宋國田，江小龍，陳五九，彭彥峰，路福平，王欽宏

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產(chǎn)順,順-粘康酸細胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

宋國田1,2，江小龍2，陳五九2，彭彥峰2，路福平1，王欽宏2

1 天津科技大學生物工程學院，天津 300457 2 中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

順,順-粘康酸是重要的平臺化學品。目前，生物合成順,順-粘康酸還缺乏高性能菌株，已報道的主要工程菌株不僅需要誘導表達，遺傳不穩(wěn)定，而且發(fā)酵培養(yǎng)基組分復雜，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。構(gòu)建能利用簡單無機鹽培養(yǎng)基、遺傳穩(wěn)定且不需要誘導表達的新型工程菌受到人們的關(guān)注。本研究在實驗室前期構(gòu)建的產(chǎn)三脫氫莽草酸工程菌株WJ060中，整合合成順,順-粘康酸的3個外源基因(、、)，并且利用3個不同強度的組成型啟動子進行組合調(diào)控，成功構(gòu)建了27株順,順-粘康酸工程菌，得到的最優(yōu)工程菌MA30的產(chǎn)量達到1.7 g/L。為了進一步提高順,順-粘康酸工程菌的生產(chǎn)能力，利用基因組復制工程構(gòu)建突變體庫，結(jié)合高通量篩選方法，經(jīng)過兩輪篩選，成功篩選到了順,順-粘康酸產(chǎn)量提高超過8%的大腸桿菌MA30-G2。利用5 L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵，MA30-G2的順,順-粘康酸產(chǎn)量達到了11.5 g/L。本研究采用組合調(diào)控和高通量篩選相結(jié)合的策略不僅促進了順,順-粘康酸的生物合成，同時也為其他生物基化學品的生物制造提供了重要參考。

順,順-粘康酸，組合調(diào)控，大腸桿菌，組成型啟動子，基因組復制工程，高通量篩選

順,順-粘康酸(,-muconic acid，MA)具有兩個羧基和成對的共軛雙鍵，在260 nm處具有很好的紫外吸收性質(zhì)，可用于紫外防護劑以及軍工特種用品如隱形飛機涂層，同時也是制備功能樹脂、醫(yī)藥及農(nóng)用化學品的潛在原料[1]，并可用于生產(chǎn)大宗化工產(chǎn)品尼龍66的單體己二酸以及對苯二甲酸二甲酯和偏苯三酸等[2-4]。

目前，生物合成MA主要是利用含質(zhì)粒的工程菌實現(xiàn)。2015年，Jung等[5]通過在優(yōu)化的肺炎克雷伯氏菌中轉(zhuǎn)入含有的質(zhì)粒，MA產(chǎn)量達到2.1 g/L，但由于肺炎克雷伯氏菌是致病菌，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；2013年，Pandeeti等[6]在釀酒酵母中通過在質(zhì)粒上過表達MA合成途徑的3個外源基因，首次實現(xiàn)了MA在釀酒酵母中的生產(chǎn)，產(chǎn)量僅為141 mg/L。自1994年Draths等[7]在莽草酸合成途徑阻斷的大腸桿菌AB2834中通過共轉(zhuǎn)含有MA合成途徑3個外源基因的2個質(zhì)粒，MA產(chǎn)量達到2.4 g/L之后，在大腸桿菌中合成MA的研究也越來越受到人們的關(guān)注。2014年，Lin等[8]通過以水楊酸作為前體合成MA，搖瓶發(fā)酵48 h產(chǎn)量達到 1.5 g/L。2015年，Zhang等[9]通過構(gòu)建了共生的雙細胞模式將木糖與葡萄糖混合糖轉(zhuǎn)化為MA的生物合成途徑，MA在72 h的分批補料發(fā)酵產(chǎn)量最高達到4.7 g/L。雖然MA在大腸桿菌中生產(chǎn)取得了一定程度的成功，但由于是以遺傳不穩(wěn)定的基于質(zhì)粒的工程菌為發(fā)酵菌株，同時使用復雜的培養(yǎng)基成分使生產(chǎn)成本增加，不利于MA工業(yè)化生產(chǎn)。因此，需要通過利用新的代謝工程策略將外源基因整合到大腸桿菌基因組，并通過組合調(diào)控等獲得生產(chǎn)能力提高，并且遺傳穩(wěn)定的工程菌株。

