胡　煜，蔡明成，王　玲，譚　林，畢　武，張佳卉，左福元*

(1.西南大學榮昌校區(qū)動物科學系，榮昌 402460；2.四川農業(yè)大學動物遺傳育種研究所，溫江 611130 )

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熱應激狀態(tài)下牛血清生化指標、miRNA表達變化及其相關性分析

胡煜1，蔡明成2，王玲1，譚林1，畢武1，張佳卉1，左福元1*

(1.西南大學榮昌校區(qū)動物科學系，榮昌 402460；2.四川農業(yè)大學動物遺傳育種研究所，溫江 611130 )

本研究旨在探索熱應激對牛miRNA表達量和血清生化指標的影響及其相互關系，篩選牛血清中與熱應激相關的調控因子。選擇20頭體況相近、飼養(yǎng)管理一致的紅安格斯公牛，分別于熱應激期和非熱應激期采集血樣，進行血清生化指標及miRNA表達量的測定。結果表明，與非熱應激期相比，熱應激下血清Cl-濃度、LDH活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)；T-AOC活性、GSH-Px活性、IgA含量、 IgG含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性、IL-2含量極顯著降低(P<0.01)。對血清miRNA定量分析發(fā)現(xiàn)，miR-181a、miR-486表達量顯著下調(P<0.05)，分別與IgA、IL-2含量均呈顯著正相關(P<0.05)，分別與IgG含量呈極顯著正相關(P<0.01)。而miR-1246表達量極顯著上調(P<0.01)，與MDA含量呈極顯著正相關(P<0.01)。綜上表明，miR-1246、miR-181a、miR-486在機體熱應激狀態(tài)下參與了調控免疫應答及抗氧化等方面的作用，可作為肉牛抗熱應激的分子標記。

熱應激；miRNA；血清生化指標；相關性

熱應激是外界環(huán)境溫度超過等熱范圍，物理調節(jié)不能維持機體熱平衡，機體散熱受阻，體溫升高而引起的非特異性防御反應和特異性障礙在內的全身性適應癥[1-2]。肉牛屬于恒溫動物，汗腺不發(fā)達，耐熱性差，在中國南方高溫高濕環(huán)境下極易出現(xiàn)熱應激反應。

血液承擔著機體營養(yǎng)物質及代謝產物的運輸，是調節(jié)機體各代謝的主要途徑。血清生化指標可以反映機體各組織器官的生理病理狀況。由于血液樣本較易獲取，常常作為尋找疾病分子標志物最理想的材料。目前，世界各地科研工作者和臨床醫(yī)生已在心血管疾病、癌癥、腫瘤、組織損傷等領域開展了一系列外周血循環(huán)miRNA標志物的研究與開發(fā)，并取得了一定進展[3]。miRNA是一種微小RNA，發(fā)揮基因轉錄后的調控功能，在各種生理和病理過程中扮演著重要的角色[4]。血液中的miRNA表達十分穩(wěn)定，可作為潛在的生物標志物應用于疾病的早期診斷、預后判斷以及化療監(jiān)測[5]。miRNA是熱應激狀態(tài)下奶牛血清中高表達的調控因子，參與機體各組織器官免疫及抗氧化的調控過程[6]，而關于肉牛血清miRNA的研究鮮有報道。本研究旨在通過對熱應激和非熱應激狀態(tài)下牛血清生化指標及基因表達量的測定，探討熱應激、miRNA及其與機體免疫功能和抗氧化作用的關系，為篩選?？篃釕ふ{控因子提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗動物

在重慶市良種肉牛場選擇20頭體況相近、體重450 kg左右，飼養(yǎng)管理一致的紅安格斯公牛為試驗動物，試驗期分熱應激期(9月11日-17日)和非熱應激期(10月17日-23日)兩階段進行，每階段為期7 d。

