王姝婧，陳丙友，王玉君，馮利利，夏海鋒,2

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內(nèi)含肽在構(gòu)建親和純化系統(tǒng)中的應(yīng)用

王姝婧1，陳丙友1，王玉君1，馮利利1，夏海鋒1,2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122

內(nèi)含肽是前體未成熟蛋白中的一段具有自我剪接功能的多肽鏈，在蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)連接、環(huán)肽制備、蛋白標(biāo)記以及生物傳感器等方面廣泛應(yīng)用。本文綜述了內(nèi)含肽應(yīng)用于蛋白質(zhì)親和純化的發(fā)展歷程，分別對層析型和非層析型內(nèi)含肽純化體系進行了分析和討論，并總結(jié)了對控制內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)所進行的研究，為進一步改善內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)純化提供依據(jù)和線索。

連續(xù)型內(nèi)含肽，斷裂內(nèi)含肽，親和純化系統(tǒng)，斷裂反應(yīng)

1990年，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽釀酒酵母VMA1被首次發(fā)現(xiàn)[1]。之后，隨著在不同細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)越來越多的內(nèi)含肽種類，內(nèi)含肽作為一種新的分子生物學(xué)研究手段得到了更深入的研究。因內(nèi)含肽在多肽鏈的剪接和斷裂反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，使其在對蛋白的控制及修飾作用方面的應(yīng)用也越來越廣泛。至今，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)連接、環(huán)肽制備、蛋白標(biāo)記以及生物傳感器等方面。其中，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽在蛋白純化方面的研究最為廣泛和深入?？茖W(xué)家們對不同種類的內(nèi)含肽使用多種手段進行了探索。本文以這些探索經(jīng)驗為基礎(chǔ)，對內(nèi)含肽在蛋白純化領(lǐng)域的應(yīng)用進行分析總結(jié)，為找出一種最為有效的蛋白純化途徑提供依據(jù)。

1 內(nèi)含肽簡介

蛋白質(zhì)內(nèi)含肽 (又稱蛋白質(zhì)內(nèi)含子，Intein)是前體未成熟蛋白質(zhì)中的一段多肽鏈，它通過一系列重排、轉(zhuǎn)酯、環(huán)化等自我催化的反應(yīng)過程，可以從前體蛋白中切除并將兩端的蛋白多肽鏈 (蛋白質(zhì)外顯肽，Extein) 通過一個天然的肽鍵連接，即通過蛋白質(zhì)自我剪接作用實現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重新布局[2-3]。斷裂內(nèi)含肽是內(nèi)含肽的一種結(jié)構(gòu)類型。在結(jié)構(gòu)上，它的N端區(qū)域 (本文表示為IN) 和C 端區(qū)域 (本文表示為IC) 相互分離，而當(dāng)IN和IC兩個片段連接恢復(fù)結(jié)構(gòu)后可按照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)含肽剪接途徑完成兩端外顯肽的拼接。

Perler FB將典型的蛋白質(zhì)內(nèi)含肽分為8個模塊，其中剪接結(jié)構(gòu)域中包含A、B、F、G模塊，中間的歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域則包含C、D、E、H模塊[4-5]。斷裂內(nèi)含肽不含歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，因此只包含剪接結(jié)構(gòu)域A、B、F、G模塊。這些模塊中存在一些比較保守的氨基酸殘基 (圖1)。而且，各模塊中的氨基酸一般為某一類性質(zhì)的氨基酸，尤其是疏水氨基酸，這些氨基酸殘基在剪接或剪切反應(yīng)過程中起著重要的作用[6]。例如，模塊A中首位氨基酸Cys1/Thr1/Ser1的羥基參與剪接反應(yīng)第一步的?；嘏胚^程；模塊B中的Thr-His殘基可以與主鏈原子形成氫鍵并穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，從而導(dǎo)致N端的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的發(fā)生。C端部分的模塊G的倒數(shù)第二個殘基His通過與Asn形成氫鍵，并最終導(dǎo)致C端斷裂反應(yīng)的發(fā)生。此外，一般通用的內(nèi)含肽氨基酸位點從N端開始記為1，依次直到內(nèi)含肽C端。N端外顯肽為負(fù)，與IN的N末端相連的開始記為-1。C端外顯肽為正，與IC的C末端相連的開始記為+1。

