張　琦，黃嬌嬌，楊彩俠，王宇祥，張　慧，趙建國(guó)，李　輝*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

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CRISPR/Cas9介導(dǎo)RB1基因敲除及其在雞前脂肪細(xì)胞分化、增殖中的功能研究

張琦1，2，黃嬌嬌3，楊彩俠1，王宇祥1，2，張慧1，2，趙建國(guó)3，李輝1，2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

旨在研究RB1基因在雞前脂肪細(xì)胞分化和增殖過(guò)程中的功能，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞前脂肪細(xì)胞中敲除RB1基因，檢測(cè)雞前脂肪細(xì)胞的分化和增殖能力及相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效介導(dǎo)RB1基因的敲除并引起RB1基因翻譯的提前終止，敲除效率可以達(dá)到10%。油紅O提取比色和CCK-8的結(jié)果顯示，敲除RB1基因后，雞前脂肪細(xì)胞的分化能力減弱、增殖能力增強(qiáng)；qRT-PCR結(jié)果顯示，RB1基因敲除之后脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因G0S2、FAS、A-FABP的mRNA表達(dá)水平下降，尤其是G0S2基因的表達(dá)水平在前脂肪細(xì)胞分化的各個(gè)階段都表現(xiàn)為顯著的下降。同時(shí)RB1基因敲除還引起細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA的mRNA表達(dá)水平升高。初步推斷，RB1基因可能是調(diào)控雞前脂肪細(xì)胞分化和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

CRISPR/Cas9；RB1；雞；脂肪沉積；分化；增殖

肉雞是全世界廣泛飼養(yǎng)并具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的禽類(lèi)。由于高強(qiáng)度選擇，肉雞的生長(zhǎng)速度和肉產(chǎn)量得以明顯提高。然而肉雞體內(nèi)脂肪(尤其是腹脂)蓄積過(guò)多一直是困擾世界范圍內(nèi)肉雞育種工作者的重大問(wèn)題。脂肪組織中脂肪細(xì)胞的過(guò)度增殖和分化會(huì)造成脂肪形成加劇從而引發(fā)機(jī)體脂肪的過(guò)度蓄積。因此，研究脂肪沉積的分子遺傳機(jī)制對(duì)防止動(dòng)物體內(nèi)脂肪過(guò)度沉積，提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率具有重要的意義。脂肪細(xì)胞的分化和增殖是一個(gè)由眾多因子共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，本課題組前期對(duì)雞1號(hào)染色體上影響腹脂性狀的QTL(數(shù)量性狀基因座)進(jìn)行了初步定位，在雞1號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)影響雞腹脂重和腹脂率的QTL；進(jìn)一步通過(guò)加大標(biāo)記密度和擴(kuò)大群體規(guī)模的方法將影響雞腹脂率的QTL精細(xì)定位在雞1號(hào)染色體上3.7 Mb的區(qū)域內(nèi)；對(duì)該區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行分析，結(jié)果鑒定出了RB1(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因)等與雞體脂性狀相關(guān)的重要基因[1-3]。因此，本課題組選擇RB1基因作為影響雞腹脂沉積的重要基因進(jìn)行后續(xù)研究。在哺乳動(dòng)物上針對(duì)RB1基因的研究較多，它參與機(jī)體內(nèi)許多生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)過(guò)程比如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老[3]，但在家禽上尤其是對(duì)雞脂肪細(xì)胞分化和增殖的影響的研究比較少。

自2013年CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)為基因組編輯提供了很好的解決方案。CRISPR系統(tǒng)是許多細(xì)菌的一種免疫防御機(jī)制，可用來(lái)抵抗外源核酸(如病毒或質(zhì)粒)的入侵[4]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用人工設(shè)計(jì)的向?qū)NA(Single-guide RNA，sgRNA)介導(dǎo)外源表達(dá)的Cas9蛋白與基因組的靶點(diǎn)特異性地結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA特異性地切割。該系統(tǒng)已經(jīng)在多種模式生物、細(xì)胞以及家畜中得到大量研究與應(yīng)用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景[5-7]。但是迄今為止，Cas9介導(dǎo)的基因組編輯在家禽上尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究的主要目的有兩個(gè)：一是探討CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)雞細(xì)胞基因組編輯的可行性；二是以雞前脂肪細(xì)胞為模型，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建RB1基因敲除的雞前脂肪細(xì)胞，檢測(cè)敲除RB1基因后細(xì)胞的分化和增殖能力，研究RB1對(duì)雞脂肪細(xì)胞分化和增殖的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的雞前脂肪細(xì)胞系(命名為ICPA-II)，Cas9載體為pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 載體。

