廖成水，Boireau Pascal，劉明遠，程相朝

(1.河南科技大學(xué)，動物疫病與公共安全重點實驗室/河南省動物疫病與公共安全院士工作站，洛陽 471003；2.ANSES，Laboratory for Animal Health，Maisons-Alfort 94706；3.吉林大學(xué)，人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，長春 130062)

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胞外捕獲器：固有免疫細胞第三種防御機制的研究進展

廖成水1，3，Boireau Pascal2，劉明遠3，程相朝1*

(1.河南科技大學(xué)，動物疫病與公共安全重點實驗室/河南省動物疫病與公共安全院士工作站，洛陽 471003；2.ANSES，Laboratory for Animal Health，Maisons-Alfort 94706；3.吉林大學(xué)，人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，長春 130062)

胞外捕獲器(extracellular traps，ETs)的釋放是近來新發(fā)現(xiàn)的一種由DNA和顆粒蛋白組成的固有免疫防御機制。作為繼吞噬作用、自噬之后的第三種殺傷機制，大量的研究已經(jīng)證實ETs在體內(nèi)外可捕獲和殺傷絕大多數(shù)的細菌、病毒、真菌和寄生蟲，作者對ETs的概念、形成的分子機制以及ETs在宿主防御中的作用進行了簡要的介紹，這將對固有免疫細胞防御策略的新認識具有重要的意義。

固有免疫細胞；胞外捕獲器；外捕作用；殺菌活性

固有免疫細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分，是生物體在長期種系進化過程中形成的一系列免疫效應(yīng)細胞。一直以來，吞噬作用被認為是固有免疫細胞經(jīng)典的防御機制[1]，細菌、病毒、損傷的細胞以及衰老的紅細胞等有害物質(zhì)吞入細胞后形成吞噬小體，吞噬小體與溶酶體融合后通過酶的消化作用降解這些有害物質(zhì)。除了經(jīng)典的吞噬殺傷機制，自噬作用也被證實是固有免疫細胞的第二種防御機制，自噬作用可以清除侵入宿主細胞的革蘭陽性胞內(nèi)菌、兼性胞內(nèi)菌、病毒和胞內(nèi)寄生蟲等病原體[2]。2004年，德國科學(xué)家V.Brinkmann等發(fā)現(xiàn)了中性粒細胞新的殺傷機制，并將其命名為中性粒細胞胞外捕獲器(neutrophil extracellular traps，NETs)[3]，這是一個足以載入史冊的里程碑式的發(fā)現(xiàn)，使得人們對宿主固有免疫細胞防御功能的傳統(tǒng)觀念發(fā)生了改變，對免疫細胞的認識和研究進入了一個全新領(lǐng)域。

1　中性粒細胞胞外捕獲器與外捕作用

中性粒細胞是機體中數(shù)量最多的一種白細胞，中性粒細胞含有髓過氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性水解酶等多種顆粒蛋白成分，在炎癥和宿主防御方面起著重要的作用。很長一段時間內(nèi)，普遍認為中性粒細胞主要通過募集、吞噬以及NADPH氧化爆發(fā)和毒性蛋白發(fā)揮殺菌功能。然而，2004年，V.Brinkmann等首次發(fā)現(xiàn)了顛覆傳統(tǒng)的中性粒細胞殺菌機制，即人和小鼠中性粒細胞被1，2-丙二醇單甲醚乙酸酯(1，2-propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA)、LPS、IL-8和血小板以及革蘭陽性菌和革蘭陰性菌等外源物質(zhì)刺激后向胞外釋放一些網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)[3]，他們把這種網(wǎng)狀物質(zhì)稱為NETs。NETs主要由兩部分構(gòu)成：DNA和抗菌分子，以DNA為主骨架，抗菌分子包括來源于細胞核的組蛋白(H1、H2a、H2b、H3和H4)、一級嗜苯胺藍顆粒(中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶、細菌通透性增加蛋白、蛋白酶和防御素)、二級特殊顆粒(乳鐵蛋白、Cathelicidin LL37抗菌肽和正五聚蛋白3)和三級顆粒(明膠酶和肽聚糖識別蛋白)[4]。

