［7］?？Х确N子在常溫下最多能儲(chǔ)存2～6個(gè)月，之后活力會(huì)迅速喪失，嚴(yán)重影響咖啡的生產(chǎn)效益和種質(zhì)資源保存［8］。目前，咖啡種子研究主要集中于其收獲后加工方法對(duì)咖啡風(fēng)味的影響、咖啡中的化學(xué)成分及其結(jié)構(gòu)、不同基因型咖啡的鑒別等方面，而對(duì)咖啡種子活力測(cè)定方法的研究較少。

本研究采用DAPCI-MS對(duì)不同活力的咖啡種子表面直接進(jìn)行檢測(cè)，獲得其DAPCI-MS指紋圖譜，結(jié)合多變量分析，對(duì)不同活力的咖啡種子進(jìn)行分析，建立了咖啡種子快速、無(wú)損、靈敏的活力檢測(cè)方法，為咖啡種子的貯藏及種質(zhì)資源的保存和定時(shí)更新繁殖提供參考依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

DAPCI離子源（東華理工大學(xué)研制）；線性離子阱質(zhì)譜儀（Finnigan LTQ XL），配有LTQ Xcalibur 2.0軟件處理系統(tǒng)（美國(guó)Finnigan公司）；LH-150S型種子老化試驗(yàn)箱（浙江托普儀器有限公司）；GXZ-380B智能光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）。

甲醇（色譜純，美國(guó)Dikmapure公司）。實(shí)驗(yàn)室用水為自制二次蒸餾水，其它試劑均為分析純。

小?？Х龋–.arabica L.）種子，2014年11月收獲，由熱帶作物研究所提供。種子含水量為26.15%，千粒重為182.34 g。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 人工加速老化 參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（International Seed Testing Association，ISTA）［9］的人工加速老化方法，老化箱溫度為40℃，箱內(nèi)相對(duì)濕度100%。老化時(shí)間分別為0，1，2，3，4，5和6 d，老化處理后的種子置于室溫放置3～4 d，確認(rèn)種子含水量降至原狀態(tài)，再進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜檢測(cè)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽實(shí)驗(yàn) 參照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》中的發(fā)芽條件進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)［10］。培養(yǎng)皿內(nèi)墊3層濾紙作為發(fā)芽床，每個(gè)培養(yǎng)皿放25粒咖啡種子，3個(gè)重復(fù)；將培養(yǎng)皿置于25℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次發(fā)芽的種子數(shù)，直至無(wú)萌發(fā)時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。以胚根長(zhǎng)度為種子長(zhǎng)度的1/2時(shí)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)各處理種子的發(fā)芽勢(shì)（GP）、發(fā)芽率（GR）、幼苗單株鮮重，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)（GI）和活力指數(shù)VI。

其中，EGN和TGN分別為發(fā)芽初期的發(fā)芽數(shù)和發(fā)芽終期的發(fā)芽數(shù)；SSN為供試種子數(shù)；Gt為第t天發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)；GI為發(fā)芽指數(shù)；S為幼苗單株鮮重（g）。

2.2.3 DAPCI-MS分析條件 如圖1所示，采用液體輔助DAPCI，LTQ-MS為正離子檢測(cè)模式，質(zhì)譜檢測(cè)掃描范圍為m/z 50～500；離子源電壓為3.5 kV；毛細(xì)管溫度為100℃；輔助解吸氣（N2）氣壓為0.8 MPa；解吸劑為甲醇/水溶液（4∶1，V/V），流速為3 μL/min。質(zhì)譜入口與離子源距離為10 mm；離子源與樣品表面的距離為5 mm；噴霧針與樣品表面的角度為50°；樣品表面與質(zhì)譜儀入口毛細(xì)管的角度為15°～30°。其它參數(shù)采由LTQ-MS系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件（IBM SPSS statistics）進(jìn)行方差分析、聚類分析（Cluster analysis，CA）和判別分析（Discriminant analysis，DA）。利用 Matlab軟件（7.0版，美國(guó) Mathworks公司）進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

圖1 DAPCI-MS檢測(cè)咖啡種子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of coffee seeds detection by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry（DAPCI-MS）

