姚文紅，李飛陽，王娟，駱珍，侯婷，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島266109；2.山東師范大學，山東濟南250014）

女貞花總黃酮提取及清除DPPH自由基作用的研究

姚文紅1，李飛陽2，王娟1，駱珍1，侯婷1，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島266109；2.山東師范大學，山東濟南250014）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用正交試驗優(yōu)化提取女貞花中總黃酮的工藝條件，并研究對DPPH自由基清除作用。結(jié)果表明：以0.5 g待測品為原料，按照1∶55（g/mL）料液比加入50%乙醇為提取劑，85℃恒溫回流提取60 min為最佳提取工藝，女貞總黃酮提取率為12.57%（RSD=0.74）；女貞黃酮對DPPH自由基清除率IC50值為11.97 μg/mL，最大清除率82.06%。

女貞花；總黃酮；DPPH自由基

女貞（學名Ligustrum lucidum）為玄參目木犀科女貞屬常綠灌木或喬木，亞熱帶樹種，原產(chǎn)中國，廣泛分布在長江流域及以南地區(qū)，華北、西北地區(qū)也有栽培。女貞樹枝葉茂密，樹形整齊，對二氧化硫、粉塵等大氣污染抗性較強，是園林綠化中應用較多的鄉(xiāng)土樹種。樹高可達25 m，樹皮灰褐色，單葉對生，圓錐花序頂生[1]。果實為女貞子，藥用歷史悠久，據(jù)《本草經(jīng)疏》記載其“氣味俱陰，正入腎除熱補精之要品，腎得補，則五臟自安，精神自足，百病去而身肥健矣”[2]。臨床上已證明，其具有滋養(yǎng)肝腎，強腰膝，烏須明目的功效，有很高的藥用價值。

現(xiàn)代研究表明，女貞子、葉中含有女貞子甙、齊墩果酸、對-羥基苯乙醇、熊果酸、甘露醇、鼠李糖等30多種有效成份，還含有銅、鐵、鋅、錳、鉻、鎳等人體必需微量元素，具有明顯的醫(yī)療保健作用和極高的營養(yǎng)價值，但是，對女貞花的相關(guān)研究卻鮮見報道。本試驗著重對女貞花中總黃酮的提取工藝及抗氧化性進行研究，以期為女貞花中有效成份的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉女貞花：由青島農(nóng)業(yè)大學植物保護學院羅蘭教授采自青島嶗山并鑒定；蘆丁標準品：國藥集團化學試劑有限公司，批號20120514；抗壞血酸：天津市永大化學試劑有限公司；其它試劑均為分析純；試驗用水為蒸餾水。

UV-1601型紫外分光光度計：日本島津公司；752N型紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；AR1140型電子天平：上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；DZX-1型真空干燥箱：上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；SHB-B88型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SF-170型高速粉碎機：上海中藥機械廠。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的測定[3]

1.2.1.1 標準曲線的繪制

準確稱取110℃干燥至恒重的蘆丁標準品50.0mg，50%乙醇溶解，定容至250 mL，得對照品溶液。精密吸取 對照品溶液 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00mL于25mL容量瓶中，加入50%乙醇10 mL，5%亞硝酸鈉0.50 mL，搖勻放置5 min，10%硝酸鋁0.50 mL，搖勻放置6 min，1 mol/L氫氧化鈉5.00 mL，50%乙醇定容，搖勻放置25 min，于510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，總黃酮含量為橫坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如圖1。

圖1 對照品標準曲線Fig.1 The standard curve of control article

對照品濃度對吸光度的線性方程為A=11.493 48c＋0.021 59，R=0.999 09，線性關(guān)系良好。

1.2.1.2 總黃酮提取率的測定

女貞花烘干粉碎過40目篩，加石油醚浸泡48 h，除去可溶性雜質(zhì)，過濾晾干，得待測品；準確稱取待測品0.5 g，回流提取，冷卻過濾，定容至100 mL得待測液；準確移取待測液2.00 mL，按照上述方法，測定吸光度，平行3次，依據(jù)公式計算總黃酮提取率。

式中：A為吸光度；m為待測品質(zhì)量，g。

1.2.2 提取溶劑的選擇

控制提取溫度為 85℃，料液比為 1∶55（g/mL），提取時間為 60 min，采用 5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH、50%乙醇、50%甲醇、50%丙酮溶液、水，提取待測品總黃酮，采用1.2中方法測定總黃酮含量，選擇合適的提取溶劑。

1.2.3 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定[4]

以待測品總黃酮提取率為考察指標，從乙醇濃度、提取溫度、料液比、加熱時間四方面進行試驗，以確定各因素最優(yōu)值，在此基礎(chǔ)上設(shè)計四因素四水平正交表L16（44），進行正交試驗，篩選最佳工藝條件。

