包　亮，王貴民

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 甲狀腺外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

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ARMS法甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因檢測(cè)252例臨床病理分析

包亮，王貴民*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 甲狀腺外科，吉林 長(zhǎng)春130021)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占所有甲狀腺惡性腫瘤的85%-90%[1]，是甲狀腺癌中最常見(jiàn)的病理類型。眾所周知，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增加。鑒于日益增多的甲狀腺癌，其中絕大多數(shù)是亞臨床的，迫切需要找出一種可靠的術(shù)前分層方法(依據(jù)患者復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn))來(lái)確定是否進(jìn)行手術(shù)、手術(shù)的范圍以及術(shù)后輔助治療的需要。目前研究表明[2,3]，BRAF(鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體 B1)突變是甲狀腺癌中最常見(jiàn)的遺傳學(xué)改變，并且BRAF突變僅發(fā)生在乳頭狀癌和乳頭狀癌起源的未分化癌，而在髓樣癌、濾泡癌等其他甲狀腺惡性腫瘤和良性病變以及正常的甲狀腺組織中均未被發(fā)現(xiàn)。近期很多研究表明BRAF V600E突變與PTC高危的臨床病理特征、腫瘤的復(fù)發(fā)及131I治療的敏感性降低關(guān)系密切。然而，BRAF突變與PTC臨床相關(guān)性的研究仍存在爭(zhēng)議。因此，本研究旨在通過(guò)對(duì)吉林大學(xué)第一醫(yī)院1年期間行手術(shù)治療的252例PTC病例的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，來(lái)探討B(tài)RAF基因與PTC臨床的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1研究對(duì)象

選取2013年12月至2014年12月期間在吉林大學(xué)第一醫(yī)院甲狀腺外科由同一醫(yī)療團(tuán)隊(duì)進(jìn)行手術(shù)治療并有BRAF基因檢測(cè)結(jié)果的252例PTC患者作為研究對(duì)象。所有患者均符合以下選取標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后石蠟病理切片確診為PTC，住院期間的病例資料較完備；②由我院病理科通過(guò)蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS法)[4]檢測(cè)BRAF突變；③無(wú)頭頸部手術(shù)史的初次手術(shù)患者。

1.2研究方法

收集納入研究PTC患者的臨床病理資料，觀察患者在性別、年齡、家族史、被膜浸潤(rùn)、腫瘤腺葉分布、病灶數(shù)、區(qū)域(中央?yún)^(qū)、側(cè)頸)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴橋本性甲狀腺炎或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及臨床分期的BRAF基因表達(dá)情況，并按照腫瘤最大直徑將PTC分為T1≤0.5 cm組、0.5 cm2 cm組4組，觀察4組患者的BRAF基因表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料率的比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，并用logistic回歸分析的方法進(jìn)行因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1BRAF突變率以及對(duì)BRAF V600E突變與PTC臨床病理特征關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析

本組PTC患者的BRAF突變率為84.9%(214/252)。本組所有PTC病例術(shù)后病例亞型均為經(jīng)典型。對(duì)本組患者的性別、年齡、家族史、被膜浸潤(rùn)、腫瘤腺葉分布、病灶數(shù)、區(qū)域[中央?yún)^(qū)(Ⅵ區(qū))、側(cè)頸(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)±Ⅴ區(qū))]淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴橋本性甲狀腺炎或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及臨床分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并統(tǒng)計(jì)BRAF突變?cè)谶@些因素中發(fā)生的概率(見(jiàn)表1)，并對(duì)BRAF突變率在這些因素中用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行各組間率的比較，計(jì)算P值所得結(jié)果均大于0.05，即BRAF突變與上述因素間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為BRAF突變與上述因素有相關(guān)性。其中，本組252例病例的臨床分期依據(jù)AJCC第七版分化型甲狀腺癌(DTC)的TNM分期[5]：Ⅰ期149例、Ⅲ期51例、Ⅳ期52例，無(wú)Ⅱ期病例。對(duì)腫瘤最大直徑大小T(cm)進(jìn)行比較(見(jiàn)表2)，按T1≤0.5、0.52分層，比較其BRAF突變率，應(yīng)用行×列表格資料χ2檢驗(yàn)，得出P=0.645>0.05，即BRAF突變與腫瘤大小差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不認(rèn)為BRAF基因突變與腫瘤大小有相關(guān)性。