1.2方法

1.2.1gRNA的設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建利用MIT張峰實(shí)驗(yàn)室提供的在線(xiàn)工具(http：//crispr.mit.edu/)進(jìn)行g(shù)RNA的設(shè)計(jì)。根據(jù)雞RB1基因的序列(GenBank登錄號(hào)：NM_204419)，針對(duì)RB1基因的第5外顯子和第6外顯子共設(shè)計(jì)了3個(gè)gRNAs，構(gòu)建gRNA的寡核苷酸序列分別為(下劃線(xiàn)標(biāo)記的堿基為構(gòu)建gRNA的寡核苷酸上引入的BbsI酶切位點(diǎn))：RB1-5E-gRNA1-F：5′-CACCGCAAAGAGGTGGATGTTAACA-3′，RB1-5E-gRNA1-R：5′-A-AACTGTTAACATCCACCTCTTTGC-3′；RB1-6E-gRNA1-F：5′-CACCGGACTTGTGGCCTTATTT-ATC-3′，RB1-6E-gRNA1-R：5′-AAACGATAAAT-AAGGCCACAAGTCC-3′；RB1-6E-gRNA2-F：5′-CACCGTATTTATCTGGAGCAACCCA-3′，RB1-6E-gRNA2-R：5′-AAACTGGGTTGCTCCAGAT-AAATAC-3′。

利用限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)對(duì)上述3條gRNAs打靶后細(xì)胞的基因型進(jìn)行鑒定。RB1-5E-gRNA1目標(biāo)打靶區(qū)域存在HpaI酶切位點(diǎn)，RB1-6E-gRNA1和RB1-6E-gRNA2目標(biāo)打靶區(qū)域存在HaeIII酶切位點(diǎn)。打靶成功可能造成潛在打靶位置附近基因組堿基的突變、缺失或者插入，從而使擴(kuò)增的包含打靶片段的PCR產(chǎn)物不能被HpaI或HaeIII內(nèi)切酶切割開(kāi)。根據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶的切割與否可以初步斷定RB1是否發(fā)生了基因打靶并分析打靶效率。篩選為陽(yáng)性的細(xì)胞克隆再通過(guò)測(cè)序確定RB1基因的突變類(lèi)型。

針對(duì)RB1基因的gRNA-CRISPR/Cas9打靶載體的構(gòu)建：1)pX330空載體的酶切：用BbsI酶(NEB，R0539)線(xiàn)性化pX330質(zhì)粒，并進(jìn)行切膠回收。2)gRNA寡核苷酸雙鏈的合成：將合成的兩條寡核苷酸以100 μmol·L-1的形式稀釋?zhuān)〉攘康纳嫌捂満拖掠捂溁旌?。反?yīng)程序：95 ℃ 210 s，降溫至室溫。3)gRNA寡核苷酸雙鏈與線(xiàn)性化的pX330載體連接：連接體系：線(xiàn)性化的pX330載體35 ng、退火形成的gRNA寡核苷酸雙鏈2 μL、T4 buffer 1 μL、T4連接酶1 μL、補(bǔ)水至10 μL。連接條件：室溫5 min。隨后將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并挑取單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒大提。構(gòu)建的3個(gè)載體的名稱(chēng)分別為RB1-g4、RB1-g5、RB1-g6。

1.2.2gRNA的體外轉(zhuǎn)錄及體外切割活性檢測(cè)根據(jù)InvitroTranscription T7 Kit(TaKaRa，6140)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行g(shù)RNA的體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄獲得的gRNA與包含潛在打靶區(qū)域的DNA片段按照Cas9酶(NEB，M0386)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切。酶切體系：包含潛在打靶區(qū)域的DNA片段150 ng、gRNA 100 ng、Cas9酶1 μL、10×buffer 2 μL、補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 酶切1 h。酶切后的產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果分析3個(gè)gRNAs的體外切割活性。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)條件：10%血清的DMEM(Gibco，12800017)無(wú)抗生素培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)。野生型的雞前脂肪細(xì)胞按照6×104個(gè)·孔-1的濃度傳到6孔板中，然后按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen，11668019)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將前期構(gòu)建的RB1-g4、RB1-g5、RB1-g6質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染后24 h利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，將帶有綠色熒光的細(xì)胞分選到96孔板中，每孔1個(gè)細(xì)胞。