為了提高MA產(chǎn)量，近幾十年中，許多研究學者[10-12]也采用各種方法提高MA前體物3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量。本研究中，以產(chǎn)3-脫氫莽草酸(3-hydroshikimate, DHS) 的大腸桿菌WJ060作為出發(fā)菌株，先后整合不同強度組成型啟動子組合調(diào)控[13]、和突變體[14]的表達，合成途徑如圖1所示。我們得到了最優(yōu)MA生產(chǎn)菌MA30。為進一步提高MA工程菌的生產(chǎn)能力，我們將基因組復制工程與MA高通量篩選方法[15-16]相結(jié)合，經(jīng)過兩輪篩選，成功篩選到了MA產(chǎn)量得到提高的大腸桿菌MA30-G2。利用5 L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵[17-21]，進一步提高了MA的產(chǎn)量。

圖1 大腸桿菌中順,順-粘康酸生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本試驗所用菌株與質(zhì)粒如表1所示。生產(chǎn)DHS的出發(fā)菌株大腸桿菌WJ060是實驗室前期構(gòu)建的菌株。

表1 本研究的菌株與質(zhì)粒

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素(工作濃度100 μg/mL)、氯霉素(工作濃度34 μg/mL)、壯觀霉素(工作濃度 50 μg/mL) 購自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；DNA 回收試劑盒購自康為世紀公司；TransStart FastDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×PCR MasterMix，DNA marker購自Biomed公司；3-脫氫莽草酸(DHS) 標準品購自美國Sigma公司；原兒茶酸(PCA) 標準品購自Aldrich公司；兒茶酚(CA) 標準購自國藥集團化學試劑有限公司；順,順-粘康酸(MA)標準品購自Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10 (固體LB加入1.5%瓊脂粉) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO43.5，K2HPO4·3H2O 6.5，MgSO40.12，(NH4)2HPO43.5，CaCl20.011，硫胺素0.005。每升搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基添加1 mL的微量元素(g/L) 包括FeCl3·6H2O 0.16，CoCl2·6H2O 0.02，CuSO4·5H2O 0.015，ZnCl20.02，Na2MoO4·2H2O 0.02，H3BO30.05，每升微量元素添加10 mL濃鹽酸。

發(fā)酵罐發(fā)酵種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10，葡萄糖10；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 7.5，MgSO4·7H2O 2，(NH4)2SO41.6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.077 5，檸檬酸2，酵母抽提物1。每升發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基添加1 mL微量元素(g/L) 包括MnSO4·H2O 0.004 5，Na2SO40.02，ZnSO40.006 4，CoCl2·6H2O0.004，CuSO4·5H2O 0.000 6。

1.2 方法

1.2.1 重組片段的構(gòu)建

整合到基因組中的由低強度到高強度的組成型啟動子(P1: 5￠-TTATCTCTGGCGGTGTTG ACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCTTTTGGTGCGTCAGTCAGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3￠，P2: 5￠-TTATCTCTGGCGGTGT TGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCTGAGGTGGCTTATTATTCGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3'，P3: 5￠-TTATCTCTGGCGG TGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCGTATTGTTAGCATGTACGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3￠)[24]與以及T7終止子串聯(lián)表達重組片段構(gòu)建如下：1) 第一步同源重組片段的構(gòu)建：以pEASY-cat-sacB-ap為模板利用引物ldhA-cat-sacB-s/ldhA-cat-sacB-a進行擴增，獲得帶有40 bp同源臂的ldhA-cat-sacB- ldhA DNA片段。2) 第二步同源重組片段的構(gòu)建：以pKD8.243為模板利用ldhA-P1-aroZ-s、ldhA-P2-aroZ-s、ldhA-P3-aroZ-s/ldhA-T7-aroZ-a分別進行擴增，獲得帶有40 bp同源臂的ldhA-P1/2/3-aroZ-T7-ldhA DNA片段，通過兩步同源重組的方法實現(xiàn)目標片段對的無痕替換。具體構(gòu)建片段與整合流程如圖2A所示。

圖2 重組片段的整合與組合調(diào)控示意圖

用上述方法獲得帶有40 bp同源臂的aroZ-T7-cat-sacB-ldhA、aroZ-T7-P1/2/3-aroY-T7- ldhA以及aroY-T7-cat-sacB-ldhA、aroY-T7- P1/2/3-catA-T7-ldhA DNA片段。本研究中所用引物見表2。

表2 本研究所用的引物

The underlined is the sequence of synthetic promoter corresponding to the primer name.

