景炅婕，潘洋洋，張瑩姣，馬 元，喬利英，劉建華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

MC1R蛋白在不同毛色太行山羊皮膚組織中的表達(dá)定位

景炅婕，潘洋洋，張瑩姣，馬 元，喬利英，劉建華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

MC1R基因是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物毛色形成的重要候選基因之一，編碼黑色素皮質(zhì)素受體1（MC1R），在哺乳動(dòng)物黑色素的代謝中發(fā)揮重要作用。分別選取純黑色、純白色、黃褐色和黑斑白色的太行山羊皮膚組織，通過HE染色技術(shù)，觀察太行山羊的皮膚組織結(jié)構(gòu)；利用免疫組化技術(shù)，對(duì)MC1R蛋白在4種毛色太行山羊皮膚組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。結(jié)果表明，太行山羊皮膚由表皮、真皮、皮下結(jié)締組織3部分組成；MC1R蛋白在4種毛色太行山羊的表皮、真皮中均沒有表達(dá)，但在純黑、黃褐和黑斑白色太行山羊毛囊中有表達(dá)，且主要集中在毛囊外根鞘處。研究結(jié)果為太行山羊進(jìn)一步的提純選育工作提供了一定的依據(jù)。

太行山羊；皮膚組織；MC1R；HE染色；免疫組織化學(xué)技術(shù)

哺乳動(dòng)物毛皮的顏色主要是由黑色素細(xì)胞中黑色素顆粒的數(shù)量、性質(zhì)和分布決定的［1］。黑色素是一種不溶于水和幾乎所有溶劑的無定型小顆粒。在動(dòng)物體內(nèi)，黑色素分為2類：真黑素和偽黑素。真黑素表現(xiàn)黑色和褐色2種毛色類型，而偽黑素表現(xiàn)黃色和紅色的毛色［2］。黑色素的合成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，受多個(gè)基因的共同調(diào)控。

MC1R基因是黑色素合成過程中重要的候選基因之一，只有1個(gè)外顯子，在哺乳動(dòng)物中由擴(kuò)散位點(diǎn)（extension locus，E）編碼［3］。MC1R 編碼黑素皮質(zhì)素受體 1（melanocortin 1 receptor，MC1R），也叫促黑素細(xì)胞素受體 （melanocyte stimulating hormonereceptor，MSHR），該受體在不同物種中均有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，一般約含有310個(gè)氨基酸［4］，其N末端位于細(xì)胞外，C末端位于細(xì)胞內(nèi)［5］，跨膜的肽鏈?zhǔn)铅谅菪Y(jié)構(gòu)，受體的胞外區(qū)與配體結(jié)合，胞內(nèi)區(qū)與G蛋白相連。

MC1R屬于G蛋白偶聯(lián)表面受體，是G蛋白偶聯(lián)受體家族中最小的一個(gè)，黑素細(xì)胞刺激素α（α melanocyte stimulating hormone，α-MSH）是多肽類激素，當(dāng)MSH與MC1R結(jié)合后，活化的G蛋白會(huì)激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，在Mg2+存在的情況下，催化三磷酸腺苷 （ATP）轉(zhuǎn)化為環(huán)腺苷酸（cAMP），cAMP水平升高時(shí)，會(huì)進(jìn)一步激活絡(luò)氨酸酶，催化黑色素形成［1，6］。

近年來，國內(nèi)外對(duì)于山羊MC1R基因的研究多集中于基因序列、基因結(jié)構(gòu)、變異位點(diǎn)、mRNA表達(dá)差異等方面的研究，但對(duì)山羊MC1R基因的皮膚組織表達(dá)特征研究較少。筆者以太行山羊MC1R基因編碼蛋白為研究對(duì)象，通過免疫組織化學(xué)方法，研究該蛋白在不同毛色太行山羊皮膚組織中的表達(dá)部位，以探討其在不同毛色太行山羊體內(nèi)的表達(dá)與太行山羊毛色發(fā)育之間的相關(guān)性，從而為太行山羊后期毛色的提純選育提供依據(jù)，也為更加合理地利用太行山羊的毛色資源奠定基礎(chǔ)。