1.2.4CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞打靶效率和突變模式檢測(cè)將分選好的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，適時(shí)傳代。當(dāng)細(xì)胞傳到24孔板時(shí)，每個(gè)孔取一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，剩下的一半細(xì)胞提取基因組進(jìn)行打靶效率鑒定和突變模式檢測(cè)。對(duì)提取的細(xì)胞基因組的打靶區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物：RB1-5e-F：5′-AGCCAAGGTATCAGTGTTGGG-3′，RB1-5e-R：5′-AAACGGGCACTTCTCAGACA-3′。

對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，不能被HpaⅠ酶切開(kāi)的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步分析雞RB1基因的突變模式。

1.2.5前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化和油紅O染色及提取比色利用油酸誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化，然后利用油紅O染色和提取比色的方法檢測(cè)細(xì)胞的脂滴沉積情況，從表觀上觀察細(xì)胞的分化情況。具體步驟：向貼壁細(xì)胞中加入油酸(終濃度320 μmol·L-1)誘導(dǎo)細(xì)胞分化，持續(xù)誘導(dǎo)24、48、72和96 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，10%甲醛固定30 min，PBS洗2遍。油紅O工作液染10 min，棄去多余的染色液，60%異丙醇分色10～20 s，蒸餾水沖洗3次，室溫干燥，100%異丙醇溶解被染細(xì)胞中的油紅O 15 min。用100%異丙醇作為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定 510 nm波長(zhǎng)的吸光度值，每組內(nèi)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖將敲除組和野生型組的細(xì)胞分別計(jì)數(shù)。然后將細(xì)胞傳入96孔板中，每個(gè)孔放入4 800個(gè)細(xì)胞。分別在細(xì)胞增殖0、24、48、72和96 h時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度值。每組內(nèi)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7基因表達(dá)檢測(cè)用qRT-PCR方法進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)水平的定量分析。qRT-PCR反應(yīng)按FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche)說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)體系：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(2×) 5 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 0.2 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃復(fù)性延伸 60 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，每個(gè)樣品設(shè)3孔重復(fù)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用2-△Ct方法將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對(duì)的基因表達(dá)量。所用引物序列見(jiàn)表1。

2　結(jié)　果

2.1雞RB1基因打靶載體的構(gòu)建以及gRNA打靶效率的體外酶切檢測(cè)

將設(shè)計(jì)好的3個(gè)gRNA載體RB1-g4、RB1-g5、RB1-g6進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得mRNA(圖1A)，將上述得到的mRNA、包含潛在打靶區(qū)域的DNA片段和Cas9蛋白共孵育，通過(guò)比較DNA片段被酶切的比例來(lái)估計(jì)相應(yīng)gRNA的打靶效率(酶切率=切開(kāi)條帶/檢測(cè)條帶的吸光度值)。結(jié)果顯示，RB1-g4組的DNA片段全部被酶切，體外切割效率為100%，而RB1-g5和RB1-g6的體外切割效率分別為70%和60%(圖1B)。所以后續(xù)選取RB1-g4進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染等試驗(yàn)。

表1qRT-PCR的引物

Table 1Primers used for qRT-PCR

基因名稱(chēng)NameGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpSize退火溫度/℃AnnealingtemperatureRB1NM_204419GCCTTATTTATCTGGAGCAACAAGACGCACAGCAACAACT16060CyclinD1NM_205381AGAAGTGCGAAGAGGAAGTTGATGGAGTTGTCGGTGTA18660PCNANM_204170GTGCTGGGACCTGGGTTCGTATCCGCATTGTCTTCT15960Ki67NM_205505AGGTCCGTTCCCTCGTTCATTGTCGTCTGGGTCATC27060G0S2NM_001190924CGGGGCGAAAGAGCTGAGAGCACGTACAGCTTCACCAT17160A-FABPAY675941ATGTGCGACCAGTTTGTTCACCATTGATGCTGATAG14360E2F1NM_205219GGAATGGGTGCTGTGGGAGATAGCCAGGGAGGAGGAAACAAAC25360FASNM_205155AAGGAGGAAGTCAACGGTTGATGGTGAGGAGTCG19660β-actinNM_205518TCTTGGGTATGGAGTCCTGTAGAAGCATTTGCGGTGG33160

