武瑩瑩，李夢云，宋格格，閆小蘭，張克喆，王 剛

（河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471023）

激動素對衰老模型小鼠免疫力的影響研究

武瑩瑩，李夢云，宋格格，閆小蘭，張克喆，王 剛

（河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471023）

為研究激動素（Kn）對衰老模型小鼠免疫力的影響，將50只昆明系小白鼠隨機(jī)分為衰老模型對照組、激動素處理組（低、中、高劑量組）、青年對照組，每組10只，雌雄各半。衰老模型對照組、激動素處理組小鼠背部皮下連續(xù)45 d注射D-半乳糖［125 mg/（kg·BW）］制備衰老模型，1次/d。試驗(yàn)第11天時，低、中、高劑量激動素處理組小鼠分別腹腔注射5、10、20 mg/（kg·BW）的激動素溶液，1次/d，直至第45天；同時期內(nèi)衰老模型對照組和青年對照組小鼠頸背部皮膚注射生理鹽水。試驗(yàn)結(jié)束時，計(jì)算各組小鼠脾指數(shù)，檢測脾臟SOD、CAT、GSH-PX活性及MDA含量，檢測血清IL-2、IL-6以及IgA、IgG、IgM含量。結(jié)果表明，經(jīng)激動素處理后，小鼠的脾指數(shù)顯著或極顯著高于衰老模型對照組（P<0.05或P<0.01）；3種抗氧化酶活性與衰老模型對照組相比有所提高，其中高劑量組的提高作用最為顯著（P<0.01）；代謝物MDA含量顯著或極顯著低于衰老模型對照組（P<0.05或P<0.01）；血清IL-2含量顯著或極顯著高于衰老模型對照組（P<0.05或P<0.01），血清IL-6含量顯著或極顯著低于衰老模型對照組（P<0.05或P<0.01），3種血清球蛋白含量與衰老模型對照組相比均有所提高，其中高劑量組的提高作用最為顯著（P<0.01）。綜上提示，激動素具有顯著的延緩衰老、抗氧化損傷、提高免疫力的作用。

激動素；衰老；小鼠；脾臟；免疫力

機(jī)體衰老后各個系統(tǒng)的組織器官會發(fā)生不同 程度的功能下降和萎縮，如皮膚松弛、毛發(fā)變白、記憶力降低、免疫應(yīng)答能力下降等［1］。目前，全世界已進(jìn)入老齡化社會，衰老和抗衰老問題成為目前學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。激動素（kinetin，Kn）是首個被發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、抗氧化和抗衰老作用的嘌呤類衍生物［2-3］。綜合國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，激動素作為腺嘌呤類衍生物的代表，已成為抗氧化、抗衰老領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。激動素不僅在植物上有廣泛的應(yīng)用，在動物界也有關(guān)于其抗氧化損傷和抗衰老作用方面的研究，多數(shù)集中于動物的心臟、肝臟、睪丸、卵巢、子宮、皮膚、乳腺等［4-6］，而對于免疫器官的抗衰老作用研究較少。脾臟是動物體內(nèi)重要的免疫器官，而激動素對于脾臟免疫功能的影響及其作用機(jī)制尚未探明。該研究旨在通過評價(jià)激動素對衰老模型小鼠脾臟抗氧化酶活性、血清關(guān)鍵細(xì)胞因子及免疫球蛋白含量的影響，為進(jìn)一步闡明激動素抗氧化及抗衰老的作用機(jī)制及激動素相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：2月齡健康昆明系小白鼠50只，體重為18～22 g，雌雄各半，由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：2014-2013。

1.1.2 藥品與試劑：激動素、D-半乳糖，購自Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）考馬斯亮藍(lán)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素 2（IL-2）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、免疫球蛋白 A（IgA）、免疫球蛋白 G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）ELISA檢測試劑盒，購自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：JA2003電子天平（0.001 g），購自上海上天精密儀器有限公司；玻璃勻漿器，購自海門弘澄實(shí)驗(yàn)器材制造有限公司；SHIMADZUUV2450型紫外分光光度計(jì)；ELx800 BioTek酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組與處理：將50只昆明系小白鼠隨機(jī)分為5組，分別為衰老模型對照組、激動素處理組（低、中、高劑量組）、青年對照組，每組10只，雌雄各半。衰老模型對照組、激動素處理組小鼠連續(xù)45 d 背部皮下注射 D-半乳糖（D-gal）［125 mg/（kg·BW）］制備衰老模型，1次/d，青年對照組小鼠連續(xù)45 d頸背部皮下注射生理鹽水，1次/d。試驗(yàn)第11天時，低、中、高劑量激動素處理組小鼠分別腹腔注射 5、10、20 mg/（kg·BW） 的激動素溶液，1 次/d，持續(xù)至第45天，同時期內(nèi)衰老模型對照組和青年對照組小鼠頸背部皮下注射生理鹽水，1次/d。