1.2牛舍溫濕度測定

參考A.Srikandakumar等[7]方法，在各試驗階段每天下午02：00，牛舍中部和兩端，離地面1.5 m處懸掛溫濕度表，測定干濕球溫度，計算溫濕指數(shù)(THI)，THI= 0.72( Td+Tw)+40.6，其中Td是干球溫度，Tw是濕球溫度。(判斷標準：THI<72為正常生理狀態(tài)；72～79為輕度熱應激狀態(tài)；79～89為中度熱應激狀態(tài)；> 90為重度熱應激狀態(tài))

1.3指標測定

1.3.1血樣采集在各試驗期第7 天下午02：00利用真空采血進行頸靜脈采血(10 mL·頭-1)，并于離心機中，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清于-20 ℃冷凍保存供生化指標測定。

1.3.2直腸溫度、呼吸頻率測定參考楊游等[8]方法，采用獸用體溫計及秒表計數(shù)器測定直腸溫度及呼吸頻率。

1.3.3血清生化指標測定用全自動生化分析儀及酶標儀進行血清生化指標的測定。測定內容：血清離子含量(K+、Na+、Cl-、Ca2+)；血清酶(ALT、AST、ALP、CK、LDH)；抗氧化指標(T-AOC、SOD、GSP-Px、MDA)；免疫指標(ALB、IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-6)；內分泌指標(T3、T4)；血脂指標(TC、TG、HDL、LDL)；測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4實時熒光定量PCR檢測

1.4.1RNA提取及反轉錄采用Trizol法提取血清總RNA，用紫外分光光度計確定RNA的濃度及OD值，并通過瓊脂糖凝膠電泳和毛細血管電泳檢測RNA完整性。參照反轉錄試劑盒說明書(上海生工，B532451)的步驟，反轉錄總RNA得到miRNA第一鏈cDNA。

1.4.2引物設計與合成利用miRBase、NCBI等在線工具，獲取的miRNAs的成熟序列，采用加尾法設計miRNA引物，同時以U6為內參，下游引物為通用引物(試劑盒自帶)。上游引物由上海生工合成(表1)。

1.4.3熒光定量PCR反應采用SYBR?Green I染料法，參照熒光定量說明書(Bio-Rad，1725272)進行。對PCR產物進行熔解曲線分析，同時取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，檢測引物特異性。隨機取1個cDNA樣品，用10倍梯度連續(xù)稀釋回收產物得到實時熒光定量PCR的標準品。將標準品進行標準曲線分析。

表1熒光定量PCR引物及擴增條件

Table 1Primer pairs and amplification requirement for real-time PCR

名稱Name上游引物序列(5'→3')Primersequences登錄號Accessionnumber退火溫度/℃Tm產物大小/bpSizemiR-1246AATGGATTTTTGGAGCAGGMI002111258.8miR-31AGGCAAGATGCTGGCATAGCTMI000476258.8miR-486TCCTGTACTGAGCTGCCCCGAGTMI000984358.8mR-148a-5pAAAGTTCTGAGACACTCCGACTMIMAT000454958.880～120mR-340TCCGTCTCAGTTACTTTATAGCCMI000980960.0miR-181aAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTMIMAT000354360.0miR-21TAGCTTATCAGACTGATGTTGACMI000474260.0

1.5統(tǒng)計分析

采用2-△△ct法分析定量結果。使用EXCEL2010對數(shù)據(jù)進行初步處理，所得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件Paired-Samplesttest進行顯著性分析。結果以“均值±標準差”表示。用Bivariate Correlations估計各變量間的簡單相關。

2　結　果

2.1牛舍THI及生理指標的測定

由表2可知，熱應激期THI平均為84.83，為79～88，屬于中度熱應激狀態(tài)，非熱應激期THI平均為62.51，<72，屬于正常生理狀態(tài)。熱應激期牛直腸溫度達39.24 ℃、呼吸頻率達49.60 次·min-1，極顯著高于非熱應激期(P<0.01)。