表1　BRAFV600E基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

注：P<0.05為差異具有顯著性。

表2　BRAFV600E基因突變與腫瘤大小的關(guān)系

此外，采用logistic回歸分析的方法對(duì)PTC的高危臨床病理特征與BRAF基因突變的關(guān)系行單因素及多因素分析(表3)，結(jié)果顯示BRAF基因突變與表中變量亦無(wú)相關(guān)性。

3　討論

目前，研究基因改變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用是臨床前沿?zé)狳c(diǎn)。研究已經(jīng)證實(shí)[21,22]，對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(FNAC)同時(shí)檢測(cè)BRAF V600E 基因突變有助于提高對(duì)PTC的診斷率，尤其是FNAC不能明確診斷的甲狀腺結(jié)節(jié)具有重要意義。BRAF V600E突變是BRAF突變中最常見(jiàn)和最具代表性的，占BRAF所有突變的90%以上[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7,8]，BRAF V600E 突變?cè)赑TC中發(fā)生率最高，達(dá)29%-83%。研究表明[2,9],MAPK通路的突變發(fā)生在約30%的癌癥中，而約8%的癌癥的發(fā)生是由于BRAF突變。而在MAPK通路中，BRAF基因突變可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，這一機(jī)制可能參與腫瘤早期的發(fā)生和發(fā)展[2]。

表3　單因素與多因素分析

注：?jiǎn)我蛩胤治觯篜<0.05有相關(guān)性；多因素分析：P<0.074有相關(guān)性

因此，進(jìn)一步研究BRAF V600E突變與PTC的臨床病理特征間的關(guān)系有助于闡明甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并為臨床醫(yī)生針對(duì)PTC患者治療策略以及預(yù)后的判斷給出重要的指導(dǎo)價(jià)值。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)BRAF V600E 突變率及其與PTC臨床病理特征聯(lián)系的研究結(jié)論不一。

本研究中BRAF突變率為84.9%(214/252),其比例高于文獻(xiàn)報(bào)道29%-83%[7,8]。但與韓國(guó)學(xué)者報(bào)道的突變率相符，其報(bào)道PTC中BRAF突變率為52%-87%[10,11]。本組檢測(cè)方法為ARMS法，檢測(cè)方法的不同可能是造成本組BRAF突變率較高的原因之一。在來(lái)自韓國(guó)的Jung Kwang Nam等[12]研究的424例PTC患者中，BRAF突變的比例為335/424(79%)，而按PTC病理亞型分類，經(jīng)典型的突變率為79.7%，濾泡亞型為62.5%(P=0.019)，并認(rèn)為，造成在韓國(guó)BRAF突變率較高的原因主要是該國(guó)的PTC病理亞型主要為經(jīng)典型PTC，且與其國(guó)內(nèi)人均碘攝入量高有關(guān)。而本組所有病例術(shù)后病理確診均為經(jīng)典型乳頭狀癌。我國(guó)在1996年起立法施行全民食鹽加碘政策，而文獻(xiàn)[13]報(bào)道，據(jù)WHO等組織規(guī)定的碘過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)[MUI(尿碘中位數(shù))>300 μg/L]，我國(guó)在1999年MUI早已到達(dá)306 μg/L，說(shuō)明我國(guó)早已總體達(dá)到碘過(guò)量水平。這與Jung Kwang Nam等研究觀點(diǎn)一致。

另外，需要指出的是，本組對(duì)BRAF突變研究的不足之處在于，本組病例均為術(shù)后病理診斷為PTC之后檢測(cè)的BRAF基因即回顧性分析，缺少任何降低選擇性偏倚的前瞻性研究；本研究為局部地區(qū)的少數(shù)病例，缺乏大多數(shù)研究的多元分析；且PTC病理組織學(xué)亞型單一(均為經(jīng)典型)。這些因素難免對(duì)BRAF突變率高低差異造成影響。

