楊翰林，張 達(dá)，張 群，薛 光，田萬(wàn)年

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

牛RPLP1基因的克隆和生物信息學(xué)分析

楊翰林，張 達(dá)，張 群，薛 光，田萬(wàn)年

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

采用RT-PCR法克隆牛RPLP1基因，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，應(yīng)用半定量RT-PCR方法對(duì)該基因的組織表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，牛RPLP1基因全長(zhǎng)為502 bp，包含345 bp的編碼區(qū)序列，編碼114個(gè)氨基酸；拓?fù)漕A(yù)測(cè)表明，RPLP1蛋白可能存在3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)，含有一個(gè)Ribosomal-P1保守結(jié)構(gòu)域；牛RPLP1基因在多種組織中均表達(dá)，在骨骼肌、肝臟和心肌中表達(dá)量較高。

克??；RPLP1基因；牛；生物信息學(xué)；半定量RT-PCR

核糖體是蛋白質(zhì)的翻譯場(chǎng)所，研究核糖體對(duì)于了解基因表達(dá)在翻譯水平的調(diào)節(jié)非常重要［1］。大量研究表明，核糖體蛋白不僅參與核糖體的蛋白質(zhì)合成，而且還在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)以及細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育調(diào)控等方面發(fā)揮作用［2-4］。核糖體是一個(gè)致密的核糖體蛋白顆粒，可離解為2個(gè)亞基，2個(gè)亞基的形態(tài)具有不規(guī)則性和不對(duì)稱性。酸性核糖體磷酸蛋白P1（acidic ribosomal protein，large，P1，RPLP1）是組成核糖體大亞基的蛋白成分之一。研究表明，RPLP1與RPLP0、RPLP2及28S rRNA保守區(qū)相互作用，組成了核糖體GTP酶活性中心的主要部分，RPLP1蛋白還可與泛素共價(jià)結(jié)合形成融合蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)錄等重要活動(dòng)［5-6］。該研究應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)延邊黃牛的RPLP1基因進(jìn)行克隆，利用生物學(xué)軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，以期為深入研究該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 選用吉林省琿春吉星牧業(yè)28月齡延邊黃牛閹牛。屠宰后采集血液、背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、瘤胃和小腸，采集的樣本一部分置于液氮中速凍，-70℃保存，一部分保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成：采集牛背最長(zhǎng)肌樣本，用Trizol提取肌肉總RNA。將提取的RNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量，所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0。cDNA合成總反應(yīng)體系為20 μL：總 RNA 2 μg、10×buffer 4 μL、dNTP （2.5 mmol/L）、Oligo（dT15）2 μL、RNase 抑制劑 0.5 μL、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增：根據(jù)已發(fā)表的牛RPLP1基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物序列：5′-CTGCCGCTAAGGTGCTCGGTT-3′，下游引物序列：5′-AACAGCTCAGCTTTTTATTCAAT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為502 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠純化PCR產(chǎn)物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 組織表達(dá)譜分析：按照上述方法分別提取延邊黃牛背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、瘤胃和小腸組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)牛RPLP1基因設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5′-CTTTGCTTCTACTTTCTTCTCCTC-3′，下游引物序列：5′-TGTAAATGTTGAGCCTTTCTGG-3′， 預(yù)期擴(kuò)增片段大小為184 bp，同時(shí)根據(jù)牛β-actin基因設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5′-ATTTCTGTCTTGGCCGG TCT-3′，下游引物序列：5′-TCAAGGCAAGTAACCA GAACAC-3′，對(duì)PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛RPLP1基因的克隆和序列分析 以牛背最長(zhǎng)肌提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為502 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。牛RPLP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 牛RPLP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 牛RPLP1基因生物信息學(xué)分析 ORF Finder軟件分析結(jié)果表明，該基因的最大開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）為 345 bp，編碼 114 個(gè)氨基酸。經(jīng)SignalP Server軟件分析，該蛋白無(wú)信號(hào)肽序列，為非分泌性蛋白。采用DNA man軟件對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明該基因編碼的蛋白分子質(zhì)量約為11.51 ku，等電點(diǎn)為3.95，為酸性蛋白。Prosite軟件分析結(jié)果顯示，RPLP1可能存在3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)牛RPLP1含有一個(gè)Ribosomal-P1保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 牛RPLP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.3 牛RPLP1基因組織表達(dá)譜分析 采用半定量RT-PCR分析RPLP1基因在牛不同組織器官中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，RPLP1基因在各個(gè)組織中均表達(dá)，其中在肌肉、肝臟和心臟中表達(dá)量較高（見(jiàn)圖 3）。