A.RB1基因上gRNA的靶位點(diǎn)示意圖：黑色方框?yàn)橥怙@子，斜體字母是gRNA的打靶序列，加粗字母是PAM序列，帶有下劃線(xiàn)的部分是打靶區(qū)域的酶切位點(diǎn)。B.各個(gè)gRNA打靶效率的體外酶切檢測(cè)結(jié)果：1.包含RB1-g4潛在打靶區(qū)域的DNA片段，長(zhǎng)度為403 bp；2.RB1-g4打靶效率的體外酶切檢測(cè)結(jié)果，將DNA片段切成213和190 bp；3.包含RB1-g5和RB1-g6潛在打靶區(qū)域的DNA片段，長(zhǎng)度為499 bp；4、5.分別是RB1-g5和RB1-g6打靶效率的體外酶切檢測(cè)結(jié)果，將DNA片段切割成了346和153 bpA.gRNA target sites in RB1：Exons are shown as black boxes，the gRNA-targeting sequences are the labeled in italic letters，and the protospacer-adjacent motif (PAM) sequences are the labeled in bold letters，the restriction sites at the target regions are underlined.B.In vitro cleavage activity assay of gRNA:The 1st (403 bp) and 3rd lanes (499 bp) are positive control；The 2nd lane is the RFLP result of RB1-g4 targeting activity in vitro detection，which separates the amplification fragment into 213 and 190 bp；The 4th and 5th lanes indicate the results of RB1-g5 and RB1-g6 targeting activity in vitro detection，which separate the amplification fragment into 346 and 153 bp圖1　gRNA的設(shè)計(jì)和打靶效率檢測(cè)Fig.1　Design and in vitro cleavage activity assay of gRNA

2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的雞前脂肪細(xì)胞中RB1基因的敲除

將RB1-g4質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ICPA-Ⅱ細(xì)胞。對(duì)篩選到的細(xì)胞提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用HpaⅠ內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割。共鑒定了10個(gè)細(xì)胞克隆，其中有1個(gè)克隆(命名為RB1-KO-1-4)即第3泳道的PCR產(chǎn)物不能被HpaⅠ酶切開(kāi)(圖2A)，初步推算CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞前脂肪細(xì)胞系中RB1基因的敲除效率為10%(1/10)。RB1-KO-1-4細(xì)胞克隆的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，這個(gè)細(xì)胞克隆的兩條同源染色體的打靶類(lèi)型分別為插入1個(gè)堿基和缺失5個(gè)堿基，造成了氨基酸的移碼突變(圖2B)，使氨基酸翻譯提前終止(圖2C)。對(duì)敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞和野生型的雞前脂肪細(xì)胞進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞的RB1基因表達(dá)量極顯著(P<0.01)的低于野生型雞前脂肪細(xì)胞的RB1基因表達(dá)量(圖2D)。由于目前針對(duì)雞這個(gè)物種的Western blot的抗體較少，之前的試驗(yàn)中也嘗試了一些商業(yè)化的針對(duì)哺乳動(dòng)物RB1基因的抗體，但是都沒(méi)有特異性反應(yīng)。所以本試驗(yàn)沒(méi)有利用Western blot的方法驗(yàn)證RB1基因的敲除。

A.HpaⅠ酶切鑒定；B.RB1敲除細(xì)胞的基因組類(lèi)型；C.基因突變和氨基酸突變結(jié)果，1個(gè)堿基的插入和5個(gè)堿基的缺失導(dǎo)致了氨基酸翻譯提前終止；D.雞RB1基因在野生型的雞前脂肪細(xì)胞和敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)情況。*.P<0.05，**.P<0.01，下同A.gRNA mutagenesis efficiencies were assessed by HpaⅠ；B.Sequence results confirmed RB1 deletion；C.1 bp insertion and 5 bp deletion in RB1 gene results in premature translation termination condon；D.RB1 transcriptional expression was significantly reduced in RB1 knockout chicken preadipocyte when compared with wild-type cells.*.P<0.05，**.P<0.01，the same as below圖2　CRISPR/Cas9介導(dǎo)RB1基因在雞脂肪前體細(xì)胞中的敲除Fig.2　Identification of RB1 gene knockout mediated by CRISPR/Cas9 in chicken preadipocyte