1.2.2 血清的制備：試驗(yàn)第45天時，采用眼球采血法采集各組小鼠血液，分離血清。

1.2.3 脾指數(shù)的計(jì)算：采血后處死小鼠，無菌摘取小鼠的脾組織，稱重并計(jì)算脾指數(shù)。脾指數(shù)（mg/g）=脾重量（mg）/體重（g）。

1.2.4 抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物酶代謝產(chǎn)物的檢測：制備脾組織勻漿，測定其抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性及脂質(zhì)過氧化物酶代謝產(chǎn)物MDA含量。整個過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 血清免疫因子IL-2和IL-6的檢測：取分離的血清，采用雙抗體夾心ELISA法檢測免疫因子IL-2、IL-6 含量。

1.2.6 血清免疫球蛋白的檢測：采用免疫比濁法檢測各組小鼠血清中的IgA、IgG、IgM含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA)，試驗(yàn)組與對照組之間的差異顯著性采用Duncan′s檢驗(yàn)法。P＞0.05時認(rèn)為差異不顯著，P＜0.05時認(rèn)為差異顯著，P＜0.01時認(rèn)為差異極顯著。所有數(shù)據(jù)用X±SE表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾指數(shù) 由表1可知，衰老模型對照組小鼠脾指數(shù)與青年對照組比較極顯著下降（P＜0.01），表明模型制備成功。低劑量激動素組小鼠脾指數(shù)顯著高于衰老模型對照組（P＜0.05），中、高劑量激動素組小鼠脾指數(shù)極顯著高于衰老模型對照組（P＜0.01），且各激動素處理組小鼠脾指數(shù)與青年對照組相比，差異均不顯著（P＞0.05），表明激動素處理組小鼠脾臟發(fā)育明顯好轉(zhuǎn)，萎縮受到抑制。

表1 激動素對各組小鼠脾指數(shù)的影響

表2 各組小鼠脾臟抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化物酶代謝產(chǎn)物含量的檢測結(jié)果

表3 各組小鼠血清免疫因子IL-2和IL-6含量的檢測結(jié)果

2.2 抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物酶代謝產(chǎn)物含量 由表2可知，衰老模型對照組小鼠SOD、CAT、GSH-PX活性與青年對照組相比均極顯著降低（P<0.01）。經(jīng)激動素處理后，小鼠的3種抗氧化酶活性與衰老模型對照組相比有所提高，其中高劑量組的提高作用最為明顯，與青年對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。衰老模型對照組小鼠脾臟MDA含量較青年對照組明顯升高，二者差異極顯著（P<0.01）。經(jīng)激動素處理后，小鼠的MDA含量有所下降，低劑量激動素處理組小鼠脾臟的MDA含量顯著低于衰老模型對照組（P<0.05），中、高劑量組小鼠脾臟的MDA含量極顯著低于衰老模型對照組（P<0.01），且中、高劑量組小鼠脾臟的MDA含量與青年對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 血清免疫因子IL-2、IL-6含量 由表3可知，衰老模型對照組小鼠與青年對照組比較，血清IL-2含量顯著降低 （P<0.01），IL-6含量顯著上升（P<0.01）。使用不同劑量的激動素處理后，血清IL-2含量呈劑量依賴性升高，IL-6含量呈劑量依賴性降低，中、高劑量組小鼠血清的IL-2、IL-6含量與衰老模型對照組相比差異均極顯著（P<0.01），高劑量組小鼠血清IL-2、IL-6含量與青年對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 血清免疫球蛋白含量 由表4可知，衰老模型對照組小鼠與青年對照組相比，血清IgG、IgA、IgM含量顯著降低，差異極顯著（P<0.01）。激動素處理組血清IgG、IgA、IgM含量較衰老模型對照組升高，其中，激動素高劑量組與衰老模型對照組相比差異極顯著（P<0.01），而與青年對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

機(jī)體衰老后，體內(nèi)SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶的活性降低，代謝產(chǎn)生的自由基在體內(nèi)過多滯留，引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而影響其生理功能的正常發(fā)揮［7］。脾臟作為重要的免疫器官，其隨著年齡的增長逐漸衰退與萎縮，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少，抗氧化能力降低，合成分泌IL-2和免疫球蛋白等關(guān)鍵免疫因子的能力降低［8-9］。