如圖1所示，NET的形成過程大致可以描述為：受刺激中性粒細胞細胞核染色質(zhì)解聚，隨后細胞核特有形狀消失。緊接著核膜內(nèi)囊泡形成，加劇核膜的分解。同時，細胞質(zhì)中的顆粒膜分解促進染色質(zhì)和顆粒內(nèi)容物穿過破裂的細胞膜泄漏至細胞質(zhì)。最終細胞膜破裂，DNA與顆粒物的結(jié)合產(chǎn)物一起拋至細胞外環(huán)境中[5-6]。將細胞NETs形成的這個過程稱為中性粒細胞外捕作用(NETosis)，并且已證明了它是一種不同于凋亡和壞死的程序性細胞死亡方式。DNA片段化或細胞膜外暴露的磷脂酰絲氨酸是細胞凋亡的顯著特征，而NETosis形成與這些現(xiàn)象無關(guān)。與凋亡和壞死的另一個不同特征是NETosis形成時細胞核膜和顆粒膜均破裂。自NET發(fā)現(xiàn)以來NETs形成被認為是細胞死亡的一種新形式，但新近的一項研究顯示體內(nèi)中性粒細胞不因釋放NETs而發(fā)生溶解，仍然保持著移動和吞噬活性[7]，這表明NETs形成后細胞并未死亡，但這種現(xiàn)象仍有待于進一步研究。由于ETs這種胞外結(jié)構(gòu)首先在中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)，目前大部分關(guān)于ETs的研究都是圍繞中性粒細胞展開，因此，一開始將ETs形成的細胞死亡現(xiàn)象稱為NETosis，而隨后對ETs研究發(fā)現(xiàn)ETs現(xiàn)象廣泛存在于其他固有免疫細胞，從而將ETs形成的這個過程擴展為外捕作用(ETosis)[6]。

2　多種細胞形成胞外捕獲器參與免疫防御

自NETs殺傷機制被報道之后，大量的研究發(fā)現(xiàn)ETs并不是中性粒細胞所特有的現(xiàn)象，這種殺傷機制同樣也存在于肥大細胞[8]、嗜酸性粒細胞[9]、嗜堿性粒細胞[10]和巨噬細胞/單核細胞[11]以及雞異嗜白細胞[12]、河蝦白細胞等其他類型先天性免疫細胞。同時，ETs現(xiàn)象不僅局限于人和小鼠免疫細胞，而且馬、貓、牛、魚、無脊椎動物和植物細胞也可以釋放ETs。這些不同類型細胞受多種分子、微生物和微生物產(chǎn)物刺激后能夠產(chǎn)生ETs。有報道指出，由類絳色細胞釋放細胞外核酸是針對昆蟲病原微生物的一個重要的防御機制[13]。因為不同的細胞類型都能釋放DNA到細胞外環(huán)境，因此ETs被認為是一個普遍防御機制。不同類型細胞釋放ETs的共同特征是具有由抗菌多肽、蛋白酶和組蛋白等修飾的DNA構(gòu)成的主骨架[14]。

3　胞外捕獲器形成的分子機制

盡管目前對ETs的相關(guān)研究已經(jīng)取得了顯著的進展(圖2)，然而ETs形成的確切分子機制仍沒有得到完全闡明。但普遍認為ROS的生成和NADPH氧化酶的活性是參與ETs形成和ETosis的重要關(guān)鍵因素[15]。PMA屬于蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)酶家族合成的激活劑，是一種誘導(dǎo)ETosis最常使用的化合物。PKC直接激活NADPH氧化酶和ROS的產(chǎn)生。抑制NADPH氧化酶后發(fā)現(xiàn)中性粒細胞生成ETs的能力顯著下降，這體現(xiàn)了NADPH氧化酶在ETs釋放中的重要性[16]。慢性肉芽腫病(chronic granulomatous disease，CGD)患者由于NADPH氧化酶功能缺陷，因而從患者體內(nèi)提取的中性粒細胞在體外無法形成ETs[17]，而添加外源過氧化物后CGD患者中性粒細胞重新形成NETs。N-乙酰半胱氨酸、氯化二亞苯基碘鎓和6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸等ROS清除劑對NETosis的抑制作用與ROS產(chǎn)生量一致[18]。雖然這些研究資料充分說明了ROS在ETs形成的重要作用，但ROS是如何促進ETosis形成尚不清楚。其中一種可能性是ETosis形成期間ROS可使半胱氨酸蛋白酶失活，這些物質(zhì)直接改變中性粒細胞形態(tài)學(xué)[18]。