2.3RB1基因促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞的分化

為了檢測(cè)RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的影響，分別將敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞和野生型的雞前脂肪細(xì)胞以6×104個(gè)·孔-1的密度傳到6孔板中，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，加入油酸(終濃度為320 μmol·L-1)誘導(dǎo)細(xì)胞分化，此時(shí)記為試驗(yàn)0 h。持續(xù)誘導(dǎo)24、48、72和96 h后進(jìn)行油紅O染色(圖3A)并進(jìn)行提取比色和細(xì)胞數(shù)目的校正。結(jié)果如圖3B所示，在誘導(dǎo)分化24、48、72和96 h時(shí)，敲除組的油紅O提取比色的OD值均極顯著低于野生型組(P<0.01)。敲除組RB1基因的表達(dá)量極顯著或顯著(P<0.01，P<0.05)低于野生型組RB1的表達(dá)量(圖3C)。

A.油紅O染色(100×)；B.油紅O提取比色表明RB1基因敲除阻礙雞前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的脂滴形成；C.RB1基因在雞脂肪前體細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)呈上升趨勢(shì)，同時(shí)RB1基因在敲除組細(xì)胞中顯著低于在野生型雞前脂肪細(xì)胞的表達(dá)；D.敲除RB1基因影響了脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因(G0S2、FAS、A-FABP)的表達(dá)A.Oil red O staining(100×)；B.Oil red O extraction results showed that RB1 knockout impairs lipid formation；C.Expression of RB1 was increased during the differentiation of chicken preadipocyte and decreased in the RB1 knockout cells when compared with wild type cells；D.RB1 knockout decreased expression of differentiation marker genes such as G0S2，F(xiàn)AS，A-FABP圖3　敲除RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.3　Effects of RB1 knockout on chicken preadipocyte differentiation

為了研究RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響，在進(jìn)行油紅O染色的同時(shí)收集了5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，利用qRT-PCR的方法檢測(cè)雞前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因(G0S2、FAS、A-FABP基因)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化0、24、48、72和96 h時(shí)，敲除組G0S2的表達(dá)量極顯著低于野生型組(P<0.01)；誘導(dǎo)分化48 h時(shí)，敲除組FAS的表達(dá)量顯著低于野生型組(P<0.05)；誘導(dǎo)分化48 h時(shí)，敲除組A-FABP的表達(dá)量極顯著低于野生型組(P<0.01)，誘導(dǎo)分化72 h時(shí)，敲除組A-FABP的表達(dá)量顯著低于野生型組(P<0.05)(圖3D)。

2.4RB1基因抑制雞前脂肪細(xì)胞的增殖

為了檢測(cè)RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響，對(duì)敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞和野生型的細(xì)胞進(jìn)行了CCK-8檢測(cè)，結(jié)果顯示在細(xì)胞增殖24和48 h時(shí)，敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞的增殖速度要極顯著高于野生型的雞前脂肪細(xì)胞的增殖速度(P<0.01)(圖4A)。CCK-8試驗(yàn)證明RB1基因抑制細(xì)胞增殖，為了探究此抑制作用是否是由細(xì)胞周期變化引起的，隨后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了細(xì)胞周期檢測(cè)，結(jié)果如圖4B所示。敲除RB1基因引起雞前脂肪細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，G2期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。由此結(jié)果可以推測(cè)，雞RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程具有一定的抑制作用。

為了在mRNA水平上研究RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖相關(guān)基因的影響，分別將敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞和野生型的雞前脂肪細(xì)胞以每孔3×104個(gè)·孔-1的密度傳到6孔板中，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后記為0 h，然后分別在細(xì)胞增殖24、48、72和96 h收集細(xì)胞，以β-actin為內(nèi)參，利用qRT-PCR的方法分析RB1基因敲除對(duì)雞前脂肪細(xì)胞增殖過(guò)程中重要基因(CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA)表達(dá)情況的影響。

A.敲除RB1基因促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加；B.敲除RB1基因降低雞前脂肪細(xì)胞細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例，增加了G2期細(xì)胞的比例；C.敲除RB1基因影響了雞前脂肪細(xì)胞增殖過(guò)程中重要基因(Cyclin D1、E2F1、Ki67 and PCNA)的表達(dá)A.RB1 knockout increased chicken preadipocyte proliferation；B.RB1 knockout decreased the ratio of cells at G1 stage but increased the ratio of cells at G2 stage；C.RB1 knockout increased expression of cell proliferation associated genes such as Cyclin D1，E2F1，Ki67 and PCNA圖4　敲除RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響Fig.4　Effects of RB1 knockout on chicken preadipocyte proliferation

