高東梅,劉洪泉,金　鵬,于姝媛,王　蘋,杜　波

(吉林大學第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,吉林 長春130021)

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30例大前庭水管綜合征患者SLC26A4基因診斷與聽性腦干電位特性分析

高東梅,劉洪泉,金鵬,于姝媛,王蘋,杜波*

(吉林大學第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,吉林 長春130021)

大前庭水管綜合征(Largevestibularaqueductsyndrome,LVAS)是一種臨床常見的先天性內耳畸形疾病，屬于常染色體隱性遺傳性非綜合征型聽力障礙性疾病，發(fā)病率占兒童和青少年感音神經性聾的1%-12%[1]。主要表現為波動性和進行性感音神經性聽力下降，發(fā)病年齡可以從出生后至青春期的任何年齡段。目前臨床診斷主要是顳骨高分辨率薄層CT掃描、SLC26A4基因突變篩查和聽性腦干電位檢測。本文收集了我科門診經顳骨CT掃描證實為LVAS的患者，通過聽力學檢測及耳聾基因芯片檢測，比較分析SLC26A4基因突變和腦干電位(ABR)檢測在LVAS臨床診斷過程中的特異性。

1　材料和方法

1.1臨床資料

檢測對象為2012年3月-2014年3月在吉林大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉科就診，經顳骨CT掃描證實為LVAS的患者30例，年齡5.5-28歲，不伴有其他臨床癥狀和體征。所有受檢者在進行基因檢測前均已簽署知情同意書。

1.2純音測聽和聽覺腦干電位檢測

純音聽閾測試:檢查在隔聲室內進行,應用AC40型純音聽力計測試純音聽閾。ABR檢測使用GSI-Audera聽覺誘發(fā)電位儀，短聲刺激，頻率為20次/秒，疊加1000次。ER-3A型插入式耳機。紐扣式電極,記錄置于發(fā)際,鼻根為地極,參考分別置于雙側乳突。記錄ABRI、III和V波潛伏期和V波反應閾。聽力損失分級根據1997年WHO制訂的標準判定。

1.3耳聾易感基因芯片檢測

取患兒外周靜脈血，EDTA-Na2抗凝處理，采用TIANampBloodDNAKit按說明書操作分離全基因組DNA?；蛐酒瑱z測采用遺傳性耳聾基因檢測芯片試劑盒(北京博奧生物工程公司)，按說明書操作。首先針對9個突變位點的9組引物分成兩個反應體系分別進行多重PCR擴增，擴增后PCR產物加熱至95℃變性5min，加入到10μl雜交緩沖液，將混合液加到芯片的點樣區(qū)域，加蓋玻片,封閉雜交盒,50℃預熱雜交箱中保溫1h。雜交結束后取出芯片，搖床洗滌2min，置入離心機中以1 200r/min離心2min甩干。使用晶芯LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀以90的激光掃描強度和532nm激發(fā)波長進行芯片掃描，相應軟件系統(tǒng)判讀雜交信號并進行結果分析,對信號不清的樣本，異地雙盲法驗證。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗，McNemar檢測，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1耳聾基因芯片檢測結果

采用晶芯耳聾九項，檢測LAVS患者SLA26A4 基因最常見的2個突變位點，IVS7-2A>G和 2168A>G。 30例受檢患兒中，耳聾基因突變陽性的有28例，占93.3%，其中SLC26A4基因純合和復合突變?yōu)?5例，單雜合13例。見圖1，具體患者基因表型見表1。

圖1　SLA26A4基因IVS 7-2 A>G 和 2168 A>G突變雜交圖表1　30例PDS患者ASNR和基因突變分析

編號發(fā)病年齡聽力損失(L/R)ASNR(L/R)PDS基因型CT掃描(L/R)12345678910111213141516171819202122232425262728293023出生出生342312371224511出生出生67433541122重度/重度重度/重度重度/重度重度/重度中度/中度中度/重度中度/重度重度/中度中度/重度中度/重度中度/中度重度/重度重度/中度重度/中度重度/中度中度/重度中度/中度重度/重度重度/重度重度/重度重度/中度重度/中度重度/中度重度/重度重度/重度重度/重度重度/中度重度/重度重度/重度輕度/輕度+/++/+-/--/+-/-+/++/++/-+/++/++/+-/--/--/+-/+-/-+/++/++/++/+-/+-/--/+-/--/--/-+/++/++/+-/-IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/IVS7-2A>G2168A>G/IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GwtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GwtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/wt+/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/+