圖1　固有免疫細胞釋放ETsFig.1　ETs formation in innate immune cells

圖2　固有免疫細胞釋放ETs的分子機制Fig.2　Mechanisms of ETs formation in innate immune cells

研究報道指出，Rac2是NETosis信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的一個重要因子。gp91phox經(jīng)PKC磷酸化作用后結(jié)合細胞質(zhì)和細胞膜NADPH氧化酶亞基形成一個ROS的功能性復(fù)合體[19]。Rac1缺陷的中性粒細胞和野生型中性粒細胞受到PMA或LPS刺激后可釋放等量的NETs，然而Rac2缺陷的中性粒細胞不能形成一個功能性酶復(fù)合體，從而喪失形成NETs的能力[18]。此外，超氧化物進一步轉(zhuǎn)換為過氧化氫和高氯酸是NETs釋放過程所必需的一步。盡管在ETs形成過程中ROS的生成和NADPH氧化酶的活性被認為是至關(guān)重要的，但也有報道稱，某些條件下通過非ROS依賴途徑也可能發(fā)生NETosis[20-21]，如金黃色葡萄球菌[22]或杜氏利什曼原蟲[23]等微生物可通過夠獨立于ROS的分子過程釋放ETs。

ETosis形成是一個多因素的過程，僅通過NADPH氧化酶活性并不足以觸發(fā)這個過程。組蛋白肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)依賴的組蛋白H3瓜氨酸化亦是ETs形成的關(guān)鍵(圖2)。PAD4缺陷的小鼠中性粒細胞在體外喪失了形成NETs的能力[24]。添加毒胡蘿卜素可增加細胞內(nèi)Ca2+水平，增加的Ca2+水平可激活Ca2+-依賴的PAD4活性，導(dǎo)致組蛋白瓜氨酸化，這構(gòu)成ETs形成中的下游信號傳導(dǎo)過程[25]，從而誘導(dǎo)中性粒細胞形成ETs[26]。PAD4脫氨基作用是由炎癥或感染性刺激引起NETs的一個主要翻譯后修飾現(xiàn)象[25]。

雖然肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生ETs的分子機制與NETs有一些相似之處，但不同的細胞類型產(chǎn)生的ETs也表現(xiàn)出一定的差異，例如ETs形成的啟動機制、DNA骨架來源(細胞核或線粒體)、應(yīng)答細胞的比例及ETs釋放量和釋放時間等。中性粒細胞ETs骨架DNA來源于細胞核染色質(zhì)，嗜酸性粒細胞ETs骨架DNA來源于線粒體DNA，而嗜堿性粒細胞和巨噬細胞ETs骨架DNA同時來源于細胞核染色質(zhì)和線粒體DNA。嗜堿性粒細胞ETs依賴于ROS的生成，而不依賴于NADPH氧化酶的活性[27]。中性粒細胞ETs形成過程中顆粒蛋白在細胞內(nèi)與細胞核染色質(zhì)結(jié)合后一起釋放至細胞外環(huán)境，這些顆粒蛋白以游離形式結(jié)合至骨架DNA上，而嗜酸性粒細胞ETs形成過程中顆粒蛋白以完整的形式結(jié)合至骨架DNA[28]。

4　胞外捕獲器在宿主防御中的作用

雖然ETs捕獲或殺傷病原微生物的分子機制并未完全闡明，但大量的研究已經(jīng)證實了ETs可捕獲和殺死多種細菌、病毒、真菌和寄生蟲。因此，ETs在宿主防御中作用包括捕獲以及直接殺死病原微生物兩個方面。

4.1誘捕病原微生物

ETs所展現(xiàn)的第一步抗菌活性是通過物理黏附來完成，ETs結(jié)構(gòu)的陽離子和細菌表面的陰離子之間的靜電相互作用促使ETs形成捕獲能力[29]。利用電子掃描顯微鏡和免疫熒光顯微鏡等直接成像系統(tǒng)證實了ETosis形成后胞外DNA具有黏附肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌和弗氏志賀菌等多種不同病原體的能力[3，20，22]。雖然大量的資料證明了細菌可黏附于胞外DNA，但是這些高清成像試驗并不能百分之百確定NETs捕獲細菌，也有可能是細菌主動附著胞外DNA骨架上。為了支持捕獲假說，在體外利用流式小室系統(tǒng)證明了在生理調(diào)節(jié)下和正常血流速度下NETs能捕獲大腸桿菌。肝活體顯微鏡檢測顯示NETs在體內(nèi)可捕獲大腸桿菌[30]。此外，在體內(nèi)肺炎克雷伯桿菌感染的小鼠肺部中可見NETs捕獲的細菌[18]。