激動素是一種腺嘌呤類衍生物，具有顯著的抗氧化、抗衰老的作用。 Tsukiyama 等［10］研究證明，激動素具有明顯的抗皮膚衰老作用，Celik等［11］也研究發(fā)現(xiàn)，激動素能夠保護(hù)由Fenton反應(yīng)系統(tǒng)引起的DNA氧化損傷作用。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老模型對照組小鼠的脾臟發(fā)生萎縮，脾指數(shù)較青年對照組顯著降低 （P<0.01），SOD、GSH-PX、CAT 酶活性顯著降低（P<0.01），經(jīng)激動素處理后，小鼠脾指數(shù)回升，SOD等抗氧化酶活性較衰老模型對照組有所提高，其中激動素高劑量組的升高作用最為顯著 （P<0.01）。衰老模型對照組小鼠脾臟MDA含量較青年對照組明顯升高，差異極顯著（P<0.01），經(jīng)激動素處理后，MDA含量與衰老模型對照組比較顯著下降（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果提示，激動素能夠抑制由衰老而導(dǎo)致的脾萎縮，提高SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶活性，有助于清除血清脂質(zhì)過氧化物酶代謝產(chǎn)物MDA，從而有效抑制自由基對組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷。

IL-2、IL-6由淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在免疫調(diào)節(jié)中起著舉足輕重的作用。IL-2缺少是老年人免疫缺陷的根本原因，IL-6升高是提示老年人發(fā)生感染的重要指標(biāo)。機(jī)體衰老后，IL-2含量下降，IL-6含量上升［12-14］。該研究結(jié)果顯示，衰老模型對照組小鼠血清IL-2含量較青年對照組顯著降低 （P<0.01），IL-6含量較青年對照組顯著上升（P<0.01）。使用不同濃度的激動素處理后，低、中、高劑量組小鼠的IL-2表達(dá)有所回升，IL-6表達(dá)有所下降，表明激動素能夠在一定程度上抑制脾的萎縮，提高機(jī)體的免疫力。

表4 各組小鼠血清免疫球蛋白含量的檢測結(jié)果

體外研究表明，激動素能夠有效抵抗人類成纖維細(xì)胞的衰老并能影響細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)，從而起到延緩細(xì)胞衰老的作用［15］。該研究結(jié)果顯示，衰老模型對照組小鼠的血清IgA、IgG、IgM含量與青年對照組相比顯著降低（P<0.01）。激動素處理后各組小鼠的免疫球蛋白含量升高，表明激動素能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

綜上提示，激動素能夠提高衰老模型小鼠脾組織的抗氧化酶活性，提高血清IL-2及免疫蛋白含量，降低脾臟MDA含量及血清IL-6含量，從而發(fā)揮延緩衰老、提高機(jī)體免疫能力的作用。

［1］AW D，SILVA A B，PALMER D B.Is thymocyte development functional in the aged［J］.Aging， 2009，1（2）：146-153.

［2］MALECKI P H，RYPNIEWSKI W，SZYMAN＇SKI M，et al.Binding of the plant hormone kinetin in the active site of mistletoe lectinⅠfrom Viscum album［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1824（2）： 334-338.

［3］DUDZIK P，DULIN＇SKA-LITEWKA J，WYSZKO E，et al.Effects of kinetin riboside on proliferation and proapoptotic activities in human normal and cancer cell lines ［J］.J Cell Biochem，2011，112（8）：2115-2124.

［4］張黎，歐陽五慶，胡穎，等.玉米幼芽提取物對家蠶抗氧化損傷作用的影響 ［J］. 蠶業(yè)科學(xué)，2005，31 （4）：458-462.

［5］楊戈，歐陽五慶，楊光敏，等.玉米幼芽提取物對衰老小鼠心肌自由基代謝和超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（2）：23-26.

［6］唐立剛.激動素對大鼠乳腺的作用及相關(guān)機(jī)制研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

［7］MIQUEL J，RAMíREZ-BOSCá A，RAMíREZ-BOSCA J V，et al.Menopause：a review on the role of oxygen stress and favorable effects of dietary antioxidants ［J］.Arch Gerontol Geriatr，2006，42（3）：289-306.

［8］SHEN H，ZHANG W，ABRAHAM C，et al.Age and CD161 expression contribute to inter-individual variation in interleukin-23 response in CD8+memory human T cells［J］.PLoS One，2013，8（3）：e57746.