1.3 DPPH自由基清除能力試驗[5]

DPPH自由基可以穩(wěn)定存在于有機溶劑中，由于1個穩(wěn)定的DPPH自由基與抗氧化劑提供的1個電子配對結(jié)合，可使DPPH試劑的特征紫紅色消失，因此可用來檢測自由基清除情況，判斷抗氧化性能力。

分別準確稱取 DPPH 20.0 mg，VC12.5 mg，BHT 12.5 mg，50%乙醇定容至250 mL，得到的溶液質(zhì)量濃度值分別為 DPPH 80 μg/mL，VC50 μg/mL，BHT 50 μg/mL，避光放置；將待測液合并稀釋成總黃酮濃度為50μg/mL待測液，按表1所示加入反應液，50%乙醇將各管補充至10.00 mL，充分混勻后，暗處靜置30 min，于517 nm波長處，分光光度法測定吸光度，重復3次。

表1 試驗加樣表Table 1 Amount of test sample added

DPPH自由基的清除能力（scavenging activity，SA）可用公式表示為：

式中：Ai為DPPH試劑與待測液反應后的吸光度；Aj為待測液與50%乙醇混合液的吸光度；A0為DPPH試劑與50%乙醇混合液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

在300 nm～600 nm波長范圍內(nèi)，對不同溶劑總黃酮提取液進行紫外可見光譜掃描結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑提取液紫外可見光譜掃描Fig.2 UV-visible absorption spectrum of extracts with different solvent

不同溶劑對提取率的影響結(jié)果見表2。

表2 不同提取劑對提取率的影響Table 2 Effects of extraction agent on yield rate

總黃酮提取率最高的溶劑為乙醇溶液，提取率達12.49%，甲醇溶液提取率最低為0.26%，0.2%NaOH、5%NaHCO3、5%Na2CO3的提取率依次為 7.64%、5.32%、4.26%，分析原因可能是堿性物質(zhì)使母核發(fā)生變性等因素引起，丙酮和水提取率比較高，分別是9.45%、9.01%，但丙酮毒性較大，水提取物所含雜質(zhì)較多。綜上所述，確定乙醇溶液為最適提取溶劑。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

準確稱取待測品0.5 g，控制提取溫度50℃，料液比 1 ∶55（g/mL），提取時間 60 min，設(shè)置不同乙醇濃度對待測品中的總黃酮進行提取。乙醇濃度對提取效果的影響見圖3。

結(jié)果如圖3所示，隨著乙醇濃度的增大，提取率逐漸上升，60%后下降較大，濃度為50%～60%，提取率較高，因此，選取乙醇濃度40%、50%、60%、70%四水平，進行正交試驗。

圖3 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction effect

2.2.2 提溫度對總黃酮提取率的影響

準確稱取待測品0.5 g，控制料液比 1∶55（g/mL），乙醇濃度50%，提取時間60 min，設(shè)置不同提取溫度提取待測品中的總黃酮。溫度對提取效果的影響見圖4。

圖4 溫度對提取效果的影響Fig.4 Effects of temperatures on extraction effect

結(jié)果如圖4所示，隨著溫度的升高，提取率整體呈上升趨勢，但提取溫度較高會造成溶劑揮發(fā)，增加能源消耗，因此，選取 55、65、75、85℃為正交試驗的 4個水平。

2.2.3 料液比對總黃酮提取率的影響

準確稱取待測品0.5 g，控制乙醇濃度60%，提取溫度85℃，提取時間60 min，設(shè)置不同料液比提取待測品中的總黃酮。料液比對提取效果的影響見圖5。

結(jié)果如圖5所示，隨著料液比的增大，提取率逐漸上升，1 ∶55（g/mL）后略有下降，料液比為 1 ∶55（g/mL）時，總黃酮提取率較高，因此選取 1 ∶35、1 ∶45、1 ∶55、1 ∶65（g/mL）四水平。

2.2.4 提取時間對提取效果的影響

準確稱取待測品0.5 g，控制提取溫度85℃，料液比1∶55（g/mL），乙醇濃度60%，設(shè)置不同提取時間提取待測品中的總黃酮。提取時間對提取效果的影響見圖6。

圖5 料液比對提取效果的影響Fig.5 Effects of material-to-liquid on extraction effect

圖6 提取時間對提取效果的影響Fig.6 Effects of time on extraction effect

結(jié)果如圖6所示，隨提取時間的延長，提取率總體呈現(xiàn)上升趨勢，60 min時黃酮類化合物的溶出已達12.53%，180 min時，提取時間增加了200%，提取率只提高了0.33%，另外延長時間會增加能耗，所以30、60、90、120 min為正交試驗提取時間的四個水平，更加合理。