利用高速雙轉(zhuǎn)盤活體共聚焦顯微鏡分析更為清晰地觀察到內(nèi)毒素血癥肝NETs捕獲情況，NETs釋放入肝竇從而捕獲循環(huán)中的大腸桿菌，從而防止其進一步擴散[31]。利用細菌培養(yǎng)和分布模型非成像試驗間接支持NETs在捕獲細菌中的作用。真菌感染在中性粒細胞免疫缺陷的患者中是非常常見的，由于吞噬作用對于這些病原體無效，捕獲作用就顯得更為重要。利用掃描電子顯微鏡和共聚焦顯微鏡可觀察到白色念珠菌黏附于NETs結(jié)構(gòu)[32]，證明NETs可捕獲白色念珠菌[32-33]。利用免疫熒光和掃描電子顯微鏡體外以及雙光子顯微鏡在活體肺組織證實了NETs可捕獲煙曲霉[34]。雖然觀察到ETs捕獲真菌的現(xiàn)象，但怎樣有效結(jié)合并捕獲如此大的微生物仍然不清楚。胞外DNA骨架可能具有發(fā)揮直接捕獲功能，但有學(xué)者提出表面活性劑蛋白D和C型凝集素結(jié)合模式識別受體通過形成一個中間橋是結(jié)合病原菌和NETs的另一作用方式[35]。體內(nèi)試驗顯示，遷移的中性粒細胞釋放NETs覆蓋整個組織區(qū)域，從而形成了一個龐大的網(wǎng)狀捕獲結(jié)構(gòu)以阻止細菌擴散至血管或者淋巴管。由于具有DNA結(jié)合位點的纖維結(jié)合蛋白在組織間質(zhì)中高表達，使得NETs廣泛分布于組織中。這同樣可以解釋為何在體內(nèi)觀察到一大片DNA，而在體外常以絲狀形式存在。

4.2殺菌活性

ETs可通過捕獲作用限制病原體在體內(nèi)進一步擴散，但ETs是否具有直接殺傷病原體的能力是科研工作者所關(guān)心的重要問題。由于ETs主要組成成分包括組蛋白、DNA以及免疫細胞顆粒蛋白，而顆粒蛋白、組蛋白和DNA是重要的抗微生物分子，因此可以推論出這些結(jié)構(gòu)具有直接殺傷微生物的能力。早在數(shù)十年前科研工作者就發(fā)現(xiàn)了組蛋白的抗菌特性[36]，但當時并未闡明這些蛋白質(zhì)在細胞核外環(huán)境中的殺菌功能。同樣地，利用細胞松弛素D抑制中性粒細胞吞噬作用后，中性粒細胞仍然展現(xiàn)出殺菌活性，而同時添加外源DNase或者抗組蛋白H2A抗體以抑制ETs形成后無法觀察到殺菌活性[3]。這項研究間接表明中性粒細胞吞噬作用受到抑制后可通過ETs發(fā)揮殺菌能力。

增加某些抗微生物肽的局部濃度可能是ETs殺滅病原體的一個重要方式，DNA骨架聚集了高濃度的抗菌分子，增強了抗菌分子殺傷微生物的效率[8]。組蛋白是ETs中具有抗微生物特性的物質(zhì)。從各種生物體和不同類型細胞中分離得到的組蛋白和組蛋白相關(guān)肽表現(xiàn)出廣譜抗菌活性[4]，特別是組蛋白H2B對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌的抗微生物性質(zhì)[37]。除了組蛋白，黏附于DNA骨架上的免疫細胞顆粒蛋白同樣具有抗微生物作用。哺乳動物中兩種最重要的抗菌肽家族是防御素[38]和cathelicidins抗菌肽[39]。Cathelicidins屬于一個抗微生物肽家族，存在于中性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞等免疫細胞溶酶體中[40]。研究證實中性粒細胞和肥大細胞產(chǎn)生的ETs中存在cathelicidins抗菌肽[3，8]。然而，隨之而來的問題是抗菌肽黏附到胞外ETs的DNA骨架后是否仍保留著抗菌活性。NETs可能也具有調(diào)理某些真菌的功能，如NETs通過遠古抗體穿透素PTX3調(diào)理煙曲霉[41]。PMA刺激PMN產(chǎn)生的NETs可通過鈣衛(wèi)蛋白的鋅螯合作用抑制曲霉的生長[16]。PMA誘導(dǎo)的NETs同樣具有殺滅白色念珠菌的能力，這個殺傷機制與DNA和鈣網(wǎng)蛋白有關(guān)，但與組蛋白無關(guān)[32，42]。NETs的陽離子螯合作用同樣可能有助于殺傷條件性病原體，如假單胞菌[43]。