圖1 內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)模式圖[4]

內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)是一個不需要酶催化的自發(fā)進行的過程。它是經(jīng)4步親核反應(yīng)完成的，包括：1) N-S?；嘏?(Acyl rearrangement)；2) 轉(zhuǎn)酯 (Transesterification) 反應(yīng)；3) 末位氨基酸Asn環(huán)化；4) S-N?；嘏?。將內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)改造成斷裂反應(yīng)就是通過突變剪接結(jié)構(gòu)模塊中的保守氨基酸，使剪接反應(yīng)中的一部分不能進行而只能完成一端的斷裂[7]。另外，斷裂內(nèi)含肽的IN和IC具有極強的相互識別能力[8]，兩者的親和結(jié)合是斷裂反應(yīng)能夠進行的基礎(chǔ)。斷裂內(nèi)含肽在構(gòu)建親和純化系統(tǒng)中的應(yīng)用就是基于內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng)以及IN和IC片段之間親和識別結(jié)合原理實現(xiàn)的。

與其他親和純化系統(tǒng) (如免疫親和層析、金屬螯合親和層析) 相比，內(nèi)含肽介導(dǎo)的親和純化系統(tǒng)可以誘導(dǎo)斷裂反應(yīng)的發(fā)生，使其在純化的過程中除去純化標(biāo)簽并得到不含任何外來序列的目標(biāo)蛋白。同時，也避免了使用其他手段除去純化標(biāo)簽的麻煩。

2 內(nèi)含肽親和純化系統(tǒng)發(fā)展簡史

經(jīng)過對內(nèi)含肽親和純化系統(tǒng)的考察和分析，本文將內(nèi)含肽親和純化系統(tǒng)應(yīng)用的發(fā)展總結(jié)歸納為兩個時期。前期研究主要集中于對連續(xù)內(nèi)含肽在親和純化中的應(yīng)用；近期研究主要集中于斷裂內(nèi)含肽在親和純化中的應(yīng)用。

2.1 前期——連續(xù)內(nèi)含肽時期

在內(nèi)含肽應(yīng)用于純化系統(tǒng)的早期，一般使用這種連續(xù)型內(nèi)含肽作為純化輔助手段。通過氨基酸突變只保留一端斷裂活性的內(nèi)含肽，與純化標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白共同組合成前體蛋白。先借助純化標(biāo)簽將前體蛋白從雜蛋白中純化出來，再利用內(nèi)含肽一端的斷裂反應(yīng)將目標(biāo)蛋白從前體中切除并洗脫純化出來。

內(nèi)含肽在親和純化中的應(yīng)用最早在1997年。Ming等以C末端突變 (Asn454Ala) 的VMA內(nèi)含肽為基礎(chǔ)，在其C端連接CBD (Chitin binding domain) 親和標(biāo)簽并在N端連接目標(biāo)蛋白構(gòu)建純化體系進行蛋白純化[9]。VMA內(nèi)含肽是最早被發(fā)現(xiàn)的1種內(nèi)含肽。利用這種內(nèi)含肽構(gòu)建了商品化的IMPACTTM-CN (NEB) 蛋白表達純化體系。但這種內(nèi)含肽的斷裂速率較慢，對于N端斷裂反應(yīng)，23 ℃、有還原劑DTT誘導(dǎo)的條件下，達到95%的斷裂率需要16 h[9]。C端斷裂反應(yīng)速率更低。而且，VMA內(nèi)含肽分子量較大 (56 kDa)，不利于前體蛋白的可溶性表達。