2.2熱應激對牛血清生化指標的影響

對兩個時期血清生化指標檢測結果表明(表3)，熱應激期測得的Cl-濃度、 LDH活性顯著高于非熱應激期(P<0.05)；T-AOC活性、GSP-PX活性、IgA含量、IgG含量、T4含量、TC含量顯著低于非熱應激期(P<0.05)；而MDA活性、HDL含量極顯著高于非熱應激期(P<0.01)；SOD活性、IL-2含量、LDL含量極顯著低于非熱應激期(P<0.01)；剩余指標除熱應激期IL-4含量較非熱應激期有所升高外，其余指標均有所下降，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2牛舍環(huán)境THI及生理指標測定結果

Table 2The results of barn environment THI and physiological index determination

項目Items溫濕指數(shù)THI直腸溫度/℃RT呼吸頻率/(次·min-1)Respiratoryrate狀態(tài)Condition熱應激期Heatstress84.83±0.2939.24±0.34A49.60±2.77A中度熱應激狀態(tài)非熱應激期Nonheat-stress62.51±0.4238.34±0.11B32.00±2.83B正常生理狀態(tài)

同行數(shù)據(jù)無字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

No letter in the same row means not significant difference between treatments(P>0.05)；Different small letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)；Different capital letters in the same row means extremely significant difference between the treatments(P<0.01).The same as below

表3血清生化指標的測定結果

Table 3The results of biochemical indexes in serum

項目Items熱應激Heatstress非熱應激Nonheat-stress鉀/(U·L-1)K+4.47±0.495.23±0.66鈉/(U·L-1)Na+138.72±2.53139.36±2.14氯/(mmol·L-1)Cl-100.94±3.04a98.52±1.86b鈣/(mmol·L-1)Ca2+2.18±0.182.35±0.12谷丙轉氨酶/(U·L-1)ALT25.60±7.2028.40±4.88谷草轉氨酶/(U·L-1)AST60.20±8.2665.20±10.43堿性磷酸酶/(U·L-1)ALP40.20±8.9340.20±15.35肌酸激酶/(U·L-1)CK188.80±100.51194.60±38.06乳酸脫氫酶/(U·L-1)LDH1320.60±206.03a1075.20±212.67b總抗氧化能力/(U·mL-1)T-AOC4.39±0.47a6.41±0.81b超氧化物歧化酶/(U·mL-1)SOD99.65±3.53A113.00±3.19B谷胱甘肽過氧化/(μmol·L-1)GSP-Px104.81±15.88a141.70±9.60b丙二醛/(nmol·mL-1)MDA3.52±0.35A1.67±0.34B白蛋白/(U·L-1)ALB34.00±3.2536.70±2.50免疫球蛋白A/(μg·mL-1)IgA257.54±41.67a320.33±36.19b免疫球蛋白G/(mg·mL-1)IgG7.68±1.38a14.95±4.97b免疫球蛋白M/(mg·mL-1)IgM3.02±1.913.67±1.76白細胞介素2/(ng·L-1)IL-2360.84±215.75A628.42±213.06B白細胞介素4/(ng·L-1)IL-4380.14±117.14335.57±82.18白細胞介素6/(ng·L-1)IL-61255.48±459.511461.43±322.67三碘甲狀腺原氨酸/(nmol·L-1)T32.36±0.962.46±1.82甲狀腺素/(nmol·L-1)T493.93±14.14a126.93±8.56b總膽固醇/(g·L-1)TC3.13±0.39a3.96±0.93b甘油三酯/(g·L-1)TG0.23±0.110.33±0.16高密度脂蛋白/(mmol·L-1)HDL2.53±0.31A1.66±0.41B低密度脂蛋白/(mmol·L-1)LDL0.50±0.11A2.15±0.58B

2.3總RNA抽提結果及引物特異性檢測

用Nanodrop 2000檢測提取的總RNA，OD值均為1.8～2.0，將總RNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，可見28S、18S、5S 3條條帶，28S和18S條帶亮度比約為2，條帶明亮清晰且無雜帶，RNA無降解(圖1)；同時用Agilent 2100毛細管電泳檢測RNA完整性，結果顯示，RIN≥8.0，且28S/18S≥0.8，樣品完整性好，質量合格(圖2)。最后將miRNA擴增產物進行2% 瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示的片段大小與預期一致，引物特異性好(圖3)。

