包圖雅，白薩日娜，楊燕燕，納仁高娃

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

雌激素上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素-2基因表達(dá)中GPR30信號(hào)途徑的研究

包圖雅1，白薩日娜1，楊燕燕2，納仁高娃1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

［目的］探討 G 蛋白偶聯(lián)受體 30（G Protein-Coupled Receptor 30，GPR30）在 17β-雌二醇（E2）上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2基因表達(dá)過(guò)程中的作用。［方法］將GPR30激動(dòng)劑G1（10-7mol/L）和17β-雌二醇（10-6mol/L）加入到第2代的綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中，培養(yǎng)6、12和24 h，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技術(shù)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)綿羊 β-防御素-2（sheep β-defensin-2，SBD-2）基因的表達(dá)量變化。［結(jié)果］與對(duì)照組相比較，G1和雌激素共同作用6 h后，綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2基因的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），同時(shí)還具有明顯的時(shí)間效應(yīng)。［結(jié)論］雌激素上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-2基因表達(dá)的膜受體途徑是由GPR30介導(dǎo)的。

G蛋白偶聯(lián)受體30；雌激素；輸卵管上皮細(xì)胞；β-防御素-2；雌激素膜受體途徑

防御素是一類(lèi)具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，并且具有調(diào)節(jié)體內(nèi)黏膜免疫的功能。哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)內(nèi)分布著大量防御素，是生殖道黏膜免疫中的重要防御因子，可抵御生殖道的上行感染，對(duì)維持正常生殖系統(tǒng)微生物環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及妊娠的成功均起關(guān)鍵作用。雌性動(dòng)物體內(nèi)中一種作用廣泛的類(lèi)固醇類(lèi)激素雌激素對(duì)生殖系統(tǒng)中防御素的表達(dá)存在著一定的相關(guān)性。有研究表明，生殖道防御素的表達(dá)與雌性動(dòng)物的生理周期有關(guān)，并且雌激素是促進(jìn)生殖道內(nèi)防御素表達(dá)的因素之一［1-3］。雌激素發(fā)揮效能的信號(hào)途徑主要是雌激素核受體介導(dǎo)的。但近年研究發(fā)現(xiàn)了雌激素效能發(fā)揮的快速非基因組效應(yīng)，即雌激素膜受體途徑，有證據(jù)表明［4-7］雌激素膜受體存在并可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體30（G Protein-Coupled Receptor 30，GPR30）來(lái)迅速激活細(xì)胞內(nèi)的第二信號(hào)系統(tǒng)［8］，進(jìn)一步間接調(diào)控了一系列的基因轉(zhuǎn)錄，并可在多種細(xì)胞類(lèi)型中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

GPR30是否是雌激素促進(jìn)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素基因表達(dá)的非基因組調(diào)控過(guò)程中的膜受體未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。該文探討了雌激素上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)β-防御素-2基因（sheep βdefensin-2，SBD-2）表達(dá)中GPR30在雌激素膜受體信號(hào)通路中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 綿羊輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 待第1代綿羊輸卵管上皮細(xì)胞匯合至80%～90%后，棄去DMEM/F12（美國(guó)GIBICO公司）培養(yǎng)液，經(jīng)PBS（含雙抗）洗1～2次，37℃預(yù)熱的0.05%胰酶-0.02%EDTA消化5～10 min，加含有20%的胎牛血清（天津澣洋生物公司）培養(yǎng)液來(lái)終止消化，在1 000 r/min條件下離心5 min，移液器反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，并放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

表1 引物

圖1 SBD-2測(cè)序結(jié)果

1.2 細(xì)胞干預(yù)試驗(yàn) 待第2代綿羊輸卵管上皮細(xì)胞75%匯合后，換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為G1（德國(guó)Merck公司）組與對(duì)照組。將G1（10-7mol/L）加入細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)1 h后再添加17β-雌二醇（10-6mol/L），混勻后分別培養(yǎng) 6、12 和 24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)相應(yīng)的對(duì)照組，并且在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采用極速抽提試劑盒FASTAGEN-RNAfast 200（上海飛捷生物公司），按操作說(shuō)明提取各組細(xì)胞總RNA。