1.2.2 MA細胞工廠的構(gòu)建

通過在產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌WJ060基因組上位點上依次整合3種不同強度的組成型啟動子組合調(diào)控的3個外源基因(、、)，成功構(gòu)建了27株MA工程菌MA13-MA39，組合調(diào)控示意圖如圖2B所示。

1.2.3 MA高通量測定方法的建立

基于MA在260 nm處有很好的紫外吸收性質(zhì)，配制濃度為0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L以及1 g/L的MA標準品，通過在酶標儀測定其260 nm的紫外吸光度值，以MA標準品濃度為橫坐標，紫外吸光度值為縱坐標，繪制MA標準溶液的濃度與吸光度的標準曲線，每組實驗3次平行。

1.2.4 MA細胞工廠的高通量篩選優(yōu)化

基于突變的基因組復制工程構(gòu)建文庫[16]，在MA30中轉(zhuǎn)入溫敏型質(zhì)粒pKD46-dnaQ (由突變體替換pKD46中的、、)后于30 ℃連續(xù)傳代4次，每代時12 h，從而構(gòu)建了MA30突變體文庫。從文庫中分離單菌落，經(jīng)過活化后，在無菌的96深孔板中37 ℃、 220 r/min發(fā)酵24 h，取每個文庫中近千個樣本的發(fā)酵液在96孔板中于酶標儀上檢測其260 nm處的紫外吸光度值，并對吸光度值高于對照的最高突變工程菌進行搖瓶發(fā)酵驗證，從而實現(xiàn)了高通量篩選的目的。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐補料發(fā)酵

搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)MA：將保存于?80 ℃的工程菌在加有氨芐青霉素的平板上劃線，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到含有3mL LB的試管中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，測600值，保證起始600=0.4，按相應(yīng)比例接種到10 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(100 mL搖瓶)，接種時添加2%葡萄糖，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，收集菌液用于MA產(chǎn)量的測定。

發(fā)酵罐補料發(fā)酵生產(chǎn)MA：選取搖瓶發(fā)酵中MA產(chǎn)量最高的菌株進行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。將保存于?80 ℃的工程菌在加有氨芐青霉素的平板上劃線，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到含有3 mLLB的試管中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，再將3 mL培養(yǎng)液接種于200 mL種子培養(yǎng)基(1 L搖瓶)中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h，然后將200 mL種子全部接種于裝有1.8 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在37 ℃、pH 6.5、溶氧40%的條件下發(fā)酵，通過氨水調(diào)控pH。嚴格控制培養(yǎng)基中殘?zhí)呛康陀? g/L。從6 h開始，每隔6 h取樣檢測發(fā)酵液中葡萄糖、DHS、PCA、CA以及MA含量。

1.2.6 代謝產(chǎn)物和菌體量檢測

利用高效液相色譜來確定發(fā)酵液中葡萄糖消耗量，DHS、PCA、CA以及MA積累量。發(fā)酵液稀釋適當倍數(shù)后取1 mL于12 000 r/min離心10 min，取上清液制樣，上液相。檢測條件：VWD檢測器，Innoval C18色譜柱(4.6mm× 250 mm，5 μm)，流動相A為水∶磷酸=1 000∶1 (占80%)，B為甲醇(占20%)，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長分別為210 nm以及 260 nm。每個待測樣品分別有3個平行樣，實驗結(jié)果取自3個平行的平均值。用DHS、PCA、CA以及MA等標準品構(gòu)建HPLC標準曲線。以水作為空白，用分光光度計測定600值作為單位時間的菌體量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MA細胞工廠的構(gòu)建