2.2聽覺腦干電位檢測聲誘發(fā)短潛伏期負反應(ASNR)結果

聽性腦干反應(ABR)在90dB聲強誘導出電位反應波，根據潛伏期和振幅變化判斷負波相位置，確認ASNR，見圖2箭頭所示。結果發(fā)現，30例中20例患者，有34耳出現ASNR，見圖1，26耳陰性，ASNR陽性率為66.6%。

2.3SLC26A4基因突變與ASNR的相關性

對30例患者經顳骨CT掃描證實為LVAS的患者行ABR和基因芯片檢測，耳聾基因芯片檢測的檢出率要高于ABR的ASNR特性。結果對比分析見表1， 30例患者，13例PDS基因呈雜合狀態(tài)，15例純合或復合雜合。2例PDS基因呈野生型。對2例PDS基因呈野生型患者進行SLC26A4全基因測序分析結果顯示,1例1279T>C和2027T>A復合雜合,1例未見SLC26A4基因異常。20例ABR檢測引出ASNR，檢出率為66.6%。比較聽力損失程度和SLC26A4基因突變常見位點與ASNR引出的相關性，結果未見統(tǒng)計學差異。

A：正常人ABR檢測圖，B：LVAS患者的ABR檢測圖圖2　ABR檢測結果為ASNR

3　討論

大前庭水管綜合征在出生時多數患者聽力正常，在很長的一段時間內以漸進性出現聽力下降，誘因常與輕微顱外傷或氣壓性創(chuàng)傷有關，聽力學改變以感音神經性耳聾和混合性聾為主。診斷前庭水管擴大的金標準是影像學，顳骨高分辨CT顯示前庭水管外口寬度超過1.5mm即可診斷為大前庭水管綜合征。結合遺傳咨詢、聽力損失臨床特征和影像學結果，Everett等[2]提出大前庭水管綜合征是常染色體隱性遺傳病，SLC26A4基因突變是導致大前庭水管綜合征的遺傳學基礎。國內外學者[3-5]的研究發(fā)現，SLC26A4基因具有突變熱點，且具有種族特異性，在亞洲人群IVS7-2A>G和2168A>G是常見突變熱點。我們通過分析30例患者基因芯片耳聾九項篩查的結果發(fā)現，SLC26A4基因突變陽性檢出28例，其中純合和復合突變?yōu)?5例，單雜合13例，根據隱性遺傳規(guī)律，致病基因純合和復合雜合突變可以確診，而單雜合突變不能進行診斷，推測可能存在IVS7-2A>G和2168A>G突變位點以外的突變位點，表明SLC26A4基因是引起大前庭水管綜合征的常見基因。SLC26A4基因編碼的蛋白Pendrin是780個氨基酸構成的跨膜蛋白，開放閱讀框架2 343bp，由21個外顯子組成。朱發(fā)梅等采用基因芯片聯(lián)合PCR產物直接測序的方法，在30例大前庭水管綜合征患者中，共檢出28例有SLC26A4基因突變(93.33%)。發(fā)現16種突變類型，其中ⅣS7-2A>G突變的發(fā)生率最高，其次為2168A>G。16種突變中有5種剪接點突變，9種錯義突變和2種無義突變，這些突變分布于SLC26A4基因的大多數外顯子和部分內含子上[6]。另外大前庭水管綜合征可能存在其他的基因異常。Yang等[7]報道l例LVAS患者為SLC26A4和FOXI1復合雜合突變，說明了LVAS雙基因調控遺傳方式，FOXIl基因可能參與SLC26A4的轉錄調控，導致LVAS疾病的發(fā)生。SLC26A4基因IVS7-2A>G和2168A>G是常見突變熱點，利用基因芯片可對LVAS進行快速篩查，發(fā)現致病原因，但無法發(fā)現其它的突變位點，因此對基因芯片檢測發(fā)現SLC26A4基因突變單雜合的患者還需要進行DNA測序和影像學檢查。