圖1　總RNA電泳檢測Fig.1　Electrophoresis of total RNA extraction

圖2　RNA完整性檢測Fig.2　Integrity detection of RNA

圖3　miRNAs qRT-PCR產物檢測Fig.3　Results of miRNAs qRT-PCR

2.4血清miRNA表達情況及其與生化指標的相關性分析

血清中miRNA的表達情況如圖4所示。與非熱應激期相比，熱應激期miR-181a、miR-486表達量均顯著下調(P<0.05)，miR-1246表達量極顯著上調(P<0.01)。將上述差異顯著的血清生化指標與血清miRNA表達量進行相關性分析，相關系數(shù)如表4所示。由分析結果可知：血清 miR-1246表達量與Cl-、MDA含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與TC含量呈顯著負相關(P<0.05)；血清miR-181a表達量與IgG含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與IgA、IL-2含量呈顯著正相關(P<0.05)；血清miR-486表達量與IgG含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與LDH、T-AOC、IgA、IL-2含量呈顯著正相關(P<0.05)，其余變量之間無顯著相關性。

**.P<0.01；*.P<0.05，表4同 **.P<0.01；*.P<0.05.The same as Table 4圖4　血清miRNA 的表達情況Fig.4　The expression of miRNA in serum

表4血清miRNA表達量與血清生化指標的相關性分析

Table 4The correlation analysis of miRNA expression and biochemical indexes in serum

Cl-LDHT-AOCSODGSP-PXMDAIgAIgGIL-2T4TCmiR-12460.730**-0.446-0.156-0.367-0.2270.823**0.123-0.357-0.2930.109-0.621*miR-181a0.1300.5200.4220.1710.2020.1840.574*0.781**0.632*0.4710.315miR-486-0.1190.658*0.596*0.2330.499-0.2660.586*0.775**0.564*0.4050.385

2.5 miRNA-靶基因的網絡互作

相關性分析結果表明，miRNAs與抗氧化指標及免疫指標存在顯著相關性，提示miRNAs可能在機體免疫應答、抗氧化等方面具有調控作用，用TargetScan和 microRNA.Org 等軟件對miRNA進行靶基因預測，將預測到的靶基因在KEGG、DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO分析和KEGG分析。并用Cytoscape軟件對篩選結果進行分析處理，由圖5可知，這些miRNA與靶基因構成一個結構復雜的多中心基因互作結構圖，處于網絡中心的節(jié)點除與網絡周邊節(jié)點之間存在相互作用外，與其他網絡中心節(jié)點之間也存在廣泛的互作關系。GO和KEGG分析表明，這些基因廣泛參與多種生物學過程，并在免疫系統(tǒng)發(fā)育信號通路、B細胞受體信號通路、T受體信號通路和MAPK級聯(lián)反應等信號通路中發(fā)揮重要作用(表5)。