3 結(jié)果與討論

3.1 老化時(shí)間對(duì)咖啡種子發(fā)芽指標(biāo)和種子活力的影響

咖啡種子老化不同天數(shù)后，發(fā)芽指標(biāo)和種子活力指數(shù)變化如表1所示，未老化咖啡種子的發(fā)芽指標(biāo)和活力指數(shù)與老化后的咖啡種子之間的差異極顯著，隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)，咖啡種子的發(fā)芽指標(biāo)和活力指數(shù)均呈下降趨勢(shì)，老化至第6 d時(shí)，咖啡種子的發(fā)芽指標(biāo)和活力指數(shù)均為0。說(shuō)明在人工老化過(guò)程中，咖啡種子活力隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，直至完全喪失。老化處理的咖啡種子活力指標(biāo)與老化時(shí)間的相關(guān)關(guān)系如表2所示，咖啡種子的活力指標(biāo)與老化時(shí)間都呈負(fù)相關(guān)，且都達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明不同的人工老化時(shí)間使咖啡種子形成不同的活力水平。

表1 人工老化過(guò)程中咖啡種子發(fā)芽情況和活力指數(shù)Table 1 Germination and vigor indexes of coffee seeds by artificial aging

表2 咖啡種子人工老化過(guò)程中活力指標(biāo)與老化時(shí)間之間的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis between vigor indexes and artificial aging time

Rendón等［11］研究發(fā)現(xiàn)，咖啡種子在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，同時(shí)也觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，種子活力下降和感官變化，與谷物在存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)生的氧化過(guò)程一致。因此，采用本方法獲取咖啡種子表面的物質(zhì)信息，鑒別咖啡種子活力是可行的。Dussert等［12］研究富含油脂的咖啡種子的貯存時(shí)發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在調(diào)節(jié)中性脂質(zhì)的水解過(guò)程中表現(xiàn)出促進(jìn)游離脂肪酸生成的特性。因此，咖啡種子在人工老化過(guò)程中活力迅速下降，可能是由于在高溫高濕的條件下脂質(zhì)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，隨著人工老化時(shí)間延長(zhǎng)，種子劣變程度不斷加劇，人工老化處理顯著抑制了種子萌發(fā)，導(dǎo)致種子活力下降，直到完全喪失。

3.2 不同老化時(shí)間咖啡種子的DAPCI-MS分析

DAPCI-MS可以得到不同活力咖啡種子的指紋特征。如圖2所示，不同活力的咖啡種子的DAPCIMS譜圖既有相同之處，也有明顯的差異。在所有譜圖中，m/z 100～400之間產(chǎn)生的質(zhì)譜峰都很多，因?yàn)榭Х鹊幕瘜W(xué)組成復(fù)雜，就咖啡香氣而言就有近千種揮發(fā)性化合物［13］，因此在咖啡種子表面積累了很多物質(zhì)。在m/z＞400處，質(zhì)譜峰較少，可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)以甲醇-水（4∶1，V/V）溶液為解吸劑，一些大分子物質(zhì)很難從樣品表面有效地解吸出來(lái)。

所有咖啡種子樣品的指紋圖譜中均存在信號(hào)峰 m/z 55，274，302，318，400，473和489，且m/z 274和318均是最強(qiáng)的，m/z 473在老化0和1 d的樣品中信號(hào)強(qiáng)度相差不大，在老化2和3 d的樣品中信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但在老化4、5和6 d的樣品中信號(hào)強(qiáng)度又明顯下降。因?yàn)閾]發(fā)性香氣成分是種子的次級(jí)代謝產(chǎn)物，多由異戊二烯、類苯基丙烷、氨基酸和脂肪酸產(chǎn)生［14］。在人工老化過(guò)程中，一些揮發(fā)性化合物很快就揮發(fā)了，另一些則保持不變，隨著老化時(shí)間延長(zhǎng)，易揮發(fā)的物質(zhì)逐漸減少，所以利用DAPCI-MS技術(shù)得到不同活力咖啡種子的指紋圖譜中，有很多信號(hào)峰存在于所有圖譜中，一些信號(hào)峰的豐度保持不變，而另一些信號(hào)峰則在老化過(guò)程中先增強(qiáng)，后下降。