為了構(gòu)建基因組整合型的MA細胞工廠，選擇實驗室前期構(gòu)建的產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌WJ060為出發(fā)菌株。該菌株是在野生型大腸桿菌ATCC8739中，通過弱化調(diào)控突變體替換解除反饋抑制作用、強化調(diào)控替換PTS以及弱化調(diào)控和后獲得，可高效生產(chǎn)3-脫氫莽草酸，搖瓶產(chǎn)量超過3 g/L (圖1)。結(jié)合理性設(shè)計原則，在產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌WJ060基因組上，通過替代乳酸脫氫酶基因，依次整合3種不同強度的組成型啟動子組合調(diào)控的3個外源基因(、、)，成功構(gòu)建了27株MA工程菌，實現(xiàn)了外源基因在WJ060基因組上的表達，結(jié)果如圖3所示。對MA及其副產(chǎn)物產(chǎn)量分析表明，在MA產(chǎn)量前三的工程菌(MA21、MA27以及MA30) 中的表達均由高強度組成型啟動子P3調(diào)控，而在MA產(chǎn)量最低的3株工程菌(MA13、MA22以及MA31) 中以及的表達均由弱強度組成型啟動子P1調(diào)控，其副產(chǎn)物DHS、PCA以及CA在不同程度上均有較多積累，基因的表達強度影響MA的生產(chǎn)強度；MA30產(chǎn)量最高達到1.7 g/L，其副產(chǎn)物DHS因其的表達由中等強度組成型啟動子P2調(diào)控，未完全轉(zhuǎn)化到PCA而積累0.067 g/L，由于和的表達均受到高強度組成型啟動子P3調(diào)控，PCA和CA基本上都轉(zhuǎn)化成MA而沒有積累；由3個最強的P3啟動子分別調(diào)控3個外源基因表達的MA39產(chǎn)量少于MA30，與預期不一致，其原因在于MA39生長情況明顯較弱，不利于MA的積累；同時結(jié)合27株工程菌的生長情況分析，MA產(chǎn)量較高的工程菌(MA21、MA27以及MA30) 其生長情況明顯較弱，相反，MA產(chǎn)量較低的工程菌(MA13、MA22以及MA31)其生長情況反而較好，MA產(chǎn)量的積累對MA工程菌的生長有明顯的抑制作用。通過構(gòu)建一系列的MA細胞工廠，成功得到1株生長較好、產(chǎn)量較高的MA工程菌MA30。

圖3 整合不同強度組成型啟動子表達aroZ、aroY和catA的工程菌的MA產(chǎn)量

2.2 MA高通量測定方法的建立

為了提高MA細胞工廠的生產(chǎn)能力，期望通過基因組復制工程，篩選得到產(chǎn)能提高的MA突變株。然而，利用產(chǎn)物HPLC分析等檢測方法難以進行龐大的文庫篩選，需要有高通量的檢測和篩選方法。由此，基于MA在260 nm處有良好的紫外吸收性質(zhì)，我們測試了MA在 260 nm吸光度值與標準品濃度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)實驗測得的吸光度值與標準MA溶液濃度之間的關(guān)系為=2.703 2+4.406 8，相關(guān)系數(shù)的平方2為0.990 5，線性關(guān)系良好 (圖4)。因此，利用紫外檢測的方法可以用來實現(xiàn)對生產(chǎn)MA的突變體文庫快速、準確地篩選。

圖4 紫外檢測MA的標準曲線

2.3 MA細胞工廠的優(yōu)化

2.3.1 MA細胞工廠的高通量篩選

第一輪篩選：以MA30作為出發(fā)菌株，基于突變體的基因組復制工程構(gòu)建了MA突變文庫后，利用MA高通量篩選方法，對文庫進行酶標儀檢測260 nm處的紫外吸光度值 (圖5A)。在含有950個樣本的MA30文庫中，篩選得到紫外吸收值大于MA30共351個，占文庫37%，并經(jīng)過搖瓶發(fā)酵驗證，得到了MA產(chǎn)量提高的突變體MA30-G1。