3　討　論

熱應激是一種全身性的反應，對機體的神經內分泌、消化吸收、血液循環(huán)、泌尿生殖、免疫和物質代謝等方面均會產生影響。血清中無機離子含量對牛的正常生理代謝具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)熱應激下，牛血清K+、Ca2+、Na+均降低，血清Cl-則顯著升高，其原因可能是在熱應激早期，由于環(huán)境溫度變化，引起機體呼吸中樞興奮，呼吸加快，使血液CO2含量下降，引起呼吸性堿中毒。從而引起腎中碳酸氫鹽的分泌能力增強，使腎小管對Cl-的吸收增加，最終導致血清中Cl-含量增加[9]。這與Z.Arad等[10]研究結果基本一致，說明熱應激影響了機體電解質平衡。本研究還發(fā)現(xiàn)熱應激狀態(tài)下血清LDH升高，可能原因是LDH參與了無氧酵解，LDH可能導致機體乳酸水平增加，引起酸中毒，而酸中毒會影響呼吸，使機體出現(xiàn)呼吸功能障礙，機體缺氧。然而在此情況下，為保證中樞神經系統(tǒng)、心等重要器官供氧充足，其他組織則采取無氧酵解的方式供能，而無氧酵解運動加強的同時，又會使機體LDH升高。說明隨著熱應激程度的加深，機體出現(xiàn)呼吸性堿中毒和代謝性酸中毒的混合型酸堿紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)熱應激期T-AOC、SOD、GSP-PX含量均降低，而MDA含量升高，這是由于在熱應激情況下，機體抗氧化防御體系受到破壞，自由基產生過多，自由基與不飽和脂肪酸作用，生成脂質過氧化物，最終降解為MDA代謝物，這與李忠浩[11]的研究結果一致。說明熱應激下?？寡趸芰ο陆担杂苫宄郎p少，對機體組織、細胞造成了氧化攻擊。

表5miRNA 靶基因GO和KEGG分析參與的主要信號通路

Table 5GO and KEGG analyze the main pathway of miRNA target genes

通路名稱PathwaynameID號IDnumber基因數(shù)GenenumberP值P-value免疫系統(tǒng)發(fā)育ImmunesystemdevelopmentGO0002520378.8E-4白細胞分化LeukocytedifferentiationGO0002521170.03細胞應激反應CellularstressresponseGO0033554290.04MAPK級聯(lián)反應MAPKcascadereactionGO0000165174.1E-4B細胞受體信號通路BcellreceptorsignalingpathwayKO04662182.7E-4T細胞受體信號通路TcellreceptorsignalingpathwayKO04660122.8E-6

紫框、黃框、藍框分別表示各miRNA的靶基因域，紅圈表示這些miRNA所共有的靶基因，調控關系用灰色箭頭表示Purple box，yellow box and blue box represents the three miRNAs target genes，respectively.Red circle represents common target genes.Grey arrows represent regulatory relationships圖5　miRNA-靶基因刪除部分節(jié)點后的網絡狀態(tài)Fig.5　Delete a part of the nodes of miRNA-target genes in network

本研究發(fā)現(xiàn)MDA含量與miR-1246表達量極顯著相關，其原因可能是熱應激加速了機體組織的脂質過氧化，并導致其抗氧化能力下降。通過靶基因預測發(fā)現(xiàn)，其調控的靶基因中，ENOX2、GCLC、CAV1與機體抗氧化功能有關。在熱應激狀態(tài)下，CAV1表達升高，導致內皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)脫偶聯(lián)，eNOS出現(xiàn)功能障礙將不再生成NO，促使NO水平下降和超氧陰離子(O2-)增多，自由基水平升高，最終造成機體過氧化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應激下免疫球蛋白IgA、IgG顯著降低，炎癥因子IL-2極顯著降低，可能是熱應激影響了機體免疫水平和T淋巴細胞亞群的平衡。本研究中miR-181a和miR-486表達量與免疫指標(IL-2、IgA、IgG)顯著相關，這與C.Z.Chen等[13]、Y.B.Ouyang等[14]的結果相似。C.Z.Chen等[13]發(fā)現(xiàn)miR-181a在小鼠造血器官差異表達，miR-181a可以調控B細胞發(fā)育和調節(jié)T細胞受體(TCR)介導的CD4+T細胞抗原反應。Y.B.Ouyang等[14]用生物信息學識別研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可能會調控熱應激蛋白家族(HSP70家族)幾個基因成員(如GRP78)的mRNA表達。心肌細胞在缺氧/復養(yǎng)損傷過程中，miR-486表達水平在Toll-like receptor 4的缺少或者 Pam3CSK4治療過程中有明顯增加。同時用慢病毒表達載體轉染H9C2肌細胞能顯著減緩缺氧/復氧引起的LDH釋放[15]。這也與本研究發(fā)現(xiàn)的miR-486表達量與LDH含量呈極顯著相關存在一定的相似性。通過靶基因預測發(fā)現(xiàn)，miR-181a和miR-486可能調控CD38、IL17F、CD4基因的表達與T細胞活化、B細胞分泌和免疫響應等信號通路相關。研究表明CD4+T淋巴細胞約占成熟T淋巴細胞70%，主要為輔助性T細胞，CD4+T細胞分為 TH1和TH2兩個功能性細胞亞群。 TH細胞分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-β，而 TH2細胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，說明CD4+T細胞通過這些炎癥因子，參與免疫反應[16]。綜上表明，本研究初步確定了熱應激、miRNA及其與機體免疫功能和抗氧化作用的關系，預測了miRNA可能調控的靶基因，但是關于miRNA如何調控目標基因，進而影響機體免疫、抗氧化、代謝等功能的具體機制尚需要更加系統(tǒng)的生物試驗來驗證。

