楊 鼎，吳江鴻，祁云霞，趙世華

（1.中國(guó)科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031）

牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成及其原核表達(dá)

楊 鼎1，吳江鴻1，祁云霞1，趙世華2

（1.中國(guó)科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031）

牛肌酸激酶是重要的能量代謝酶，尤其是在機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，會(huì)在局部存在特異性升高，具有潛在的疾病標(biāo)志物作用。根據(jù)牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列及大腸桿菌（BL21）密碼子的偏愛(ài)性，設(shè)計(jì)合成54條互相重疊的引物，通過(guò)組裝PCR分別合成CK-BB的6個(gè)片段CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6；再以基因頭ck-1和基因尾ck-54為引物，以CK-BB1、CKBB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6混合物為模板進(jìn)行第2輪擴(kuò)增；將得到的產(chǎn)物連接到pET28b載體上，挑取重組子測(cè)序。通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)人工合成的基因進(jìn)行校正，得到完全正確的CK-BB基因，為重組牛肌酸激酶同功酶CK-BB的規(guī)?；苽涞於嘶A(chǔ)。

牛肌酸激酶同功酶；密碼子優(yōu)化；全基因合成

肌酸激酶 （Creatine Kinase，CK，EC.2.7.3.2）又稱(chēng)磷酸肌酸激酶（Creatine PhosphoKinase，CPK），分子量為81～82 KDa，是由2個(gè)亞基（M和B）組成的二聚體，可逆催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)（見(jiàn)圖1）［1］。該反應(yīng)所產(chǎn)生的能量用于動(dòng)物體多種生理活動(dòng)，在動(dòng)物細(xì)胞代謝中起到關(guān)鍵作用。其中在機(jī)體組織受到損傷時(shí)，如心肌梗死，細(xì)胞內(nèi)的CK會(huì)被釋放入血，造成血液中CK濃度急劇升高，從而使CK成為診斷該病的指示物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)血清中CK值即可對(duì)心肌梗死做出早期診斷［2］。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，困擾養(yǎng)殖戶(hù)的常見(jiàn)疾病如奶牛關(guān)節(jié)滑膜炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病被發(fā)現(xiàn)時(shí)，病情已經(jīng)發(fā)展嚴(yán)重，很難治愈。而在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，CK都會(huì)有不同程度的升高，對(duì)于這些疾病的早期診斷具有重要意義［3-4］。

該研究采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，將牛肌酸激酶同功酶基因CK-BB按大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性進(jìn)行改造，并克隆到分泌型表達(dá)載體pET28b，構(gòu)建大腸桿菌分泌型重組表達(dá)載體pET28b-CK-BB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（E.coli BL21），獲得高效表達(dá)CK-BB的大腸桿菌工程菌株，為大規(guī)模制備牛肌酸激酶同功酶CK-BB奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 E.coli BL21（DE3）由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存，pET28b質(zhì)粒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。引物合成和測(cè)序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

圖1 由肌酸激酶逆催化的肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CK-BB基因遺傳密碼子改造及引物的設(shè)計(jì)與人工合成：根據(jù)牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列 （GenBank登錄號(hào)：AAX08725.1），在Bioedit軟件的輔助下推導(dǎo)出該基因的核苷酸序列，將起始密碼子ATG和終止密碼子TAA分別添加于CK-BB序列的5′端和3′端；使用DNAworks軟件［5］以大腸桿菌密碼子使用頻率為基準(zhǔn)，對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)合成54條互相重疊的40 bp引物（見(jiàn)表1），在引物CK-1和CK-54分別引入NdeⅠ和 XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物合成后經(jīng)脫鹽、PAGE純化，備用。

1.2.2 全基因序列的合成及校正：將相互重疊的引物分為6組，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，其PCR產(chǎn)物分別命名為CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CKBB5和CK-BB6。再以CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6為模板，以ck-1和ck-54為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，合成牛肌酸激酶同功酶CK-BB′。對(duì)合成后的全基因片段經(jīng)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)合成的片段有堿基缺失、增加、突變的錯(cuò)誤。以合成的基因CK-BB′為模板，利用PCR法對(duì)合成基因進(jìn)行校正，校正后的牛肌酸激酶同功酶全基因CKBB直接送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列分析。

1.2.3 重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET28b-CK-BB的構(gòu)建：以CK-1（5′-GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCCTTTCAGCAA-3′，下劃線(xiàn)處為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）和CK-54（5′-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCTGC-3′，下劃線(xiàn)處為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）為引物擴(kuò)增全長(zhǎng)牛肌酸激酶同功酶基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，插入相同酶切的pET28b載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b-CK-BB載體。具體方法參照參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.2.4 重組大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選：采用質(zhì)粒制備試劑盒提取pET28b-CKBB約5 μg，并用NdeⅠ將其線(xiàn)性化。酶切產(chǎn)物經(jīng)沉淀、洗滌、干燥后，用10 μL水溶解備用。取1 μL重組的pET28b-CK-BB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）菌株，42℃熱擊90 s，冰上靜置2 min后涂LB平板（含30 μg/mL卡那霉素），37℃培養(yǎng)過(guò)夜［7］。