圖1 太行山羊皮膚組織橫切面

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源：試驗(yàn)所用太行山羊均來自于山西省沁水縣。用取皮器分別采集純黑、純白、黃褐和黑斑白色太行山羊皮膚組織。

1.1.2 試驗(yàn)試劑：4%甲醛固定液，無水乙醇，二甲苯，蘇木精染液，0.1%酒精伊紅液，1%鹽酸—乙醇分化液，PBS緩沖液（pH值=7.4），一抗：人抗兔多克隆MC1R抗體，二抗：辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG SABC試劑盒，抗原修復(fù)液，DAB顯色試劑盒。相關(guān)試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 太行山羊皮膚組織的HE染色：將不同毛色太行山羊的皮膚組織用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，流水沖洗30min，然后在60℃恒溫箱中利用不同梯度的乙醇溶液脫水：70%乙醇 （2 h），80%乙醇（過夜），85%乙醇（2 h），90%乙醇（60min），95%乙醇（60min），無水乙醇（45min），無水乙醇∶二甲苯（1∶1，20min）；然后用二甲苯透明 40min，再進(jìn)行石蠟包埋，切片，烤片；之后按以下步驟對(duì)切片進(jìn)行HE 染色：二甲苯Ⅰ（15min），二甲苯Ⅱ（15min），無水乙醇Ⅰ（5min），無水乙醇Ⅱ（5min），95%乙醇Ⅰ（5min），95%乙醇Ⅱ（5min），90%乙醇（5min），80%乙醇（5min），70%乙醇（5min），50%乙醇（5min），蘇木精染色（5min），流水沖洗（2min），1%HCl-乙醇分化（10 s），1%氨水藍(lán)化（2min），70%乙醇（3min），80%乙醇（3min），90%乙醇（3min），0.1%酒精伊紅液染色（30 s），95%乙醇Ⅰ（3min），95%乙醇Ⅱ（3min），無水乙醇Ⅰ（3min），無水乙醇Ⅱ（3min），二甲苯Ⅰ（5min），二甲苯（5min）。

圖2 太行山羊皮膚組織縱切面

1.2.2 太行山羊皮膚組織免疫組化技術(shù)：石蠟切片的制作過程同HE染色；之后分別用二甲苯Ⅰ（15min），二甲苯Ⅱ（15min），無水乙醇∶二甲苯（1∶1，5min）對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理，再按以下步驟進(jìn)行梯度酒精水化：無水乙醇Ⅰ（5min），無水乙醇Ⅱ （3min），95%乙醇Ⅰ （3min），95%乙醇Ⅱ（3min），90%乙醇（3min），80%乙醇（2min），70%乙醇（2min）；再用 PBS（pH 值=7.4）沖洗組織切片（3min×3次）；滴加3%的H2O2溶液，隨后將切片放在加有PBS的濕盒內(nèi)，置于37℃的烘箱中孵育20min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；在95℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)15min；再用5%的BSA封閉液于37℃烘箱中孵育 40min；試驗(yàn)組滴加稀釋的一抗（1∶100），4 ℃過夜，陰性對(duì)照組滴加 PBS；室溫下平衡30min后 PBS（pH值=7.4）沖洗（3min×3次）；除去PBS緩沖液，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，37℃烘箱內(nèi)孵育30min；PBS（pH值=7.4） 沖洗 （5min×3次） 后在切片上滴加DAB顯色劑，37℃烘箱內(nèi)顯色5～8min，再用蒸餾水沖洗 （3min×3次）；蘇木精輕度復(fù)染，隨時(shí)觀察；自來水沖洗（2min×2次）；再用梯度酒精進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明；最后用中性樹膠封片，用PBS代替一抗體做陰性對(duì)照，細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性，根據(jù)顯色有無分為陽性和陰性，用Olympus顯微鏡鏡檢拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 太行山羊皮膚組織結(jié)構(gòu) 利用Olympus顯微鏡及Image-Pro PlusTM5.1圖像分析系統(tǒng)觀察太行山羊皮膚組織切片。從橫切面觀察（圖1）發(fā)現(xiàn)，由外向內(nèi)可分為表皮（C）、真皮（B）和皮下結(jié)締組織（A）3層，并可以觀察到一些毛囊結(jié)構(gòu)（D）。從縱切面觀察（圖2）發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)毛囊結(jié)構(gòu)由毛乳頭（A）、毛根（B）和毛囊組織（C）3部分構(gòu)成。