圖5 MA突變體的紫外吸光度值

第二輪篩選：為了進一步提高MA30-G1的生產(chǎn)能力，以MA30-G1作為出發(fā)菌株，基于突變體的基因組復制工程構(gòu)建文庫后，利用MA高通量篩選方法，對文庫進行酶標儀檢測260 nm處的紫外吸光度值(圖5B)。在含有950個樣本的MA30-G1文庫中，篩選得到紫外吸收值大于MA30-G1的突變體共171個，占文庫18%，并經(jīng)過搖瓶發(fā)酵驗證，得到了MA產(chǎn)量進一步提高的突變體MA30-G2。

2.3.2 篩選得到的進化菌株搖瓶發(fā)酵評價

為了同時評價篩選得到的MA30-G1，MA30-G2以及對照MA30生產(chǎn)MA的情況，對其進行搖瓶發(fā)酵評價 (圖6)。通過基因組復制工程與高通量篩選方法的結(jié)合，先后成功篩選得到了MA產(chǎn)量較MA30提高4%的MA30-G1，較MA30-G1產(chǎn)量進一步提高4.3%的MA30-G2，從而最終得到的MA30-G2較MA30產(chǎn)量提高了8.5%。因而，我們利用基因組復制輔助工程與MA高通量篩選方法，實現(xiàn)了快速、便捷的MA文庫構(gòu)建與篩選，并成功篩選到MA細胞工廠產(chǎn)能進一步提高的MA30-G2。

圖6 大腸桿菌MA30-G1和MA30-G2相對于MA30的粘康酸產(chǎn)量提高率

2.3.3 MA30-G2的5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵評價

為了進一步研究工程菌生產(chǎn)MA的性能，選取MA30-G2作為出發(fā)菌株，進行5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵 (圖7)。經(jīng)過72 h的發(fā)酵，MA產(chǎn)量最高為11.5 g/L，PCA、CA以及其他的副產(chǎn)物含量幾乎為0 g/L，而DHS積累了 2.7 g/L，轉(zhuǎn)化率8.1% mol/mol，其原因在于在MA30-G2(P2、P3和P3分別調(diào)控3個外源基因的表達)中的由中等強度的啟動子P2調(diào)控，致使DHS無法完全轉(zhuǎn)化到PCA而積累了下來。通過放大發(fā)酵，MA30-G2的MA產(chǎn)量得到了進一步的提高，較MA30提高了6.7倍。隨著MA產(chǎn)量的不斷增加，600在30 h達到最大值為19.4之后一直在降低， 78 h時降到12.4。一方面，由于發(fā)酵后期，菌體處于衰亡期，死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，總活菌數(shù)明顯下降，生理代謝活動趨于停滯；另一方面可能由于MA的積累對MA30-G2造成了很大的生長壓力，抑制其生長。后續(xù)我們可以通過對MA30-G2進行MA耐受性適應(yīng)性進化，提高菌株對MA的耐受性，從而進一步提高MA工程菌的生產(chǎn)能力。

圖7 MA30-G2的5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

3 討論

本研究先后采用了理性設(shè)計原則以及基因組復制工程對產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌WJ060進行改造與優(yōu)化，包括了在WJ060基因組中的位點上，依次整合3種不同強度的組成型啟動子組合調(diào)控的3個外源基因(、) 的理性設(shè)計以及MA工程菌基于基因組復制工程構(gòu)建文庫與基于紫外檢測MA方法構(gòu)建的高通量篩選方法進行篩選的非理性設(shè)計，從而得到了27株MA工程菌中MA產(chǎn)量最高的MA30以及產(chǎn)量進一步提高的MA30-G2。

根據(jù)理性設(shè)計原則，在不同強度的組成型啟動子組合調(diào)控3個外源基因表達而構(gòu)建的27株MA工程菌中，MA30 (由P2、P3和P3組成型啟動子分別調(diào)控3個外源基因的表達)在簡單的無機鹽搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)過24 h發(fā)酵，產(chǎn)量達到1.7 g/L，實現(xiàn)了MA生產(chǎn)過程無需添加額外的營養(yǎng)物質(zhì)，也成功避免了質(zhì)粒表達外源基因時存在的易丟失現(xiàn)象，極大降低了MA生產(chǎn)成本，為異源合成MA以及MA工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。然而，基于理性設(shè)計原則的代謝工程方法雖然可以通過對宿主的代謝網(wǎng)絡(luò)中的特定基因位點進行遺傳改造，來實現(xiàn)微生物向著指定表型區(qū)域定向躍進，但是，很難實現(xiàn)基因組上多個位點的同時擾動來增強表型的目的。