后來又出現(xiàn)了經(jīng)過改造后的微小型連續(xù)內(nèi)含肽mini-產(chǎn)甲烷嗜熱桿菌RecA (mini-RecA)[10]和蟾分枝桿菌GryA (.GryA)[11]。與VMA內(nèi)含肽不同的是，這些內(nèi)含肽在N端斷裂反應(yīng)被阻止 (mini-RecA的C1A突變；GryA的-1位氨基酸突變) 的條件下，可以通過調(diào)節(jié)pH和溫度控制C端斷裂反應(yīng)的進行。在Wood等的研究中，將RecA內(nèi)含肽改造成只有18 kDa的C端斷裂型內(nèi)含肽。而且C端斷裂反應(yīng)通過調(diào)節(jié)pH和溫度控制斷裂反應(yīng)的進行，從而避免了還原劑DTT的使用。37 ℃時，12 h達到97%以上的斷裂效率[10]。此外，NEB公司還研究了1種天然的微小型連續(xù)內(nèi)含肽集胞藻屬sp. PCC 6903 DnaB (DnaB)。這種內(nèi)含肽的斷裂效率和斷裂條件與mini-RecA相似。利用這種內(nèi)含肽，NEB公司又推出了IMPACTTM-TWIN蛋白表達純化體系。

雖然對多種連續(xù)型內(nèi)含肽進行了一系列的改造及在親和純化方面的應(yīng)用研究，但在蛋白表達和前體蛋白純化過程中內(nèi)含肽提前斷裂的問題依然無法解決。因此，為了解決提前斷裂的問題，有研究將連續(xù)型內(nèi)含肽人工斷裂為兩部分并分別表達。分別表達的兩片段可以相互識別結(jié)合并完成剪接反應(yīng)，而且其反應(yīng)速率并未受到影響[12-13]。

2.2 近期——斷裂內(nèi)含肽時期

雖然斷裂內(nèi)含肽在1998年就被發(fā)現(xiàn)，但其應(yīng)用于蛋白的純化卻是從2011年才開始的。Jian 等將人工斷裂內(nèi)含肽DnaB的IN和IC分別與親和標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白相連，并分別表達。通過親和標(biāo)簽將內(nèi)含肽的一端片段 (IN或IC) 與層析介質(zhì)親和結(jié)合，再利用IN與IC之間的親和識別結(jié)合能力固定前體蛋白，然后通過誘導(dǎo)斷裂將目標(biāo)蛋白純化出來[14]。此外，根據(jù)內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)將DnaB從不同位置處斷開，還構(gòu)建了S1型和S11型DnaB斷裂內(nèi)含肽。

除了人工斷裂內(nèi)含肽，天然斷裂內(nèi)含肽在蛋白純化系統(tǒng)中的應(yīng)用也是近幾年剛剛開始的。其中研究最多的是點形念珠藻屬DnaE (DnaE)內(nèi)含肽。DnaE內(nèi)含肽與DnaB內(nèi)含肽在蛋白序列上具有較高的同源相似性而且斷裂反應(yīng)速率較快，因此，針對這2種系統(tǒng)的改造也較多。除了避免提前斷裂之外，改造后的DnaE內(nèi)含肽的斷裂速率已有較大提高，已達到5 min內(nèi)斷裂率達90%以上[15]。斷裂速率的提高也極大提高了蛋白純化系統(tǒng)的純化效率。因此，這也是一種極具前景的研究方向。

斷裂內(nèi)含肽親和純化系統(tǒng)對目標(biāo)蛋白純化的過程原理大致相似 (圖2)，主要包括：1) 配基 (斷裂內(nèi)含肽的IN或IC) 與介質(zhì)的結(jié)合形成親和層析介質(zhì)。2) 平衡，前體蛋白上樣至親和層析介質(zhì)中，IN與IC因親和作用而相互識別結(jié)合。3) 洗滌，將不能與配基識別結(jié)合的雜蛋白除去。4) 洗脫，通過改變條件誘導(dǎo)斷裂反應(yīng)的發(fā)生，獲得不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白。5) 親和層析介質(zhì)的再生，通過提高環(huán)境的pH使IN和IC失去親和作用而相互分離，還原親和層析介質(zhì)。圖2中比較了連續(xù)型內(nèi)含肽純化系統(tǒng)與斷裂內(nèi)含肽純化系統(tǒng)純化過程。

* is an amino acid mutation on N-terminal of INor C-terminal of IC;represents protein of interest;represents ligand;represents impure protein

圖2 連續(xù)型內(nèi)含肽純化系統(tǒng)(A)與斷裂內(nèi)含肽純化系統(tǒng)(B)的比較

Fig. 2 Comparison between continuous intein-mediated purification system (A) and split intein-mediated purification system (B).