圖3 MC1R在太行山羊皮膚組織中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2 太行山羊MC1R蛋白在不同毛色太行山羊皮膚組織結(jié)構(gòu)中的表達(dá) 免疫組化切片顯微鏡下觀察可見，純黑色和黃褐色太行山羊皮膚組織中試驗(yàn)組著色均明顯（圖3A和圖3C），陰性對(duì)照組無特異染色（圖3B和圖3D）。試驗(yàn)組反應(yīng)區(qū)主要集中在毛囊外根鞘組織，而純白色山羊個(gè)體皮膚組織中試驗(yàn)組著色不明顯，與陰性對(duì)照組幾乎沒有差別。上述結(jié)果表明，太行山羊MC1R蛋白主要分布于皮膚組織中毛囊周圍的外根鞘組織，而且在純黑色個(gè)體中的表達(dá)量最高。

3 討論

3.1 山羊與綿羊皮膚組織結(jié)構(gòu)比較 表皮對(duì)皮膚具有保護(hù)作用。王樹迎等［7］通過測量山羊和綿羊的皮膚表皮層厚度，證實(shí)山羊（22.0～69.4 μm）皮膚的表皮層比綿羊（17.5～44.4 μm）厚。這可能是由于山羊的被毛較薄，外界各種刺激和摩擦容易直接接觸表皮，因此，山羊的表皮細(xì)胞層次較多。從HE染色結(jié)果來看，太行山羊的真皮乳頭層比網(wǎng)狀層厚，這點(diǎn)與綿羊比較相似。王樹迎等［7］研究表明，綿羊乳頭層厚度占真皮厚度的67.97%，這與綿羊以產(chǎn)毛為主，因此其乳頭層得到良好發(fā)育，網(wǎng)狀層相對(duì)減弱有關(guān)。資料顯示，太行山羊的羊絨生產(chǎn)性能較好，成年公羊平均抓絨量為275 g，平均剪毛量為400 g，因此其真皮乳頭層也比較厚。無論是山羊還是綿羊，皮膚中三毛囊群所占比例均較高。太行山羊三毛囊群中毛囊的排列規(guī)律與遼寧絨山羊的排列規(guī)律相似。初級(jí)毛囊都位于毛囊群同一側(cè)且與次級(jí)毛囊相間排列［8］。

3.2 關(guān)于MC1R基因及其編碼蛋白在皮膚組織的表達(dá)部位及表達(dá)量 有研究發(fā)現(xiàn)，羊駝皮膚組織中的黑色素細(xì)胞主要分布于表皮、毛囊周圍外根鞘組織、毛乳頭及毛球周圍［9］，且MC1R蛋白在棕色被毛中的表達(dá)量是白色被毛中的4.32倍［10］，表明MC1R基因表達(dá)的差異與羊駝的毛色表型間存在著相關(guān)性。存在該種相關(guān)性的原因可能是MC1R基因的表達(dá)量越多，就越能夠激活更多的酪氨酸酶，進(jìn)而促使黑色素細(xì)胞合成更多的黑色素，最終導(dǎo)致羊駝被毛顏色的加深。