圖2 牛肌酸激酶同功酶CK-BB的人工合成過(guò)程

1.2.5 pET28b-CK-BB融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：挑取表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）的單菌落于試管中（4 mL LB培養(yǎng)基，含30 μg/mL卡那霉素），37℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種于4 mL LB培養(yǎng)基中，添加30 μg/mL卡那霉素，37℃、220 r/min培養(yǎng)。當(dāng)OD值達(dá)到0.6左右時(shí)，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min、20℃誘導(dǎo)過(guò)夜；37℃繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，以未加IPTG誘導(dǎo)劑的菌液作為陰性對(duì)照。4 000 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清液，菌體用500 μL PBS（pH值7.4）緩沖液懸浮，超聲破碎6 min，超0.5 s停1.5 s，分別離心收集上清液和沉淀。沉淀用500 μL包涵體溶解液 （8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH值8.0）溶解，取40 μL樣品和10 μL 5× protein loading buffer混勻，沸水浴10 min。

表1 CK-BB全基因合成和擴(kuò)增編碼DNA引物序列

1.2.6 SDS-PAGE檢測(cè)：準(zhǔn)備12%的SDS-PAGE和Tris-Gly電泳緩沖液（Tris 30 g，甘氨酸144.0 g，SDS 10 g，定容至1 L），上樣量10 μL，濃縮膠80 V、20 min，分離膠120 V、60 min，凝膠電泳結(jié)束后考染20 min，脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 CK-BB基因片段的獲得 牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因人工合成過(guò)程見(jiàn)圖2。

2.2 小核苷酸片段的組裝 利用組裝 PCR合成200～300 bp的基因片段。得到6個(gè)大小分別為286、220、253、265、230、287 bp的片段 CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5、CK-BB6。

2.3 牛肌酸激酶全基因的合成 獲得的全長(zhǎng)基因產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后進(jìn)行末端A處理，克隆入pET28b載體并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），篩選并獲得了陽(yáng)性克隆子。

2.4 質(zhì)粒雙酶切反應(yīng) 結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 質(zhì)粒pET28b-CK-BB經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切

圖4 人工合成改造后的牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列

2.5 牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列 獲得的CK-BB全基因序列測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.6 SDS-PAGE分析 結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可以看出，在37℃沉淀中目的蛋白有明顯表達(dá)。

3 討論

在利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物的基因時(shí)，由于真核生物基因中的一些密碼子對(duì)于原核生物來(lái)說(shuō)是稀有密碼子，可能導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低［8］。影響目的基因在異源宿主中的表達(dá)效率的主要因素是不同宿主對(duì)密碼子使用頻率存在差異，因此，通過(guò)重新設(shè)計(jì)和合成宿主偏愛(ài)的密碼子可消除利用率低或稀有的密碼子，從而優(yōu)化目的基因的表達(dá)。該研究對(duì)牛肌酸激酶基因進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)和合成，從而優(yōu)化了該基因的表達(dá)。具體包括：①選擇使用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，使合成的基因在E.coli BL21中高效表達(dá)；②將相鄰片段的連接粘端設(shè)計(jì)成互補(bǔ)堿基，使退火后的基因片段之間能很好連接；③在基因兩端設(shè)計(jì)了必要的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，便于克隆表達(dá)。在該基礎(chǔ)上合成了1 180 bp大小的牛肌酸激酶全基因，經(jīng)測(cè)序表明人工合成的基因序列正確。結(jié)果表明，運(yùn)用優(yōu)化基因的合成策略，可以設(shè)計(jì)合成優(yōu)化的目的基因序列。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的在基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，以其成本低、生產(chǎn)率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)備受青睞，常作為表達(dá)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)［8］。經(jīng)典的E.coli BL21（DE3）菌株是lon和omp T蛋白酶缺陷型，而且為T(mén)7表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，添加了T7聚合酶基因。pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白最有效的系統(tǒng)，可生產(chǎn)大量目的蛋白［8］。

圖5 SDS-PAGE分析

在寡核苷酸片段的拆分之前對(duì)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，應(yīng)主要考慮密碼子的使用頻率、G+C含量、限制性酶切位點(diǎn)和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能等。有時(shí)目的基因內(nèi)某些重復(fù)元件還會(huì)影響基因在大腸桿菌內(nèi)的穩(wěn)定性，這些都需要在序列設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行檢查，應(yīng)盡量避免。

