唐富山，覃　飛，吳　慶，周旭美

(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義　563099)

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技術(shù)與方法

氣相色譜法測定自制山銀花露中芳樟醇的含量*

唐富山，覃飛，吳慶，周旭美

(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義563099)

目的 建立測定山銀花露中芳樟醇的氣相色譜方法。方法 采用水蒸氣蒸餾法制備山銀花露; 氣相色譜法采用Agilent HP-5MS色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm), 柱初始溫度為70 ℃, 程序升溫到250 ℃; 汽化室溫度為260 ℃;載氣:高純N2,流速:1 mL/min;進樣量為3 μL。采用樟腦為內(nèi)標以內(nèi)標法測定芳樟醇含量。結(jié)果 制劑輔料和測定用溶劑不干擾測定,芳樟醇2.16～216 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,測得標準曲線回歸方程為y=66.455x+0.006 6(R2=0.999 4),平均加樣回收率為98.4%(RSD=1.4%)。結(jié)論 所建立的芳樟醇氣相色譜定量方法專屬性強、精密、準確, 可用于山銀花露的質(zhì)量控制。

芳樟醇; 氣相色譜; 山銀花; 露劑; 質(zhì)量控制

山銀花為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬等的干燥花蕾或帶初開的花[1-2], 采收、干燥后為常用中藥, 臨床應用廣泛。山銀花的主要化學成分[2-5]有綠原酸類(綠原酸、異綠原酸)、黃酮化合物類(槲皮素、木犀草苷等)、揮發(fā)油類(芳樟醇、棕櫚酸、亞油酸、香葉醇、松油醇以及辛烯醇等)?；覛置潭饕L于湖南、四川、貴州、廣西等地且藥材質(zhì)量較好, 產(chǎn)量高, 資源蘊藏豐富。山銀花是貴州省重要的經(jīng)濟作物及綠化樹種, 具有重要的藥用價值和經(jīng)濟效益[6- 7]。山銀花中揮發(fā)油及揮發(fā)油中揮發(fā)性成分分析已有報道[8-9], 研究表明芳樟醇是山銀花中最重要的揮發(fā)性成分, 占揮發(fā)油總量的24.51%。目前市面銷售的金銀花露產(chǎn)品較多, 而山銀花露產(chǎn)品則相對較少, 基于山銀花與金銀花揮發(fā)性成分的區(qū)別和可能藥效的一致性[4,10-11], 為了開發(fā)山銀花更多的利用價值, 我們參考中國藥典和有關(guān)文獻[1,12]研究制備了山銀花露。文獻中關(guān)于氣相色譜法測定金銀花露中芳樟醇含量已有報道[13], 但測定山銀花露中芳樟醇含量作為其質(zhì)量控制的研究未見報道。本文建立了氣相色譜法測定自制山銀花露中芳樟醇含量的方法，旨在為山銀花露的質(zhì)量控制提供試驗依據(jù), 促進山銀花資源的有效利用。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑山銀花藥材(購自貴州省遵義市綏陽縣小關(guān)鄉(xiāng), 經(jīng)遵義醫(yī)學院生藥學教研室楊建文主任藥師鑒定為灰氈毛忍冬); 芳樟醇對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號: 00608); 樟腦對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號: 110747-201008); 其余制備用試劑為分析純或化學純, 分析用試劑均為分析純, 水為超純水。

1.2實驗儀器氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent, 型號: 5973N); 揮發(fā)油測定器; 電子天平(北京賽多利斯天平有限公司); Dura12純水處理器(澤拉布儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1山銀花露的制備參考中國藥典金銀花露的制備方法[1-2], 按如下流程制備: 取山銀花65 g, 水蒸汽蒸餾, 收集蒸餾液1 000 mL, 加入適量的蔗糖(矯味劑)、亞硫酸氫鈉(抗氧化劑)和苯甲酸鈉(防腐劑), 并以氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)其pH為3.6, 過濾, 灌裝, 滅菌, 即得。