4　結　論

熱應激引起牛血液LDH、MDA、IgA、IgG、IL-2含量及miR-1246、miR-181a和miR-486表達的顯著性變化，并且兩者變化具有相關性。miR-1246、miR-181a、miR-486在機體熱應激狀態(tài)下參與了調控免疫應答及抗氧化防疫等方面的作用，可作為肉牛抗熱應激的分子標記。

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(編輯程金華)

The Serum Biochemical Indexes and miRNA Expression in Cattle under Heat Stress and Their Correlation Analysis

HU Yu1，CAI Ming-cheng2，WANG Ling1，TAN Lin1，BI Wu1，ZHANG Jia-hui1，ZUO Fu-yuan1*

(1.DepartmentofAnimalScience，RongchangCampusofSouthwestUniversity，Rongchang402460，China；2.InstituteofAnimalGeneticsandBreeding，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China)

The aim of the present study was to assess the changes of miRNA expression levels and serum biochemical indexes of cattle in heat stress.Twenty Red Angus bulls with similar body condition and consistent feeding and management selected from Chongqing Improved Beef Cattle Farm were used in the experiment.Blood samples were collected from each bull in heat stress and non heat-stress to analyze miRNA expression levels and serum biochemical indexes.The results showed that the serum concentrations of Cl-(P<0.05) and malondialdehyde (MDA) (P<0.01) and the activities of lactate dehydrogenase (LDH) (P<0.05) were significantly increased in heat stress in comparison with control.Whereas，the activities of total antioxidation (T-AOC) (P<0.05)，glutathione peroxidase (GSH-Px) (P<0.05) and superoxide dismutase (SOD) (P<0.01) as well as the contents of IgA (P<0.05)，IgG (P<0.05) and interleukin-2 (IL-2) (P<0.01) were remarkably decreased.Meanwhile，the expression levels of miR-181a (P<0.05) and miR-486 (P<0.05) were significantly downregulated and positively correlated with the contents of IgA (P<0.05)，IL-2 (P<0.05) and IgG (P<0.01)，respectively，but that of miR-1246 were significantly upregulated (P<0.01) and positively correlated with serum contents of MDA (P<0.05).In conclusion，the current results suggested that miR-1246，miR-181a，miR-486 might be involved in regulating the immune response and antioxidation process of cattle in heat stress，and could be as a molecular indicator of anti-heat stress.

heat stress；miRNA；serum biochemical index；correlation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.012

2016-04-01

重慶市科技支撐示范工程項目/豐都肉牛產業(yè)協(xié)同創(chuàng)新與關鍵技術攻關(jcsf121-2012-01-1)；中央高?；緲I(yè)務費專項資金資助(XDJK2016E086)；西南大學榮昌校區(qū)青年基金 (20700426)

胡煜(1991-)，女，湖南益陽人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail: huyu_186@163.com

左福元，教授，主要從事反芻動物遺傳育種研究，E-mail: zfuyuan@163.com

S823.2

A

0366-6964(2016)09-1840-08