3.3 主成分分析

以m/z值為自變量，信號(hào)強(qiáng)度為因變量，利用Matlab軟件對(duì)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)（每種樣品選擇50個(gè)，共350個(gè)）進(jìn)行PCA，計(jì)算特征值、特征向量及累計(jì)貢獻(xiàn)率。圖3A是在正離子模式下的PCA得分圖，PC1、PC2和PC3分別代表了變量總方差的77.8%、11.1%和3.3%，累積92.2%，這3個(gè)主要成分包含了被分析樣本的絕大部分信息。圖3B是相應(yīng)的載荷圖，對(duì) PC1貢獻(xiàn)最大的質(zhì)譜信號(hào)是m/z 302，318，346，362，400，473等，說(shuō)明不同活力的咖啡種子樣品，其表面化學(xué)成分或含量發(fā)生了變化。所有咖啡種子有規(guī)律地聚集和分散，活力相同的種子聚在一定的區(qū)域內(nèi)，活力不同的種子分散在不同的區(qū)域。結(jié)果表明，DAPCI-MS結(jié)合PCA可以有效區(qū)分不同活力的咖啡種子。

圖3 咖啡種子PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.3 Score plots（A）and corresponding loading plots（B）of coffee seeds by principal component analysis

3.4 聚類分析

采用SPSS軟件計(jì)算105個(gè)咖啡種子樣品（每種樣品選擇15個(gè)）之間的歐氏距離，結(jié)果如圖4所示，相同活力的咖啡種子都分別聚在一起，CA準(zhǔn)確率為100%。當(dāng)臨界值為10時(shí)，105個(gè)咖啡種子樣品分別聚為4類。第一類包含老化1，2和4 d的咖啡種子樣品，特別是老化1和2 d的樣品間的距離較小，表明它們之間的差異較小。第二類包含老化3 d的咖啡種子樣品，與其它3類的距離較大，表明它們之間的差異也較大。第三類包含老化5和6 d的咖啡種子樣品，因?yàn)樗鼈兊幕盍χ笖?shù)差異不顯著。第四類包含未老化（0 d）的咖啡種子樣品，因?yàn)樗c其它3類咖啡種子的活力指數(shù)差異極顯著。結(jié)果表明，DAPCIMS結(jié)合CA可以有效區(qū)分不同活力的咖啡種子。

3.5 判別分析

按統(tǒng)計(jì)量Wilk's λ最小值原則選擇變量，進(jìn)行逐步DA，建立判別方程。根據(jù)非標(biāo)準(zhǔn)化判別方程系數(shù)，得到的判別函數(shù)方程組的變量與系數(shù)見表3。計(jì)算各咖啡種子得分，以F1為橫坐標(biāo)、F2為縱坐標(biāo)，得到咖啡種子判別圖（圖5）。計(jì)算判別函數(shù)F1、F2的特征值分別為38.553和12.004，典型相關(guān)系數(shù)分別為0.987和0.961，方差分析證明其類間差異極顯著（p＜0.01），判別結(jié)果有效。對(duì)350個(gè)訓(xùn)練樣本（每種樣品選擇50個(gè)）的回判，正確率為100%，交叉驗(yàn)證分析成功率100%，說(shuō)明得到的判別方程穩(wěn)定性良好；對(duì)140個(gè)外部驗(yàn)證樣本（每種樣品選擇20個(gè)）進(jìn)行判別，有6個(gè)老化1 d的樣本錯(cuò)判為老化2 d的樣本，正確率95.7%。

圖4 咖啡種子CA的樹形圖Fig.4 Dendrogram of coffee seeds by cluster analysis

表3 不同老化時(shí)間咖啡種子的判別函數(shù)變量及其系數(shù)Table 3Variable and coefficient of discriminant functions of different aging time for coffee seeds

從圖5可見，不同活力的咖啡種子樣本都能完全分開，老化0，1和2 d的咖啡種子樣本距離較近，但它們的活力指數(shù)之間差異極顯著，因此能完全分開。老化3 d的咖啡種子樣本與其它樣本距離較遠(yuǎn)，可能是因?yàn)樗鼈兊幕盍χ笖?shù)之間差異極顯著。老化4，5和6 d的咖啡種子樣本，雖然分布仍能各自成群，但間距較小，部分樣本容易混淆，可能是因?yàn)槔匣?和6 d的咖啡種子的活力指數(shù)差異不顯著。結(jié)果表明，DAPCI-MS結(jié)合DA可以有效區(qū)分不同活力的咖啡種子。