但是其他研究團隊并沒有證明NETs具有明顯的直接殺傷能力。由于沒有辦法在不影響中性粒細胞其他機制下直接抑制NETs形成，因此很難推斷NETs的殺菌作用。盡管可以清晰地觀察到NETs捕獲金黃色葡萄球菌，但DNase處理后釋放的活菌依然具有增殖能力[44]，這表明被捕獲的細菌未被殺死。向DNA骨架添加毒性抗菌顆粒蛋白酶證明了NETs的直接殺傷活性。但是在1980年晚期和1990年早期一系列研究很好地證明了中性粒細胞蛋白酶必須在一個游離空間才具有活性[45-46]。由于血漿中含有大量的α1-蛋白酶抑制因子活性，1 mL血漿可滅活5×108個中性粒細胞的彈性蛋白酶。那么，NETs形成釋放的彈性蛋白酶怎么維持其蛋白水解和抗菌活性依然不清楚，其中一個可能性就是在某種條件下骨架DNA結(jié)構(gòu)可保護彈性蛋白酶。A.McCormic等指出單獨依賴NETs機制并不能完全殺傷煙曲霉[47]，但它們可能減少菌體的極性生長[34]。

5　展　望

盡管對于ETs已經(jīng)進行了大量研究并有所進展，但ETs形成的具體機制仍然沒有得到完全闡明，ETs這個進化保守的古老免疫新機制的許多性質(zhì)和意義方面值得進一步詳細探索。尤其是cathelicidins或組蛋白等抗微生物活性成分的作用仍在研究和討論中。鑲嵌于DNA主骨架上的這些分子可以多大程度上發(fā)揮其生物功能也不得而知。本課題組在研究巨噬細胞METs時發(fā)現(xiàn)這種胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)對于大腸桿菌和白色念珠菌表現(xiàn)出一定的殺傷效應(yīng)，但與其他研究相比這種殺傷作用顯得不那么明顯[11]。另一個值得關(guān)心的問題是為什么只有一部分細胞可以釋放ETs，這一點有悖于ETs在這些細胞的功能生物學(xué)中的主要作用。因此，未來的研究方向首先是解決研究中的限制性因素，闡明ETs形成的詳細信號通路，進一步分析ETosis的調(diào)節(jié)機制，怎樣抑制和控制這些信號通路并為疾病治療提供靶向。

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(編輯白永平)

Research Progress on Extracellular Traps：the Third kinds of Defence Mechanisms of Innate Immune Cells

LIAO Cheng-shui1，3，BOIREAU Pascal2，LIU Ming-yuan3，CHENG Xiang-chao1*

(1.AnimalDiseaseandPublicSecurityAcademicianWorkstationofHenanProvince/TheKeyLabofAnimalDiseaseandPublicHealth，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LaboratoryforAnimalHealth，ANSES，Maisons-Alfort94706，F(xiàn)rance；3.KeyLaboratoryofZoonisisofMinistryofEducation，InstituteofZoonosis，JilinUniversity，Changchun130062，China)

Extracellular traps (ETs)，composed of DNA and granular proteins，act as a sort of new innate immune phagocytosis-independent extracellular defense mechanism which was discovered in recent years.As the third killing mechanisms of innate immune cells after phagocytosis and autophagocytosis，ETs can ensnare varied kinds of invading microbes inducing bacteria，virus，fungi，and protozoa to prevent local diffusion and kill theminvitro，and alsoinvivo.In this review，we will briefly describe the recent progress of the concept and molecular mechanism of ETs，and its role in host defense.This review has substantial significance on the new understanding of defense strategy in innate immune cells.

innate immune cells；extracellular traps；ETosis；bactericidal activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.004

2016-04-20

國家自然科學(xué)基金重點項目(31030064)；國家自然科學(xué)基金面上項目(31572489)；河南科技大學(xué)博士啟動基金項目(13480071)；河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金資助項目(2015QN033)

廖成水(1986-)，男，福建長汀人,副教授，博士，主要從事微生物感染與先天性免疫細胞作用研究，E-mail：liaochengshui33@163.com

程相朝，教授，主要從事動物疫病分子與免疫學(xué)機制研究，E-mail：chengxch@126.com

S852.42

A

0366-6964(2016)09-1768-07