蔣俊青,顧安康

(天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1.皮膚科;2.病科理，天津300120)

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miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達研究

蔣俊青1,顧安康2

(天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1.皮膚科;2.病科理，天津300120)

目的探討miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達情況及影響。方法收集臨床銀屑病患者的皮損組織和健康皮膚組織，經(jīng)過速凍后提取miRNA。采用Stemp-loop技術(shù)反轉(zhuǎn)錄miRNA，采用RealtimePCR技術(shù)檢測miRNA的表達，采用絕對定量方法計算miRNA-210的拷貝濃度。免疫組化法對尋常型銀屑病皮損組織及正常皮膚組織中RUNX3蛋白的表達結(jié)果進行對比分析，并分別記錄。結(jié)果RealtimePCR顯示miRNA-210在尋常型銀屑病患者組皮損中表達量較健康組皮膚顯著降低(P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示RUNX3蛋白表達陽性率，尋常型銀屑病患者皮損中顯著高于健康組皮膚(P<0.05)。結(jié)論尋常型銀屑病患者皮損中miRNA-210顯示為低表達，其可能通過調(diào)節(jié)靶基RUNX3，參與銀屑病發(fā)病環(huán)節(jié)。

尋常型銀屑?。籱iRNA-210；基因表達

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1466)

銀屑病的發(fā)病機制一直未完全闡明，近年來，表觀遺傳學(xué)在其發(fā)病機制中的研究得到重視。有研究發(fā)現(xiàn)某些特定miRNA在銀屑病的發(fā)病中起著重要作用[1]，通過檢測miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達，以期探討銀屑病的發(fā)病機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料

所取皮損組織標本來自本院皮膚科門診已確診的28例尋常型銀屑病患者，其中男12例，女16例，平均年齡40.5(6-75)歲。對照組皮膚組織來自整形外科手術(shù)切除的26例健康皮膚組織，其中男11例，女15例，平均年齡42.5(8-77)歲。將已取皮膚組織凍存于液氮中待用。兩組實驗者除銀屑病之外的其他自身條件差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑

總RNA抽提試劑Trizol由西安融智生物技術(shù)有限公司提供、miRNA-210特異性引物由百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供、蛋白質(zhì)抽提試劑盒由上海名勁生物科技有限公司提供、miScriptSYBRGreenPCRkit等試劑及儀器由南京奧多福尼生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1檢測miRNA-210的表達將凍存組織碾碎，應(yīng)用相關(guān)試劑提取總RNA后，然后應(yīng)用上述反轉(zhuǎn)錄試劑盒將剛提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，詳細步驟按照儀器及試劑說明進行操作。用Real-timePCR檢測并對比28例尋常型銀屑病患者和26例健康對照的miRNA-210表達水平。

1.3.2檢測RUNX3蛋白表達采用免疫組化EnVision法檢測尋常型銀屑病皮損組織和健康組織中RUNX3的表達。對兩組組織病理切片進行顯微鏡觀察分析，并對結(jié)果進行分級評分，評分標準參考病理指標。計算切片著色程度及著色陽性細胞所占比例得分，并將兩者乘積作為最后的得分，得分≧4分者為陽性，計算陽性率并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1miRNA-210的表達水平

Real-timePCR實驗結(jié)果顯示尋常型銀屑病患者皮損與正常組織相比，miRNA-210的表達顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1　皮損與正常皮膚組織miRNA-210表達情況

2.2RUNX3蛋白表達水平

免疫組化結(jié)果顯示：尋常型銀屑病患者皮膚組織RUNX3蛋白表達水平明顯高于正常皮膚組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值=24.36，P<0.05)，見表2。

表2　皮損與正常皮膚組織RUNX蛋白3表達情況

3　討論

銀屑病的發(fā)病機制，目前多認為是多種因素相互影響作用導(dǎo)致的，包括感染、代謝、遺傳、免疫和環(huán)境因素[1]。表觀遺傳學(xué)在銀屑病的發(fā)病機制中起著重要作用，其中包括非編碼小RNA(如miRNA)的調(diào)控等[2]。miRNAs是人體種類最多的調(diào)節(jié)基因，占人類基因組的1%-5%，控制約30%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達，目前為止，發(fā)現(xiàn)的miRNA種類就有上千種。miRNA主要是通過與mRNA的3`端非編碼區(qū)結(jié)合進而抑制翻譯或引發(fā)mRNA降解，阻遏基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，對細胞代謝等多個環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響。有研究表明miRNAs在銀屑病的發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]，miRNA-203是銀屑病中第一個被發(fā)現(xiàn)的miRNA，研究證實其表達具有組織特異性，在皮膚中的表達明顯高于其他組織器官，而在在銀屑病患者皮損處表達又顯著高于正常皮膚。miRNA-203靶基因為細胞因子通路抑制因子3(suppressorofcytokinesignaling3,SOCS-3)[4]，SOCS-3對表皮角質(zhì)形成細胞的增殖分化有重要調(diào)節(jié)作用，SOCS-3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(singaltransduserandactivatoroftranscription,STAT3)通路的負性調(diào)節(jié)因子，可抑制STAT3的活化，而STAT3信號通路激活是導(dǎo)致銀屑病皮損發(fā)生的重要機制之一，而miRNA-203表達上調(diào)使得STAT3信號通路持久性激活，引起皮膚銀屑樣變，但miRNA在銀屑病皮損高表達的機制以及如何調(diào)控靶基因表達的機制仍待進一步的研究。有研究[5]通過基因芯片技術(shù)篩選出一些銀屑病相關(guān)差異性表達的miRNA，如miRNA-21、miRNA-203a、miRNA-146a、miRNA-125b等，這些miRNA已被證實在銀屑病皮損組織中表達，參與調(diào)控銀屑病基因調(diào)控，進而增加皮損的炎癥反應(yīng)和角質(zhì)形成細胞的增生。