3 內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化體系研究

從純化體系的類型上來劃分，可以將內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化體系分為層析型和非層析型兩類。層析型親和純化系統(tǒng)在應(yīng)用研究中占主要地位，而非層析型的研究相對較少。兩者的主要區(qū)別在于含有內(nèi)含肽的蛋白片段是否連接到層析介質(zhì)上并形成一種固相的層析體系。以下分別對這2種純化系統(tǒng)進行介紹。

3.1 層析型親和純化體系中配基與介質(zhì)的結(jié)合方式

本文大部分內(nèi)容都是基于層析型純化體系的討論，包括上文的純化體系發(fā)展歷程和下文中對斷裂反應(yīng)控制的研究。因此，我們主要介紹層析型純化體系中配基與介質(zhì)的結(jié)合方式。

對基于層析介質(zhì)的親和純化體系，配基與介質(zhì)的結(jié)合強度決定著親和介質(zhì)可以重復(fù)使用的次數(shù)。對斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的親和純化體系，我們可以將親和標(biāo)簽和與其相連的IN或IC片段作為整體并視為一種親和配基。將一段多肽鏈與介質(zhì)結(jié)合，其結(jié)合方式不同結(jié)合的強度也不同，從而影響了配基在介質(zhì)上的穩(wěn)定性。因此，在討論內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)的控制之前，配基與介質(zhì)的偶聯(lián)方式也是一個重要的問題。

多數(shù)研究中采用CBD純化標(biāo)簽與Chitin介質(zhì)親和結(jié)合的形式，將一端連有CBD標(biāo)簽的斷裂內(nèi)含肽配基與介質(zhì)結(jié)合[14, 16-17]。這種方法的成本較低，但由于結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性較低，配基很容易從介質(zhì)上脫落，造成目標(biāo)蛋白污染，同時也降低了介質(zhì)重復(fù)使用次數(shù)。Chen等使用此方法證明，親和層析介質(zhì)的有效純化次數(shù)在4次左右[17]。此外，可以使用特異性和穩(wěn)定性較好的His標(biāo)簽與Ni的親和結(jié)合，但這一層析介質(zhì)會受到還原劑、二價金屬離子等多種條件的影響。在斷裂內(nèi)含肽相互結(jié)合發(fā)生斷裂反應(yīng)的過程中這些因素?zé)o法避免，也就阻礙這種方法的應(yīng)用。

在最近的研究中，有采用共價偶聯(lián)的方式將配基連到介質(zhì)上。這種方法在內(nèi)含肽的末端添加1個Cys，利用Cys的巰基對介質(zhì)上的活化基團進行親核攻擊，形成共價連接。這種方法制備的親和層析介質(zhì)的配基較穩(wěn)定，但其偶聯(lián)后的配基與內(nèi)含肽的另一端的結(jié)合能力以及斷裂反應(yīng)速率都有可能降低。

3.2 內(nèi)含肽介導(dǎo)的非層析介質(zhì)親和純化系統(tǒng)

非層析的親和純化系統(tǒng)借助一種非層析蛋白純化標(biāo)簽，它與內(nèi)含肽的IN或IC一起作為控制蛋白的分子開關(guān)，通過條件控制達到純化目標(biāo)蛋白的目的。

ELP (Elastin like polypeptide) 標(biāo)簽是應(yīng)用最多的1種非層析蛋白純化標(biāo)簽。它是一段含有VPGXG (X為除Pro之外的任何氨基酸) 多重復(fù)肽鏈，且其是1種溫度敏感型蛋白。當(dāng)溫度高于一定的閾值時會發(fā)生聚集反應(yīng)，而當(dāng)溫度低于這個閾值其又會重新溶解。含有ELP標(biāo)簽的融合蛋白也可以簡單地通過幾步溫度轉(zhuǎn)變純化得到。因此，目標(biāo)蛋白與IN或IC的融合蛋白可以借助于非層析標(biāo)簽純化得到，再通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子的自我斷裂將目的蛋白從融合蛋白中釋放[18]。