4 結(jié)論

在無(wú)需樣品預(yù)處理的前提下，采用DAPCI-MS直接對(duì)咖啡種子表面進(jìn)行檢測(cè)，獲得其正離子模式下的指紋圖譜。PCA提取了3個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到92.2%。CA可將相同活力的咖啡種子聚在一起，準(zhǔn)確率為100%。DA對(duì)訓(xùn)練樣本的回判正確率為100%，交叉驗(yàn)證分析成功率為100%，對(duì)外部驗(yàn)證樣本進(jìn)行DA，正確率為95.7%。DAPCI-MS結(jié)合多變量分析可以有效區(qū)分不同活力的咖啡種子。本研究為建立快速、無(wú)損、靈敏的種子活力檢測(cè)新方法提供了參考。

圖5 咖啡種子訓(xùn)練樣本和驗(yàn)證樣本的DA（F1、F2為判別函數(shù)）Fig.5 Discriminant classification of training samples and verification samples of coffee seeds（F1and F2are discriminant functions）

1 LUO Li-Ping，WANG Jiang，ZHANG Wen-Jun，DAI Xi-Mo，F(xiàn)ANG Xiao-Wei，ZHANG Xi，LIU Ya-Li，CHEN Huan-Wen.Chinese J.Anal.Chem.，2013，41（7）:1050-1056

羅麗萍，王姜，章文軍，戴喜末，方小偉，張茜，劉亞麗，陳煥文.分析化學(xué)，2013，41（7）:1050-1056

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王楠楠，王海東，丁健樺，歐陽(yáng)永中，朱小兵，陳煥文.分析化學(xué)，2014，42（4）:547-551

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6 LUO Li-Ping，ZHAO Zhan-Feng，DAI Xi-Mo，ZHANG Xi，LIU Ya-Li，ZHANG Xing-Lei，ZHANG Wen-Jun，OUYANG Yong-Zhong.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2013，29（7）:261-266

羅麗萍，趙占峰，戴喜末，張茜，劉亞麗，張興磊，章文軍，歐陽(yáng)永中.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013，29（7）:261-266

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8 Bytof G，Knopp S E，Kramer D，Breitenstein B，Bergervoet J H W，Groot S P C，Dirk S.Ann.Bot.，2007，100（1）:61-66

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國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（ISTA）.種苗評(píng)定與種子活力測(cè)定方法手冊(cè).北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1993:101-128

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國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（ISTA）.國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1996:54-57

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This work was supported by the Key Projects in the National Science&Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period （No.2012BDA29B01）and the National Natural Science Foundation of China（No.31370384 ）

Rapid Evaluation of SeedVigor of Coffee by Surface Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry

YIN Qin，LUO Huo-Lin，LIU Xing-Xing，HUANG Xue-Yong，LUO Li-Ping*
（School of Life Sciences，Nanchang University，Nanchang 330031，China）

To determine the seed vigor of coffee quickly and non-destructively，surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry（DAPCI-MS）was used to obtain chemical fingerprints directly from the surface of the coffee seed，without any sample pretreatment.The mass spectral raw data were analyzed by multivariate analysis，including principal component analysis（PCA），cluster analysis（CA）and discriminant analysis（DA），to differentiate efficaciously the coffee seeds with different vigor.The experimental results demonstrated that in the positive ion mode，DAPCI-MS combined with multivariate analysis could effectively distinguish different seed vigor for coffee seed.Three principal components were extracted by PCA，and their cumulative contribution rate was 92.2%.Coffee seeds with the same vigor was packed closely together in CA analysis，and its accuracy was 100%.In DA analysis，the return discriminant ratio for the training muster was as high as 100%，while the cross validation analysis success rate was 100%. Thus，it was concluded that the coffee seeds with different vigor could be differentiated by DAPCI-MS，and the results provided a basis for establishing a fast，non-destructive and sensitive detection method of seed vigor.

Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry；Coffee；Seed vigor；Multivariate analysis

4 July 2015；accepted 27 October 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150535

2015-07-04收稿；2015-10-27接受

本文系“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（No.2012BDA29B01）、國(guó)家自然科學(xué)基金（No.31370384）、江西省科技廳項(xiàng)目（No.20123BCB22004）和江西省教育廳項(xiàng)目（No.KJLD12051）資助

* E-mail:lluo2@126.com