于是，我們基于突變體的基因組復制工程構(gòu)建了1個含有將近千個突變體的文庫，實現(xiàn)了在MA30的基因組上多位點的同時擾動，并利用已構(gòu)建的高效、便捷的MA紫外檢測和篩選方法，經(jīng)過兩輪的篩選，成功篩選得到MA產(chǎn)量逐步提高的MA30-G1和MA30-G2，在搖瓶發(fā)酵中MA30-G2的MA產(chǎn)量較MA30提高了8.5%。對MA30-G2進行5 L發(fā)酵罐的分批補料發(fā)酵，經(jīng)過72 h的發(fā)酵，MA產(chǎn)量達到最高為11.5 g/L較MA30產(chǎn)量提高了6.7倍，從而證實了基因組復制工程與MA高通量篩選方法能夠高效而有效地提高MA工程菌的生產(chǎn)能力。

本研究中，MA30-G2在含有較高濃度的MA時生長明顯受到抑制，后續(xù)可以通過對MA30-G2進行耐受性適應(yīng)性進化，提高其耐受性，進一步提高MA30-G2的生產(chǎn)能力。借助基因組復制工程，我們篩選得到的MA30-G1和MA30-G2以及原始菌株MA30進行基因組重測序，期望通過序列對比以及功能性基因的差異性分析整個代謝網(wǎng)絡(luò)的差異性，從而為后續(xù)反向代謝工程操作提高MA產(chǎn)量提供參考。

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(本文責編 陳宏宇)

Construction and optimization of microbial cell factories for producing-muconic acid

Guotian Song1,2, Xiaolong Jiang2, Wujiu Chen2, Yanfeng Peng2, Fuping Lu1, and Qinhong Wang2

1,,300457,CAS Key Laboratory of Systems Microbial BiotechnologyTianjin Institute of Industrial BiotechnologyChinese Academy of ScienceTianjinChina

-muconic acid (MA) is an important platform chemical. Now, majority of reported engineered strains are genetically instable, the exogenous genes are expressed under the control of expensive inducer and the components of their fermentation medium are complex, thus large-scale microbial production of MA is limited due to the lack of suitable strains. Hence, it is still necessary to construct novel high-performance strain that is genetically stable, no induction and grows in simple inorganic fermentation medium. In this study, after 3 exogenous genes (,,) for biosynthesis of MA were integrated into previously constructed 3-hydroshikimate producingWJ060 strain and combinatorially regulated with 3 constitutive promoters with different strengths, 27 engineered strains were constructed. The best engineered strain,MA30 could produce 1.7 g/L MA in the simple inorganic fermentation medium without induction. To further enhance the production capacity of MA, the mutant library ofMA30 was constructed by genome replication engineering and screenedhigh-throughput assay. After two-round screening, the new strain,MA30-G2 with improved production of MA was obtained, and the titer of MA increased more than 8%. Under the condition of 5 L fed-batch fermentation,MA30-G2 could produce about 11.5 g/L MA. Combinatorial regulation and high-throughput screening provide important reference to microbial production of other bio-based chemicals.

-muconic acid, combinatorial regulation,, constitutive promoters, genome replication engineering, high throughput screening

December 21, 2015; Accepted: January 15, 2016

Qinhong Wang. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: wang_qh@tib.cas.cn

Supported by:Key Technology R&D Programof Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 14ZCZDSY00066), Research Equipment Program of Chinese Academy of Sciences (No. YZ201153).

天津市科學技術(shù)委員會科技支撐計劃重點項目 (No. 14ZCZDSY00066)，中國科學院科研裝備項目 (No. YZ201153) 資助。

宋國田, 江小龍, 陳五九, 等. 產(chǎn)順,順-粘康酸細胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化. 生物工程學報, 2016, 32(9): 1212–1223.

Song GT, Jiang XL, Chen WJ, et al. Construction and optimization of microbial cell factories for producing-muconic acid. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1212–1223.