施長華等將RecA斷裂成N端和C端2個片段并分別與ELP標(biāo)簽融合，目標(biāo)蛋白融合于C端片段末端。在此模型中，含有目的蛋白和ELP標(biāo)簽的C端融合蛋白為前體蛋白，而蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端與ELP標(biāo)簽融合蛋白則是1個分子開關(guān)蛋白[19]。ELP純化標(biāo)簽可以使2個蛋白片段通過改變溫度的手段在體外條件下分別純化得到。然后，在體外添加N端分子開關(guān)蛋白則可激活蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端斷裂活性并最終端釋放目的蛋白。

另外，施長華等還構(gòu)建了一種利用小肽控制的基于S1型斷裂內(nèi)含肽的非層析蛋白親和純化系統(tǒng)[20]。此系統(tǒng)將小肽控制的斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)和非層析標(biāo)簽ELP的功能相結(jié)合，含有缺失N端11個氨基酸的內(nèi)含肽與ELP的融合蛋白在體內(nèi)沒有斷裂活性，表達過程中前體蛋白得到了很好的保留。表達通過ELP標(biāo)簽可純化得到前體蛋白，然后通過添加N端11個氨基酸的小肽誘導(dǎo)內(nèi)含肽發(fā)生C端斷裂并得到目的蛋白。

這種不基于層析介質(zhì)的純化方法可以避免層析介質(zhì)與配基蛋白片段結(jié)合的不穩(wěn)定而造成的蛋白脫落。同時，IN與IC在體外條件下的結(jié)合作用更強，可以減少目標(biāo)蛋白中出現(xiàn)的未斷裂的前體蛋白。這種新型的純化手段為解決內(nèi)含肽提前斷裂的問題提供了一種新思路。

4 對內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)的控制

迄今為止，已經(jīng)有多種內(nèi)含肽應(yīng)用于構(gòu)建親和純化系統(tǒng)。不同內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng)速率和條件會導(dǎo)致純化效率不同。因此，本文對應(yīng)用于親和純化系統(tǒng)的內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)特性進行了比較 (表1)。早期發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含肽一般C端斷裂反應(yīng)速率較慢、反應(yīng)時間長，而N端斷裂又需要高濃度的硫醇還原劑[22]。而且，對于連續(xù)型內(nèi)含肽，其表達過程中的提前斷裂無法避免。因此，提高連續(xù)型內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng)速率、阻止提前斷裂是研究的關(guān)鍵。最近的一些研究采用了將一段連續(xù)的內(nèi)含肽人為分為兩部分，雖然這種方法在抑制提前斷裂方面有作用，但分開后的兩片段親和力較差[23]。而自然斷裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)解決了內(nèi)含肽在體外重組效率較低的問題，對內(nèi)含肽親和純化領(lǐng)域的應(yīng)用產(chǎn)生了重要的影響，但同時也存在斷裂速率不可控制的問題。針對以上內(nèi)含肽在應(yīng)用中存在的問題，以下將具體討論內(nèi)含肽應(yīng)用于親和純化時對內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)進行的改造研究。

表1 用于構(gòu)建親和純化系統(tǒng)的內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)特性比較[17,21]

4.1 內(nèi)含肽序列的改造

用于構(gòu)建商品化IMPACT-TWIN的內(nèi)含肽GyrA是一種應(yīng)用于連續(xù)型內(nèi)含肽。這種純化體系中內(nèi)含肽的提前斷裂問題是影響蛋白產(chǎn)量的關(guān)鍵。由于斷裂反應(yīng)需要內(nèi)含肽首位氨基酸為帶有自由巰基的Cys，因此，有研究通過突變內(nèi)含肽內(nèi)部的2個氨基酸為Cys，使其與首位氨基酸Cys之間形成二硫鍵，從而抑制斷裂反應(yīng)提前進行[24]。