太行山羊是皮肉兼用型品種［11］，主要分布于太行山東、西兩側(cè)的晉、冀、豫三省交界地區(qū)，具有體質(zhì)健壯、放牧適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。毛色以黑色為主，少數(shù)為褐、青、灰、白色。許多研究表明，MC1R基因在皮膚組織中表達(dá)。B?hm 等［12］和 Kauser等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚色素形成過程中，MC1R蛋白主要表達(dá)于人表皮、毛囊周圍外根鞘組織、真皮乳頭及毛球周圍。任玉紅等［9］利用免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，MC1R蛋白在白色和棕色羊駝皮膚組織中的表達(dá)部位與B?hm等［12］的研究結(jié)果一致，且MC1R在 2種毛色羊駝皮膚組織中的表達(dá)部位和表達(dá)量有所不同。該研究結(jié)果顯示，MC1R蛋白在純黑、黃褐、黑斑白色太行山羊個(gè)體中均有表達(dá)，表達(dá)部位集中于毛囊周圍外根鞘組織，在表皮、真皮乳頭和毛球周圍不表達(dá)，這可能是由于太行山羊毛色形成機(jī)制與其他物種不同，具體原因仍有待進(jìn)一步探究；MC1R蛋白在純黑色個(gè)體中表達(dá)量最高，同時(shí)，純白個(gè)體的試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比無明顯差異，這與該蛋白在毛色形成過程中的作用相對(duì)應(yīng)。在豬的研究上也有類似發(fā)現(xiàn)，純白個(gè)體的毛根和毛囊中均缺乏黑色素細(xì)胞及其前體［14］，也就是說MC1R蛋白在其皮膚組織中表達(dá)量較少。

4 結(jié)論

太行山羊的皮膚組織結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為表皮層、真皮層和皮下結(jié)締組織。其中真皮層最厚，表皮層最薄。MC1R蛋白在太行山羊皮膚組織中的表達(dá)部位集中于皮膚組織毛囊周圍的外根鞘組織，并且在純黑色皮膚組織中的表達(dá)量最高，在純白個(gè)體皮膚組織中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。在不同毛色個(gè)體中表達(dá)量的差異揭示太行山羊的毛色形成與MC1R蛋白的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。

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Expression and Localization of MC1R in the Skin Tissues of Taihang Goats with Different Coat Colors

JING Jiong-jie，PAN Yang-yang，ZHANG Ying-jiao，MA Yuan，QIAO Li-ying，LIU Jian-hua
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

MC1R is one of the important candidate genes that are associated with the regulation of mammalian coat colors.Melanocortin 1 receptor （MC1R）is encoded by this gene which plays important roles in the metabolism of mammalian melanin.In the present study,the structures of skin from the black,white,brown and white with black-spots Taihang Goats were observed using the HE staining method,respectively.Immunohistochemistry assay was performed to study the expression of MC1R in the skins of goats with different coat colors.Results showed that the skins of the Taihang Goats consisted of epidermis,subdermal and subcutaneous connective tissue.No expression MC1R of was found in epidermis and subdermal in the tissues from goats with different coat colors.However,the expression MC1R was observed in the hair follicles of the black,brown and white with blackspots Taihang Goats which was mainly distributed in the outer root sheath.The results obtained in this study provide a basis for the further genetic selection of Taihang Goats.

Taihang Goats；skin tissues；MC1R；HE staining；immunohistochemistry

S827.952；Q344.13

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）08-0005-04

2016－07－10

項(xiàng)目來源：山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項(xiàng)目（2015SY27）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120312010）；科技部863子課題（2011AA100307-05）。

景炅婕（1991—），女，博士研究生，主要研究方向?yàn)樯窖蚍肿舆z傳育種。

劉建華（1972—），女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榉肿訑?shù)量遺傳與動(dòng)物育種。

（責(zé)任編輯：趙俊利）