我們通過real-timePCR技術(shù)，證實了miRNA-210在尋常型銀屑病患者皮損中相對于健康皮膚組織顯著表達下調(diào)。對miRNA-210靶基因查找發(fā)現(xiàn)，RUNX3可能是其潛在靶基因?，F(xiàn)已在銀屑病發(fā)病的免疫分子學(xué)中發(fā)現(xiàn)Th1細胞異?；罨纱龠M炎性因子的釋放和炎癥放大，使得炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生和角質(zhì)形成細胞異常增殖分化，最終導(dǎo)致銀屑病的皮損出現(xiàn)。有研究[6]發(fā)現(xiàn)由Th1細胞分泌的細胞因子IL-2、INF-γ均高表達于銀屑病患者血清及皮損，而WongWF等[7]發(fā)現(xiàn)RUNX3可促使CD4+T細胞向Th1細胞分化，并將促進上述細胞因子分泌。綜上，RUNX3參與銀屑病皮損的發(fā)生，并在其中起到一定的作用。另外，我們比較了尋常型銀屑病患者皮損組織中的RUNX3蛋白表達陽性率，結(jié)果顯著高于健康皮損組，且發(fā)現(xiàn)miRNA-210的表達水平和RUNX3蛋白水平呈負相關(guān)，證實miRNA-210 可以作用于RUNX3基因，通過對基因的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制RUNX3的蛋白表達，而具體的調(diào)節(jié)機制需要進一步深入研究。

[1]陳春麗,劉新梅,普雄明，等.微RNA在銀屑病中差異表達的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2016,(3):443.

[2]KooistraSM,HelinK.Molecularmechanismsandpotentialfunctionsofhistonedemethylases[J].NatRevMolCellBiol,2012,13(5):297.

[3]禹歡歡,王曉華,蔡碧珊,等.銀屑病相關(guān)miRNAs表達的研究進展[J].皮膚性病診療學(xué)雜志,2015,(3):258.

[4]XiaJ,JoyceCE,BowcockAM,etal.NoncanonicalmicroRNAsandendogenoussiRNAsinnormalandpsoriatichumanskin[J].HumMolGenet，2013,22(4):737.

[5]楊志波,唐雪勇.銀屑病差異表達microRNA與靶基因及基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2012,11(2):69.

[6]HeJ,WuJ,XuN,etal.MiR-210disturbsmitoticprogressionthroughregulatingagroupofmitosis-relatedgenes[J].NucleicAcidsRes,2013,41(1):498.

[7]WongWF,KohuK,ChibaT,SatoT,SatakeM.InterplayoftranscriptionfactorsinT-celldifferentiationandfunction:theroleofRunx[J].Immunology,2011,132(2):157.

StudyontheexpressionofmiRNA-210intheskinlesionsofpsoriasisvulgaris

JIANG Jun-qing,GU An-kang.

(Department of Dermatology,the Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute,Tianjin 300120,China)

ObjectiveToexploretheexpressionofmiRNA-210inthelesionsofpsoriasisandtheinfluenceofthedisease.MethodsTheskintissueofclinicalpatientswithpsoriasisandthehealthywerecollected.ThemiRNAwasextractedbyusafterquick-frozen.TheStemp-looptechnologywasusedtoreversetranscriptionofmiRNAandRealtimePCRtevhniquewasappliedtoidentitytheexpressionofmiRNA.ThestandardcurveshouldbemadeandthemiRNA-210copiesofconcentrationbecalculatedbyabsolutequantitativemethod.Thet-testwasusedtocomparethedifferencebetweenpsoriaticskinlesionstissuesandthenormalskintissues,andAp-valuelessthan0.05wasconsideredstatisticallysignificant.TheexpressionofRUNX3inthetwotissuegroupsweredeterminedwithimmunohistochemicalmethod.ResultsRealtimePCRshowedthattheexpressionofmiRNAinpatientswithpsoriasisvulgarisgroupsdecreasedsignificantlycomparedwiththenormalgroups(P<0.05).TheresultsofimmunohistochemistrydemonstratedthattheexpressionofRUNX3proteininskinlesionsofpatientswithpsoriasisvulgarisweresignificantlyhigherthanthatnormalskin(P<0.05).ConclusionLowerexpressionofmiRNA-210wasdetectedinthelesionsofpatientswithpsoriasisvulgaris.ThemiRNA-210mayeffectonitstargetgenesRUNX3andthenplayaroleintheonsetofpsoriasis.

psoriasisvulgaris;microRNA-210;geneexpression

1007-4287(2016)09-1466-03

R758.63

A

2015-09-08)