本研究對(duì)BRAF突變與性別、年齡(≥45歲/<45歲)、腫瘤大小、家族史、被膜浸潤(rùn)、單灶或多灶、腫瘤腺葉分布(單葉癌/雙葉癌)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴橋本甲狀腺炎、伴結(jié)節(jié)性甲狀腺腫以及臨床TNM分期間的關(guān)系(表1、2、3)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，不論是χ2檢驗(yàn)還是logistic回歸因素分析，均未得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。Ju-Han Lee等[14]對(duì)12項(xiàng)關(guān)于BRAF突變與PTC臨床病理因素相關(guān)性的研究中對(duì)1168例PTC病例進(jìn)行了Meta分析，結(jié)果顯示BRAF 基因突變與PTC組織學(xué)亞型，甲狀腺腺外擴(kuò)散和較高的臨床分期密切相關(guān)，而與PTC患者的年齡、性別、種族、或腫瘤的大小無(wú)顯著關(guān)系。但國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論尚不統(tǒng)一。Su-jin Kim等[15]報(bào)道,BRAF突變僅與甲狀腺腺外擴(kuò)散密切相關(guān)。而石臣磊等[16]對(duì)BRAF突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系的研究中報(bào)道，PTC僅與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著性關(guān)系。導(dǎo)致這種不一致的結(jié)論出現(xiàn)的原因尚待研究。但就本研究所得到的結(jié)果顯示，單獨(dú)檢測(cè)BRAF V600E突變尚不能為臨床對(duì)PTC的治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供有效的指導(dǎo)價(jià)值。

另外，在對(duì)本組與文獻(xiàn)報(bào)道[17]分析比較中發(fā)現(xiàn)，其與本組PTC病例均為同一醫(yī)療團(tuán)隊(duì)，文獻(xiàn)中研究對(duì)象為2009年7月至2011年2月的全切的PTC手術(shù)病例，其中被膜浸潤(rùn)143/221(64.7%)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移95/221(43.0%)，而本組中被膜浸潤(rùn)210/252(83.3%)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移139/252(53.2%)明顯高于前者。盡管本組病例手術(shù)切除范圍與前期病例相比更加規(guī)范，但不能完全解釋被膜浸潤(rùn)率增高的原因，筆者認(rèn)為本組病例惡性程度較前期文獻(xiàn)報(bào)道的要高。

這種BRAF突變與PTC高危臨床病理特征間不相關(guān)結(jié)論的得出可能與本組僅對(duì)BRAF基因進(jìn)行了檢測(cè)，而未對(duì)PTC其他基因檢測(cè)進(jìn)行比較分析，以及本組病例惡性程度較前期病例[17]增高有關(guān)。此外，本組252例病例中BRAF突變檢測(cè)陰性38例，陰性組病例相對(duì)過(guò)少可能也是原因之一。

綜上，鑒于本研究通過(guò)對(duì)BRAF突變與PTC臨床病理特征的研究，尚不能認(rèn)為單獨(dú)檢測(cè)BRAF基因突變能夠?yàn)榕R床個(gè)體化管理PTC患者提供有效的治療和預(yù)后評(píng)價(jià)的指導(dǎo)價(jià)值，而BRAF突變?cè)赑TC形成、發(fā)展中的致癌作用，已在很多研究中得到證實(shí)，近期有研究表明[18]，體細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因的啟動(dòng)子突變與PTC高侵襲性及BRAF V600E 突變密切相關(guān)。另有研究證明[19]，若在BRAF突變基礎(chǔ)上發(fā)生TERT啟動(dòng)子突變，PTC的侵襲性將明顯增加。由此，聯(lián)合檢測(cè)BRAF V600E 突變與TERT啟動(dòng)子突變將有望成為甲狀腺癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)中新的分子腫瘤標(biāo)志物，為甲狀腺癌臨床治療研究提供新的方向。

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