［9］蘆琳琳.紅景天苷的抗衰老作用：口服紅景天苷改善老齡大鼠免疫反應(yīng)和增強(qiáng)谷氨酰半胱氨酸連接酶活性［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2013.

［10］TSUKIYAMA M T，SUGITA.Recent development of anti-aging plant agents and application to cosmetics［J］.Fragrance J，2010，38（9）：21-26.

［11］CELIK I， TULUCE Y，TURKER M.Antioxidant and immune potential marker enzymes assessment in the various tissues of rats exposed to indoleacetic acid and kinetin：A drinking water study ［J］.Pestic Biochem Phys，2006，86（3）：180-185.

［12］包伍葉，斯欽圖.蒙醫(yī)灸療對衰老模型大鼠血清SOD、MDA的影響 ［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，23（1）：75-76.

［13］MENEGUELLO -COUTINHO M，CAPERUTO E，BACURAU A V，et al.Effects of dietary restriction or swimming on lymphocytes and macrophages functionality from old rats ［J］.Immunol Invest，2014， 43 （2）：113-122.

［14］CIARAMELLA A，SPALLETTA G，BIZZONI F，et al.Effect of age on surface molecules and cytokine expression in human dendritic cells ［J］.Cell Immunol，2011，269（2）：82-89.

［15］MIK V，SZüCˇOVá L，SˇMEHILOVáM，et al.N9-substituted derivatives of kinetin:effective anti-senescence agents［J］.Phytochemistry，2011，72（8）：821-831.

Effect of Kinetin on Immunity of Aging Model Mice

WU Ying-ying，LI Meng-yun，SONG Ge-ge，YAN Xiao-lan，ZHANG Ke-zhe，WANG Gang
（Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

In order to investigate the effect of kinetin on immunity of aging model mice,a total of 50 mice of Kunming strain were selected and divided into aging model control group,low dosage kinetin group,moderate dosage kinetin group,high dosage kinetin group,and young control group.There were 10 mice in each group with half males and half females.The mice in aging model control group and kinetin treatment groups were subcutaneously administrated 125 mg/（kg·BW）of D-galactose once daily on the back for consecutive 45 d.On day 11,the mice in low,moderate and high dosage kinetin group were intraperitoneally administrated with 5,10,20 mg/（kg·BW）of kinetin solutions once daily till 45thday;in the same period,the mice in aging model control group and young control group were subcutaneously administrated with saline on the back of the neck.At the end of the experiment,the spleen index of the mice in different groups was calculated,the activity of SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in spleen were determined,and the serum content of IL-2,IL-6,IgA,IgG,IgM were evaluated.The results revealed that the spleen index of kinetin treatment groups was significantly or extremely significantly higher than that of aging model control group（P<0.05 or P<0.01）;the activity of the 3 tested antioxidant enzymes of kinetin treatment groups was increased in different degree compared with that of aging model control group,and the high dosage kinetin group exhibited extreme significance （P<0.01）;the content of MDA in spleen of kinetin treatment groups was significantly or extremely significantly reduced compared with that of aging model control group （P<0.05 or P<0.01）;the serum content of IL-2 of kinetin treatment groups was significantly or extremely significantly higher than that of aging model control group （P<0.05 or P<0.01),and the serum content of IL-6 was significantly or extremely significantly lower than that of aging model control group （P<0.05 or P<0.01）;the serum content of the 3 tested globulins of kinetin treatment groups was increased in different degree compared with that of aging model control group,and the high dosage kinetin group exhibited extreme significance （P<0.01）.Based on the results obtained in this study,it can be concluded that kinetin are capable to delay aging,resist oxidation damage and enhance immunity.

kinetin；aging；mice；spleen；immunity

R339.38；R392

A文章順序編號1672-5190（2016）03-0018-04

2016－02－25

項(xiàng)目來源：河南科技大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（SRTP項(xiàng)目，2015144）；河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)開發(fā)基金項(xiàng)目（SY1516040）；河南科技大學(xué)教育教學(xué)改革項(xiàng)目（2015YB-017）；博士啟動基金（4025/13480072）。

武瑩瑩（1997—），女，所學(xué)專業(yè)為動物醫(yī)學(xué)。

李夢云（1974—），女，講師，博士，主要研究方向?yàn)閯游餀C(jī)能與形態(tài)、免疫及其生理調(diào)控。

（責(zé)任編輯：趙俊利）