近年來國內外研究者發(fā)現在聽性腦干反應檢測中LVAS具有特征性表現。即在高刺激強度(≥90dBnHL)時出現負相波，潛伏期為3.26±0.57ms。Nong等[8]將此反應稱為聲誘發(fā)短潛伏期負反應。國內郝劍萍等通過對大前庭水管綜合征與內耳其他畸形的聽性腦干反應特性進行分析，結果發(fā)現，LVAS組的ASNR檢出率為54%，而其他內耳畸形未出現ASNR。王秋菊等觀察到75.7% 的LVAS出現ASNR[9-10]。我們對30例LVAS患者進行常規(guī)ABR檢測發(fā)現ASNR陽性率為66.6%。進一步證實ASNR是LVAS臨床聽力學特征性表現,而且GJB2基因突變引起的DFNB1遺傳性耳聾未引出ASNR，認為通過觀察ASNR是否引出可對LVAS進行早期診斷。

我們將30例同時進行基因芯片、ABR檢測和顳骨CT掃描的診斷資料匯總分析發(fā)現，50%(15例)患者SLC26A4基因突變呈純合或復合雜合，43%(13例)SLC26A4基因突變單雜合，推測可能存在IVS7-2A>G和2168A>G以外的其他突變位點。2例野生型，經測序分析1例為1279T>C和2027T>A復合雜合，1例為野生型，可能存在其他的致病機制。其中1例CT掃描未出現前庭水管外口擴大，但基因芯片顯示IVS7-2A>G突變純合，未納入結果分析，推測CT掃描陰性與掃描位置有關。30例LVAS病例10例未檢出ASNR，檢出率為66.6%。盡管LAVS病例并不是全部表現出ASNR，但出現ASNR的耳聾患者可高度懷疑為LVAS，迄今尚未在其他內耳畸形的病例引出ASNR。

綜上所述，對出現LVAS臨床特征的病人，常規(guī)ABR檢測可以監(jiān)測聽力損失程度變化，判斷耳聾類型，通過是否引出ASNR，可初步判斷LVAS。進一步明確病因還需要進行SLC26A4基因突變檢測，而基因芯片因只包括常見的IVS7-2A>G和2168A>G突變熱點，可作為基因診斷的初篩手段，對于LVAS患兒，基因芯片診斷為雜合或野生型，父母希望生育第二個孩子，則必須進行SLC26A4全基因測序，發(fā)現致病的突變位點，并對胎兒進行產前診斷，才能有效避免耳聾出生。

[1]GriffithAJ,ArtsA,DownsC,etal.Familiallargevestibularaqueductsyndrome[J].Laryngoscope,1996,106(8):960.

[2]EverettLA,GlaserB,BeckJC,etal.Pendredsyndromeiscausedbymutationsinaputativesulphatetransportergene(PDS)[J].NatGenet,1997,17:411.

[3]СhurbanovAY,KarafetTM,MorozovIV,etal.WholeExomeSequencingRevealsHomozygousMutationsinRAI1,OTOF,andSLC26A4GenesAssociatedwithNonsyndromicHearingLossinAltaianFamilies(SouthSiberia)[J].PLOSOne,2016,11(4):e0153.

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[5]HuangS,HanD,WangG,etal.SensorineuralhearinglosscausedbymutationsintwoallelesofbothGJB2andSLC26A4genes[J].IntJPediatrOtorhinolaryngol,2013,77(3):379.

[6]朱發(fā)梅，胡鵬，賴若沙，等.基因芯片聯(lián)合DNA測序法在大前庭水管綜合征因診斷中的應用[J].中華耳科學雜志，2011，9(2)：168.

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[8]NongDX,UraM,OwaT,etal.Anacousticallyevokedshortlatencynegativeresponseinprofoundhearinglosspatients[J].ActaOtolaryngol,2000,120(8):960.

[9]郝劍萍，趙巖，閆文斐，等.大前庭水管綜合征與內耳其他畸形的聽性腦干反應特性分析[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010,24(13)：598.

[10]王秋菊,韓東一,蘭蘭,等.大前庭水管綜合征的診治策略研究[J].中華耳科學雜志,2006,4(4):315.

吉林省衛(wèi)計委科技項目(2014Z048)

1007-4287(2016)09-1586-04

2015-01-19)