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

4種因素對總黃酮提取率的影響結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

續(xù)表3 正交試驗結(jié)果與分析Continue table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

影響次序為提取溫度>乙醇濃度>提取時間>料液比，最優(yōu)組合為：A4B1C3D4，由于提取時間對提取率的影響不大，為降低能耗，提高了效率，最終確定提取時間為60 min。

綜上所述，女貞花總黃酮的最佳提取工藝條件為：0.5 g待測品，按照1∶55（g/mL）的料液比，加入 50%乙醇，85℃水浴加熱60 min。

2.5 驗證試驗

準確稱取待測品0.5 g，按照1∶55（g/mL）料液比，加入50%乙醇，85℃恒溫水浴提取60 min，冷卻過濾，濾液定容至100 mL，平行5次。準確移待測液2.0 mL，按1.2中方法，測定總黃酮提取率，結(jié)果見表4，總黃酮提取率為12.57%，該工藝條件有效可行。

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 Results of verification experiment

2.6 DPPH自由基清除能力試驗

DPPH自由基清除能力的試驗結(jié)果見圖7。

試驗范圍內(nèi)，女貞花中總黃酮對DPPH自由基清除能力隨濃度增加而增大，濃度為22.4 μg/mL時，達到最大抑制率82.06%。與VC、BHT相比，當總黃酮濃度<19.24 μg/mL時，清除能力VC>BHT>提取液；總黃酮濃度＞19.24 μg/mL 時，清除能力 VC＞提取液＞BHT；VC、提取液、BHT清除DPPH自由基的IC50值分別為5.58、11.97、13.95 μg/mL，因此，女貞黃酮有很強的抗氧化功效，值得深入研究其生理功能和開發(fā)功能產(chǎn)品。

圖7 DPPH自由基清除能力比較Fig.7 Comparison of DPPH radical scavenging ability

3 結(jié)論

以蘆丁為對照品，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法，考察女貞花中總黃酮提取率；試驗表明，乙醇溶液為最佳提取溶劑；通過單因素和正交試驗，確定以0.5 g待測樣品，按照 1∶55（g/mL）的料液比，加入 50%的乙醇為提取劑，85℃恒溫回流提取60 min為最優(yōu)工藝條件；該條件下總黃酮的提取率為12.57%（RSD＝0.74），該提取工藝操作簡單，穩(wěn)定可行。

女貞花中總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨濃度的增加而增大，濃度為22.4 μg/mL時，達到最大抑制率82.06%；VC、提取液、BHT清除DPPH自由基的IC50值分別為 5.58、11.97、13.95 μg/mL，從而證實女貞黃酮是一種有效的自由基清除劑。為以后女貞黃酮在保健食品、藥品領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

[1] 侯家玉.中藥藥理學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2002

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社：2010：13

[3] Bandele O J,Osheroff N.Bioflavonoids as poisons of human topoisomerase Ⅱ alpha and Ⅱ beta[J].Biochemistry,2007,46(20)：6097-6108

[4] 劉重芳,吳志榮,方青漢.銀杏葉總黃酮提取工藝探討[J].中成藥,1992,14(7)：7-8

[5] 郭雪峰,岳永德,湯鋒,等.用清除有機自由基DPPH法評價竹葉提取物抗氧化能力[J].光譜學與光譜分析,2008,28(7)：1578-1582

Study on Extraction of Total Flavonoids in Ligustrum Flowers and Its Scavenging Activity on DPPH Free Radicals

YAO Wen-hong1，LI Fei-yang2，WANG Juan1，LUO Zhen1，HOU Ting1，*
（1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China；2.Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China）

To optimize the extraction of total flavonoids in Ligustrum flowers and its scavenging activity on DPPH free radicals，the factors influencing the process parameters were determined by specotrophotometric method.The results showed the optimum conditions of the extraction were as followes：0.5 g of samples were used as the raw material，50%ethanol solution was used as the extraction solvent with a raw material to extraction solvent ratio of 1∶55（g/mL），and the reflux extraction was carried out in 85℃water bath for 60 min.The extraction rate was 12.57% （RSD=0.74）.The IC50value of DPPH free radical scavenging rate by flavonoids in Ligustrum flowers was 11.97 μg/mL，and the maximum the clearance rate of DPPH free radical was 82.06%.

Ligustrum flowers；total flavonoids；DPPH free radical

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.012

青島農(nóng)業(yè)大學高層次人才科研基金（663-1113320）；青島農(nóng)業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新基金（2014305）

姚文紅（1968—），女（漢），副教授，學士，研究方向：生物產(chǎn)品的分離分析。

*通信作者：侯婷（1973—），女（漢），副教授，博士。

2015-07-23