1.3 cDNA的制備 采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（大連寶生物工程公司）試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為 10 μL：Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，5 ×Prime Script Buffer 2 μL，Oligo dT Primer （50 μmol/L）0.5 μL，Random 6 mers（ 100 μmol/L）0.5 μL，Total RNA6.5 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)85℃5 s。

1.4 qPCR 以反轉(zhuǎn)錄 cDNA產(chǎn)物作為模板，用SYBR Premix Ex TaqTMKit（大連寶生物工程公司）進(jìn)行qPCR反應(yīng)體系20 μL的擴(kuò)增:Template cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL， 上、 下游引物（見(jiàn)表 1）各 0.4 μL，無(wú)菌水 7.2 μL。

PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性 10 s，63℃退火 20 s，72℃延伸 10 s，82℃讀板，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物送至大連寶生物公司進(jìn)行基因序列的測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果SBD-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算使用2-△Ct公式來(lái)計(jì)算，其中△Ct=（目的基因 Ct值-β-actin Ct值）［9］。 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±S）進(jìn)行表示。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19中的Least Significant Difference（LSD）程序中的單因子方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的序列測(cè)定 SBD-2 qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。測(cè)序后經(jīng)DNAStar軟件分析，與綿羊β-防御素-2（SBD-2）的cDNA序列一致，為目的產(chǎn)物。因此，所設(shè)計(jì)的引物可以用于SBD-2基因表達(dá)量的檢測(cè)。

2.2 qPCR擴(kuò)增曲線與熔解曲線 SBD-2和βactin的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2和圖3。由圖2和圖3可知，呈現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)曲線特征，擴(kuò)增效果良好。SBD-2和β-actin的熔解曲線見(jiàn)圖4和圖5。由圖4和圖5可知在Tm值為83.5℃和88.5℃時(shí)出現(xiàn)了單一峰，各主峰的Tm值均與擴(kuò)增產(chǎn)物的理論Tm值相近，并且均無(wú)雜峰，表明qPCR產(chǎn)物為SBD-2和β-actin基因的特異性產(chǎn)物。

2.3 G1對(duì)E2上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2 mRNA表達(dá)的影響 如圖6所示，G1對(duì)E2上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2 mRNA表達(dá)有明顯的時(shí)間效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)添加G1和E2共同處理6 h后，G1組SBD-2 mRNA的表達(dá)量就顯著增加，與對(duì)照組的SBD-2 mRNA的表達(dá)量比較差異極顯著 （P＜0.01）。細(xì)胞內(nèi)添加G1處理12 h與24 h后，G1組SBD-2 mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。隨著G1處理細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，G1對(duì)細(xì)胞內(nèi)SBD-2 mRNA的表達(dá)量影響呈下降趨勢(shì)。

圖2 SBD-2擴(kuò)增曲線圖

圖3 β-actin擴(kuò)增曲線圖

圖4 SBD-2熔解曲線

圖5 β-actin熔解曲線

圖6 G1對(duì)E2上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-2 mRNA表達(dá)量的影響

3 討論

雌激素作用靶細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有雌激素核受體途徑（即基因組途徑）和雌激素膜受體途徑即（非基因組途徑）。GPR30作為一種膜結(jié)合的雌激素受體，在細(xì)胞中缺少雌激素受體ERα和ERβ時(shí)介導(dǎo)了雌激素對(duì)靶細(xì)胞的快速效應(yīng)。有研究表明GPR30作為雌激素膜受體在生殖系統(tǒng)的功能發(fā)揮和發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用［10］。雌激素對(duì)生殖領(lǐng)域中防御素的表達(dá)存在著一定的相關(guān)性?；谝陨媳尘埃撗芯刻接懥舜萍に貙?duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-2基因表達(dá)的膜受體途徑是否由GPR30所介導(dǎo)。