該研究利用Vienna RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在線(xiàn)軟件（http://rna.tbi.univie.ac.at/），采用RNAfold server對(duì)CK-BB基因mRNA折疊自由能進(jìn)行預(yù)測(cè)。缺省參數(shù)設(shè)置如下：溫度37℃，Na+離子濃度為1 mol/L，次優(yōu)性數(shù)p%=5%，計(jì)算折疊結(jié)構(gòu)數(shù)最大值=50，內(nèi)環(huán)/膨脹環(huán)數(shù)最大值=30。在DNA 2.0軟件的輔助下，以E.coli BL21密碼子使用頻率為基準(zhǔn)，同時(shí)兼顧mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和G+C含量，在不改變氨基酸順序的前提下，手動(dòng)對(duì)各簡(jiǎn)并密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)并人工合成了由E.coli BL21（DE3）偏愛(ài)密碼子組成的CK-BB基因序列，合成了優(yōu)化的牛肌酸激酶同功酶CK-BB基因，成功構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體pET28b-CK-BB，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得了高拷貝的菌株，為牛肌酸激酶同功酶CKBB的大規(guī)模表達(dá)純化奠定了基礎(chǔ)。

［1］楊鼎，趙世華，吳江鴻，等.幾種肌酸激酶的檢測(cè)方法［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2015，36（8）：16-19.

［2］王臨光，王海波，付強(qiáng)，等.急性冠脈綜合癥診斷中檢測(cè)心肌肌鈣蛋白Ⅰ肌紅蛋白及肌酸激酶同工酶及超敏C-反應(yīng)蛋白的意義［J］.河北醫(yī)學(xué)，2006，12（1）：1-3.

［3］何德肆，胡述光，歐陽(yáng)敘向，等.關(guān)節(jié)滑膜炎奶牛血液部分生化指標(biāo)的變化 ［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2007，27（1）：44-46.

［4］SATTLER T，F(xiàn)üRLL M.Creatine kinase and aspartate aminotransferase in cows as indicators for endometritis［J］. Journal of Veterinary Medicine Series A，2004，51（3）：132-137.

［5］HOOVER D M，LUBKOWSKIJ.DNAWorks：An automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis ［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（10）：e43.

［6］薩母克魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（上冊(cè)）［M］.黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2002：69-71.

［7］郭亮，沈微，王正祥，等.生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茶氨酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建 ［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（2）：41-45.

［8］解庭波.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展［J］.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版：醫(yī)學(xué)卷，2008，5（3）：77-82.

（責(zé)任編輯：趙俊利）

《畜牧與飼料科學(xué)》入選《中國(guó)學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)》統(tǒng)計(jì)源期刊

2015年10月，中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤(pán)版）電子雜志社有限公司、中國(guó)科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)研究中心聯(lián)合發(fā)布了《中國(guó)學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)（自然科學(xué)與工程技術(shù)·2015版）》?！缎竽僚c飼料科學(xué)》入選統(tǒng)計(jì)源期刊，并獲頒《中國(guó)學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)統(tǒng)計(jì)刊源證書(shū)》?！吨袊?guó)學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)》依據(jù)科技期刊在同學(xué)科、同研究層次的總被引頻次、影響因子、下載頻次等多項(xiàng)指標(biāo)，每年按照“優(yōu)入劣汰”的原則對(duì)其收錄的科技期刊進(jìn)行綜合篩選、評(píng)定。該年報(bào)的學(xué)術(shù)影響力已被眾多學(xué)術(shù)單位和科研院所廣泛認(rèn)可，是我國(guó)重要的科技期刊學(xué)術(shù)水平評(píng)價(jià)體系之一。

Whole Gene Synthesis and Prokaryotic Expression of Bovine Creatime Kinase Isoenzyme CK-BB

YANG Ding1，WU Jiang-hong1，QI Yun-xia1，ZHAO Shi-hua2
（1.Inner Mongolia Research Center for Prataculture，Chinese Academy of Sciences，Hohhot 010031，China；2.Institute of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot 010031，China）

The creatine kinase plays an important role in bovine energy metabolism.When inflammation occurs,there will be a locally-specific increase of CK.According,the creatine kinase may serve as a potential marker of bovine diseases.In this study,a total of 54 mutually overlapped primers were designed and synthesized according to the published amino acid sequence of bovine creatime kinase isoenzyme CK-BB and the codon usage preferred by E.coli（BL21）.A total of 6 DNA fragments of CK-BB gene, including CK-BB1,CK-BB2,CK-BB3,CK-BB4,CK-BB5 and CK-BB6,were synthesized by assembled PCR assay.Using the mixture of the 6 fragments as template,the second round PCR was conducted with head primer ck-1 and tail primer ck-54,and the amplifying product was connected with vector pET28b.The positive recombinants were subsequently identified,cloned and sequenced.A correct synthetic CK-BB gene was obtained by proofreading PCR assay,which lays a foundation for large-scale preparation of bovine isoenzyme CK-BB.

bovine creatime kinase isoenzyme；codon optimization；whole gene synthesis

S852.23

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）02-0029-05

2016－01－15

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新基金（2013QN JJM11）。

楊鼎（1981—），男，助理研究員，碩士，主要研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。

趙世華（1962—），男，研究員，主要從事草食家畜傳染病防控技術(shù)研究與推廣工作。