如圖4C所示，增殖24 h時(shí)，敲除組CyclinD1的表達(dá)量極顯著高于野生型組(P<0.01)；增殖24 h時(shí)，敲除組E2F1的表達(dá)量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時(shí)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；增殖24 h時(shí)，敲除組Ki67的表達(dá)量顯著高于野生型組(P<0.05)；增殖24、48和72 h時(shí)，敲除組PCNA的表達(dá)量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時(shí)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

3　討　論

基因編輯技術(shù)是研究基因功能的重要工具，早期的同源重組技術(shù)雖然能對(duì)目的基因進(jìn)行有效編輯，但效率極低。人工核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了基因組編輯的效率。目前比較常見(jiàn)的人工核酸酶系統(tǒng)主要有ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9 3種。但ZFNs和TALENs系統(tǒng)在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力[8-9]，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別依賴(lài)于gRNA與靶標(biāo)DNA之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)，使得質(zhì)粒的構(gòu)建更為簡(jiǎn)單、高效[10]。因此，本研究選用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)雞前脂肪細(xì)胞進(jìn)行基因打靶。結(jié)果顯示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)雞前脂肪細(xì)胞的敲除效率為10%。這與CRISPR/Cas9系統(tǒng)在其他物種細(xì)胞上的敲除效率相比要低一些[11]，造成打靶效率低的原因可能是由于這個(gè)系統(tǒng)在雞上的應(yīng)用還不夠完善，還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

RB1 基因已經(jīng)被證明參與了許多生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)過(guò)程。對(duì)人和小鼠的研究表明，RB1促進(jìn)肌細(xì)胞[12]、成骨細(xì)胞分化[13]以及紅細(xì)胞生成[14]。但是RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化和增殖的調(diào)控機(jī)理仍不明確。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了敲除RB1基因的雞前脂肪細(xì)胞，為研究RB1基因的作用機(jī)制提供了有效的模型。為了確定雞RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的作用，本研究將RB1基因在雞前脂肪細(xì)胞中進(jìn)行了敲除，并結(jié)合油紅O染色和提取比色的方法比較了敲除組和野生型組細(xì)胞的分化能力。結(jié)果顯示，敲除RB1基因之后，雞前脂肪細(xì)胞脂滴沉積能力減弱。先前有研究顯示，在體外培養(yǎng)條件下，RB1基因所編碼的蛋白pRb可促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成脂肪細(xì)胞[15]，造成上述結(jié)果是因?yàn)樵谛∈笈咛コ衫w維細(xì)胞中pRb能激活C/EBPs家族介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄途徑，進(jìn)而誘發(fā)脂肪細(xì)胞分化。M.Classon等[16]也發(fā)現(xiàn),在3T3成纖維細(xì)胞中加入pRb，隨著pRb濃度的增加，C/EBPα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄被激活，使細(xì)胞進(jìn)行分化，反之缺失pRb時(shí)3T3成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為分化受阻。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果是一致的。本研究利用qRT-PCR的方法檢測(cè)了在誘導(dǎo)分化的過(guò)程中脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化24、48、72和96 h時(shí)，敲除組G0S2基因的表達(dá)量極顯著低于野生型組(P<0.01)；誘導(dǎo)分化48 h時(shí)，敲除組的FAS基因的表達(dá)量顯著低于野生型組(P<0.05)；誘導(dǎo)分化48和72 h敲除組的A-FABP基因的表達(dá)量顯著低于野生型組(P<0.05，P<0.01)。T.Ma等[17]研究表明，在小鼠上敲除G0S2基因，小鼠的脂肪沉積能力要顯著的低于野生型的小鼠。H.X.Cui等[18]研究表明，F(xiàn)AS基因的表達(dá)決定著脂肪酸的合成能力，而脂肪酸又是脂肪的主要儲(chǔ)存形式甘油三酯合成所必須的原料。K.Motojima[19]研究表明，A-FABP基因在哺乳動(dòng)物的脂肪酸運(yùn)輸和脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。因此A-FABP、G0S2、FAS對(duì)于脂肪的合成以及脂肪的沉積起著重要的作用，并且這3個(gè)基因也是前脂肪細(xì)胞分化成成熟脂肪細(xì)胞的重要標(biāo)志基因。本研究結(jié)果顯示，在雞前脂肪細(xì)胞上敲除RB1基因之后，G0S2、FAS、A-FABP基因的表達(dá)量都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。由此可以得出結(jié)論，在雞前脂肪細(xì)胞敲除RB1基因減弱了前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的能力，即RB1基因促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞的分化。