E2上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2 mRNA基因表達(dá)作用可能是通過(guò)由GPR30介導(dǎo)的雌激素膜受體途徑和雌激素核受體途徑，為了區(qū)分開(kāi)E2上調(diào)SBD-2 mRNA基因表達(dá)調(diào)控中哪一條是主效通路，以及GPR30在E2上調(diào)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2 mRNA表達(dá)中所起到的作用，選擇3個(gè)處理時(shí)間段 （6、12、24 h）在細(xì)胞處理組中添加了GPR30選擇性激動(dòng)劑G1。結(jié)果顯示，G1和E2共同處理細(xì)胞6 h后，G1組SBD-2 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組SBD-2 mRNA的表達(dá)量，差異極顯著（P＜0.01），表明 GPR30介導(dǎo) E2調(diào)節(jié)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中的SBD-2 mRNA表達(dá)量的作用較迅速，GPR30介導(dǎo)了雌激素對(duì)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞SBD-2調(diào)節(jié)表達(dá)信號(hào)通路的膜受體途徑。而隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，G1激活E2上調(diào)SBD-2 mRNA表達(dá)量作用趨勢(shì)逐漸減小，在12 h時(shí)G1組中SBD-2 mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組中SBD-2 mRNA表達(dá)量，但表達(dá)差異不顯著（P＞0.05，而在細(xì)胞處理24 h后G1組SBD-2 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組SBD-2 mRNA表達(dá)量基本持平。由此表明E2調(diào)節(jié)綿羊輸卵管上皮細(xì)胞中SBD-2 mRNA的表達(dá)在6 h之前主要是由雌激素膜受體途徑介導(dǎo)，而6 h后主要由雌激素核受體介導(dǎo)了E2對(duì)SBD-2 mRNA的調(diào)節(jié)作用。

雌激素可作用于膜受體GPR30，并激活細(xì)胞內(nèi)第二信號(hào)系統(tǒng)［4-7］，以上研究結(jié)果表明，E2引起綿羊輸卵管上皮細(xì)胞內(nèi)第二信號(hào)系統(tǒng)SBD-2基因的轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)量的增加，這一效應(yīng)可能與GPR30介導(dǎo)的非基因效應(yīng)有關(guān)。研究結(jié)果為應(yīng)用GPR30激動(dòng)劑作用雌激素相關(guān)藥物調(diào)節(jié)受感染器官的防御素表達(dá)，以及深入研究雌激素或其他調(diào)控因子對(duì)防御素表達(dá)的影響機(jī)制提供基礎(chǔ)，并且對(duì)綿羊生殖道疾病的預(yù)防等也具有一定理論價(jià)值與意義。

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Estrogen Up-regulates β-defensin-2(SBD-2)Expression in Ovine Oviduct Epithelial Cells via GPR30 Signaling Pathway

BAO Tuya1，BAI Sarina1，YANG Yan-yan2，Narengaowa1
（1.College of Basic Medical Sciences，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot010031，China）

［Objective］To assess the roles of G protein-coupled receptor 30（GPR30） in the up-regulatory effects of 17βestrodiol （E2） on β-defensin-2（SBD-2） expression in ovine oviduct epithelial cells.［Methods］The 2ndpassage ovine oviduct epithelial cells were treated with GPR30 agonist G1（10-7mol/L）and E2（10-6mol/L）for 6,12,24 h,respectively.Quantitative real-time PCR（qPCR） was used to evaluate the expression of SBD-2 gene in different observation time points.［Results］Compared with control group,the expression of SBD-2 gene in ovine oviduct epithelial cells was significantly up-regulated（P＜0.01） at the 6thhour of co-treatment of G1 and E2,expressing an obvious time effect.［Conclusion］The GPR30 mediates the membrane receptor signaling pathway involved in SBD-2 gene expression up-regulation in ovine oviduct epithelial cells induced by estrogen.

GPR30；estrogen；oviduct epithelial cells；SBD-2；estrogen membrane receptor signaling pathway

S826；Q579.13

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）10-0004-04

2016-09-15

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014BS0801）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)校級(jí)教學(xué)改革研究項(xiàng)目（NYJXG 2016072）。

包圖雅（1978—），女，副教授，博士，主要從事組織胚胎學(xué)與分子生物學(xué)研究工作。

納仁高娃（1977—），女，副教授，博士，主要從事疼痛醫(yī)學(xué)與蒙藥學(xué)研究工作。

（責(zé)任編輯：錢(qián)英紅）