圖3 牛RPLP1基因的組織表達(dá)譜

3 討論

目前，RPLP1基因在人、豬、小鼠和大鼠等物種中被克隆，在其功能研究方面主要認(rèn)為其與蛋白質(zhì)合成有關(guān)，但其具體功能研究較少。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，RPLP1表達(dá)水平與延邊黃牛背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系［7］，提示該基因可能與牛的肉質(zhì)性狀相關(guān)。該研究在此基礎(chǔ)上應(yīng)用RT-PCR方法成功克隆了牛RPLP1基因完整編碼區(qū)序列，包含345 bp的開(kāi)放閱讀框，其編碼114個(gè)氨基酸。應(yīng)用生物學(xué)信息學(xué)方法對(duì)其序列及編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，RPLP1可能存在3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)牛RPLP1含有一個(gè)Ribosomal-P1保守結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，RPLP1基因在牛肌肉、心臟和肝臟中表達(dá)量較高，提示該基因可能與牛肌肉分化相關(guān)。研究結(jié)果有利于對(duì)牛RPLP1蛋白的功能進(jìn)行深入研究，對(duì)進(jìn)一步利用該基因改良牛的經(jīng)濟(jì)性狀具有重要意義。

［1］黃濤.雜種大白×梅山F1代與其母本梅山豬背最長(zhǎng)肌間差異表達(dá)基因的克隆鑒定及其特征分析［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［2］CHEN F W，LOANNOU Y A.Ribosomal proteins in cellproliferation and apoptosis［J］.Int Rev Immunol，1999，18（5/6）：129-448.

［3］NAORA H.Involvementofribosomalproteinsin regulating cell growth and apoptosis：translational modulation or recruitment for extraribosomal activity?［J］.Immunol Cell Biol，1999，77（3）：197-205.

［4］WOOL I G，CHAN Y L，GLUCK A.Structure and evolution of mammalian ribosomal proteins ［J］.Biochem Cell Biol，1995，73：933-947.

［5］SHIMIZU T，NAKAGAKI M，NISHI Y，et al.Interaction among silkworm ribosomal proteins P1，P2 and P0 required for functional protein binding to the GTPase-associated domain of 28S rRNA ［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（12）：2620-2627.

［6］ARCHIBALD J M，TEH E M，KEELING P J.Novel ubiquitin fusion proteins：ribosomal protein P1 and actin［J］.J Mol Biol，2003，328（4）：771-778.

［7］田萬(wàn)年，張守發(fā)，李香子，等.延邊黃牛背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的篩選、 克隆及序列分析 ［J］.遺傳，2011，33（11）：1219-1224.

Cloning and Bioinformatics Analysis of the RPLP1 Gene in Cattle

YANG Han-lin，ZHANG Da，ZHANG Qun，XUE Guang，TIAN Wan-nian
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural Science and Technology University，Jilin 132101，China）

In the present study,the RPLP1 gene was cloned by RT-PCR assay and was subsequently bioinformatically analyzed with bioinformatics analysis software,and the tissue expression profile of this gene was determined by semi-quantitative RT-PCR method.The results showed that cattle RPLP1 gene was composed of 502 nucleotides,including a single open reading frame of 345 bp which encoded 114 amino acids;topology prediction analysis showed that there were three casein kinaseⅡphosphorylation sites,two N-myristoylation sites and one Ribosomal-P1 conserved domain in RPLP1 protein;semi-quantitative RT-PCR assay showed that RPLP1 gene was widely expressed,and high expression was observed in skeletal,liver and cardiac muscle.

cloning；RPLP1 gene；cattle；bioinformatics；semi-quantitative RT-PCR

S823.812；Q78

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）10-0008-02

2016-09-25

項(xiàng)目來(lái)源：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字［2015］第 052 號(hào)）。

楊翰林（1996—），男，所學(xué)專業(yè)為野生動(dòng)物與自然保護(hù)區(qū)管理。

田萬(wàn)年（1980—），男，講師，博士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物分子遺傳育種。

（責(zé)任編輯：趙俊利）