為了檢測(cè)RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)CCK-8的方法發(fā)現(xiàn)敲除RB1基因促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖，這與對(duì)鼠坐骨神經(jīng)膜細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)干擾RB促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)的結(jié)果[20]是一致的。在哺乳動(dòng)物中，RB1主要通過(guò)與E2F作用，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[21]。由此猜測(cè)RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程有關(guān)。本研究對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果表明，敲除RB1基因引起雞前脂肪細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，G2期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。由此可以推測(cè)，雞RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程具有一定的抑制作用。利用qRT-PCR的方法檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，增殖24 h時(shí)，敲除組的CyclinD1的表達(dá)量極顯著高于野生型組(P<0.01)；增殖24 h時(shí)，敲除組的E2F1的表達(dá)量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時(shí)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；增殖24、48 和72 h時(shí)，敲除組的Ki67的表達(dá)量顯著高于野生型組(P<0.05)；增殖24、48和72 h時(shí)，敲除組的PCNA的表達(dá)量顯著高于野生型組(P<0.05)，在96 h時(shí)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白，是細(xì)胞G1期到S期的重要調(diào)控因子[22]，E2F轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控細(xì)胞周期中也具有重要角色[23-24]，CyclinD1與E2F共同參與以pRb 為主的細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[25]。Ki67和PCNA都是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[26-27]。在雞前脂肪細(xì)胞上敲除RB1基因之后，CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA基因的表達(dá)量都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。由此可以得出結(jié)論，雞RB1基因主要是通過(guò)抑制雞前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制雞前脂肪細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究首次驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞這一物種上應(yīng)用的可行性，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效介導(dǎo)雞細(xì)胞的基因敲除。另外，本研究發(fā)現(xiàn)RB1基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用，而對(duì)雞前脂肪細(xì)胞的增殖具有抑制作用。本研究結(jié)果驗(yàn)證了筆者之前的QTL定位分析結(jié)果，同時(shí)為更加深入的研究RB1基因在雞前脂肪細(xì)胞分化、增殖過(guò)程中所發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

CRISPR/Cas9 MediatedRB1 Knockout and Its Impact on Chicken Preadipocytes Differentiation and Proliferation

ZHANG Qi1，2，HUANG Jiao-jiao3，YANG Cai-xia1，WANG Yu-xiang1，2，ZHANG Hui1，2，ZHAO Jian-guo3，LI Hui1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；2.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreeding，MinistryofAgriculture，Harbin150030，China；3.StateKeyLaboratoryofStemCellandReproductiveBiology，InstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China)

In order to study the role ofRB1 gene on chicken preadipocyte differentiation and proliferation.CRISPR/Cas9 system was established and conducted to knockout theRB1 gene in the chicken preadipocyte.The proliferation and differentiation of chicken preadipocytes and the expression of related marker genes were detected.Results showed that the CRISPR/Cas9 system could effectively mediateRB1 knockout and cause truncated translation in chicken at the rate of 10%.Oil Red O and CCK-8 were used to evaluate the ability of differentiation and proliferation in chicken preadipocyte respectively.Knockout ofRB1 in chicken preadipocyte resulted in enhanced proliferation capability and decreased differentiation capability in chicken preadipocyte.RB1 knockout decreased the transcriptional expression of adipocyte differentiation associated genes such asG0S2，F(xiàn)ASandA-FABP.Especially，the expression ofG0S2 was significantly decreased at all stages of preadipocyte differentiation.Further，RB1 knockout increased the expression of cell proliferation associated genes such asCyclinD1，E2F1，Ki67 andPCNA, which was corresponded to the enhanced proliferation capability in theRB1 knockout cells.In summary，RB1 may be a key regulator on differentiation and proliferation of chicken preadipocyte.

CRISPR/Cas9；RB1；chicken；fat deposition；differentiation；proliferation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.005

2016-03-22

國(guó)家自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金)(31301960)；國(guó)家863項(xiàng)目(2013AA102501)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-42)

張琦(1990-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：zhangxiaoqi0405@163.com

李輝，教授，E-mail：lihui@neau.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2016)09-1775-10