鑒于天然斷裂內(nèi)含肽的斷裂位置，很多連續(xù)型內(nèi)含肽被改造成斷裂內(nèi)含肽 (斷裂位點為歸巢核酸內(nèi)切酶區(qū)域，稱為S0型)。人工斷裂內(nèi)含肽的應(yīng)用以DnaB最為典型。DnaB是由12個β-sheet組成的馬蹄形結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，靠近剪接活性區(qū)域兩端的新型斷裂內(nèi)含肽在近幾年也被成功構(gòu)建。如前11位氨基酸發(fā)生斷裂的S1型斷裂內(nèi)含肽 (第2個與第3個β-sheet之間發(fā)生斷裂)[25]，以及在微小內(nèi)含肽末6 位斷裂的S11型斷裂內(nèi)含肽 (第11和12個β-sheet之間發(fā)生斷裂)[26]。這些基于DnaB的斷裂內(nèi)含肽的斷裂速率與連續(xù)型內(nèi)含肽相當(dāng)，25 ℃、16 h斷裂率約為90%。另外，DnaB S1型斷裂內(nèi)含肽可以將N端11個氨基酸的小肽在體外合成，并添加到C端片段的前體蛋白中誘導(dǎo)斷裂。但這種方法的成本較高。

另一種斷裂內(nèi)含肽純化系統(tǒng)是以DnaE為基礎(chǔ)構(gòu)建的。與DnaB不同的是，如果DnaE的N端斷裂反應(yīng)被阻止那么C端斷裂反應(yīng)也無法進行[16,27]。Chen等根據(jù)同源性相近的內(nèi)含肽DnaE與mini-RecA之間的序列比對和分子建模，確定DnaE的Asp118是阻止C端斷裂反應(yīng)的關(guān)鍵因素[15]。將DnaE的Asp118突變?yōu)镚ly后，便解除了N端突變后對C端斷裂反應(yīng)的抑制。經(jīng)改造后的DnaE內(nèi)含肽的C端斷裂反應(yīng)速率較快，在室溫、DTT的條件下，3 h斷裂反應(yīng)完成80%。

4.2 空間位阻對斷裂反應(yīng)的作用

對斷裂型內(nèi)含肽來說，IN和IC兩端連接肽鏈的大小對斷裂反應(yīng)速率也有影響。根據(jù)對DnaE內(nèi)含肽IN和IC相互識別結(jié)合作用方式的分析，如果多肽鏈分別位于IN和IC的兩端 (即N端和C端)，此時空間位阻最大，斷裂反應(yīng)速率就會下降 (圖3)。Chen等將位于INN端的親和標(biāo)簽移動到C端，這樣就降低了IN和IC親和結(jié)合時的空間位阻，使斷裂反應(yīng)速率大大提高——在室溫、DTT的條件下，30 min就可以完成全部的斷裂反應(yīng)[17]。

圖3 基于斷裂反應(yīng)空間位阻改造后的斷裂內(nèi)含肽純化系統(tǒng)

目前，內(nèi)含肽空間位阻對斷裂反應(yīng)速率的影響只在DnaE內(nèi)含肽的基礎(chǔ)上嘗試應(yīng)用過。按照其相互作用方式推測，這種思路也應(yīng)同樣適用于其他種類的內(nèi)含肽中。

4.3 Zn2+對斷裂反應(yīng)的抑制

如果內(nèi)含肽兩片段識別結(jié)合后的斷裂反應(yīng)速率很快并且不可控制，會導(dǎo)致在層析純化中前體蛋白與配基結(jié)合后就會發(fā)生斷裂，目標(biāo)蛋白隨雜蛋白被洗下，從而會導(dǎo)致純化效率降低。因此，在提高內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)速率的同時需要確定可控斷裂的反應(yīng)條件。

在蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)晶體解析過程中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽PI-SceI的C端剪接區(qū)域存在一個Zn2+結(jié)合區(qū)域[27]。隨后Paulus等證明Zn2+可以抑制內(nèi)含肽RecA和DnaE的剪接反應(yīng)，并且在較低的濃度下就可達到完全抑制內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)。Evans等進一步研究了Zn2+對DnaE的剪接與斷裂反應(yīng)的影響[28]。盡管在多種內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)中都發(fā)現(xiàn)了Zn2+結(jié)合區(qū)域，但這些結(jié)合區(qū)域卻不完全一樣。例如在DnaE中Zn2+的結(jié)合區(qū)域是由His48、Asp140、His110以及+1 Cys組成[29]，而RecA中Zn2+的結(jié)合區(qū)域則是由His429、Glu424、Asn440以及相鄰分子的His439組成[30]。此外，Zn2+對內(nèi)含肽剪接反應(yīng)的抑制主要是通過影響蛋白質(zhì)剪接過程中的電荷傳遞，從而最終使剪接反應(yīng)無法順利進行[31]。雖然內(nèi)含肽與Zn2+的結(jié)合非常牢固，但這種結(jié)合力卻不如金屬螯合劑 (例如EDTA) 與Zn2+的結(jié)合能力強，因此可通過金屬螯合劑將Zn2+從內(nèi)含肽中去除以恢復(fù)剪接反應(yīng)[32]。此外，除Zn2+外的其他二價金屬離子也有抑制內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)的作用，例如Cu2+、Ni2+、Mg2+等，但它們的抑制效率低于Zn2+[33]。

雖然Zn2+對內(nèi)含肽RecA和DnaE的剪接反應(yīng)有抑制效果，但實驗表明，對于改造后的斷裂內(nèi)含肽DnaE體系Zn2+的抑制效果并不明顯。而且，Zn2+濃度過高 (大于2.5 mmol/L)很容易導(dǎo)致蛋白沉淀。因此，對于斷裂內(nèi)含肽在親和純化系統(tǒng)的應(yīng)用方面，Zn2+對不同內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)的控制還需要更多的研究。

5 結(jié)論與展望

應(yīng)用于親和純化系統(tǒng)的內(nèi)含肽已從起初的連續(xù)型內(nèi)含肽發(fā)展為改造的斷裂內(nèi)含肽，從需要其他親和純化手段的輔助到形成獨立的系統(tǒng)。從其發(fā)展的方向來看，斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的快速且具有自發(fā)除去親和標(biāo)簽功能的親和純化系統(tǒng)的應(yīng)用前景最為廣闊；同時，這種新型親和純化系統(tǒng)的構(gòu)建需要對斷裂內(nèi)含肽的反應(yīng)進行控制。當(dāng)前對于內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)控制方面的研究還遠遠不足。如果能夠找到一種在一定誘導(dǎo)條件下能快速發(fā)生斷裂，并且在一定控制條件下能完全抑制斷裂的內(nèi)含肽及其控制手段，那么將對內(nèi)含肽在親和純化系統(tǒng)中的應(yīng)用帶來極大的進步；將非層析標(biāo)簽與斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)相結(jié)合構(gòu)建的非層析內(nèi)含肽親和純化系統(tǒng)的研究雖然不多，但這種新型的純化手段為解決內(nèi)含肽提前斷裂的問題提供了一種新思路，也具有廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Application of inteins in building protein affinity purification system

Shujing Wang1, Bingyou Chen1, Yujun Wang1, Lili Feng1, and Haifeng Xia1,2

1,,,,214122,,National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation TechnologyJiangnan UniversityWuxiJiangsuChina

Intein is a part of polypeptide in the premature protein with the capability of self-splicing, which is widely applied in protein purification, protein conjuction, cyclopeptide preparation, protein labeling and biosensor. In this review, we summarized the development of intein used in protein purification, discussed intein-mediated chromatographic and non-chromatographic purification systems, and summarized the researches in manipulating intein cleavage reaction. This work is to provide clues for improvement of intein-mediated protein purification.

continuousinteins, split inteins, affinity purification system, cleavage reaction

December 22, 2015; Accepted: March 18, 2016

Haifeng Xia. Tel/Fax: +86-510-85197123; E-mail: hfxia@jiangnan.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21206054), National Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20151123), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51401A).

國家自然科學(xué)基金(No. 21206054)，江蘇省自然科學(xué)基金(No. BK20151123)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金 (No. JUSRP51401A) 資助。

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