1.3.2溶液的配制

1.3.2.1內(nèi)標物溶液的配制精密稱取樟腦對照品7.6 mg, 于25 mL的容量瓶中加入無水乙醇制備成含樟腦0.304 mg/mL的內(nèi)標物溶液。

1.3.2.2對照品溶液儲備液的配制精密稱量芳樟醇對照品10.8 mg, 放置于25 mL的容量瓶中, 用無水乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即為對照品溶液儲備液。

1.3.2.3揮發(fā)油的提取與供試品溶液的制備取山銀花露100 mL, 置于150 mL的圓底燒瓶中, 加入氯化鈉20 g, 連接揮發(fā)油測定器,在其上端加水裝滿刻度部分, 并溢流入圓底燒瓶為止, 再加入乙酸乙酯2 mL, 然后, 加熱到沸騰并保持微沸2 h, 放置冷卻后再吸取乙酸乙酯層, 加入適量無水硫酸鈉脫去多余的水分。取其上層清液置于5 mL容量瓶中, 然后, 精密加入0.5 mL內(nèi)標物溶液, 用無水乙醇稀釋至刻度, 搖勻, 即為供試品溶液。

不含山銀花的山銀花露陰性樣品供試溶液, 除不加入山銀花藥材和內(nèi)標物樟腦外, 按山銀花露制備及本項下完全相同步驟制備。

1.3.3氣相色譜試驗法對對照品和供試品溶液中的揮發(fā)性成分采用氣相色譜分析, 所得結(jié)果用內(nèi)標法計算樣品中芳樟醇的相對百分含量。色譜條件: Agilent HP-5MS色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm); 程序升溫: 初始溫度為70 ℃, 保持1 min, 以3 ℃/min的速率升溫到130 ℃, 再以50 ℃/min的速率升溫到250 ℃, 維持10 min; 汽化室溫度: 260 ℃; 載氣: 高純N2, 流速: 1 mL/min; 進樣量為3 μL; 分流比20∶1。

1.3.4分析方法的方法學考察

1.3.4.1方法專屬性吸取配制好含有內(nèi)標物樟腦的供試品、對照品及不含山銀花的山銀花露陰性樣品供試溶液各適量, 按1.3.3項下色譜條件分別進行氣相色譜測定, 記錄色譜圖, 對比芳樟醇和樟腦的出峰情況和保留時間。

1.3.4.2線性關(guān)系試驗精密量取已配好的對照品儲備液0.05、0.1、0.3、1.0、2.0、5.0 mL, 分別置于10 mL容量瓶中, 各精密加入內(nèi)標物溶液0.5 mL, 用無水乙醇稀釋至刻度, 制備系列對照品溶液。按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜法分析。以芳樟醇與內(nèi)標物的峰面積比對濃度比進行線性回歸, 求取標準曲線回歸方程。以芳樟醇對內(nèi)標物濃度之比為橫坐標, 芳樟醇對內(nèi)標物的峰面積之比為縱坐標, 繪制標準曲線。

1.3.4.3精密度試驗精密量取已配好的對照品儲備液1.0 mL, 置于10 mL容量瓶中, 精密加入已配好的內(nèi)標物溶液0.5 mL, 用無水乙醇稀釋至刻度, 將配好的溶液按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜法分析, 連續(xù)進樣6次, 記錄芳樟醇及內(nèi)標物的峰面積。

1.3.4.4重復性試驗在較短的時間間隔內(nèi), 取已配好的供試品溶液按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜法分析, 連續(xù)進樣6次, 記錄芳樟醇及內(nèi)標物的峰面積。

1.3.4.5穩(wěn)定性試驗分別在供試溶液配制后0、1、2、4、8 h, 按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜法分析, 記錄芳樟醇及內(nèi)標物的峰面積。

1.3.4.6加樣回收率試驗精密吸取已知芳樟醇濃度的山銀花露約100 mL, 精密加入一定量的芳樟醇對照品溶液, 按1.3.2.3節(jié)方法提取揮發(fā)油并制備供試品溶液, 按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜法分析。計算加樣回收率。

1.3.5樣品含量測定取3個批次的自制山銀花露, 按1.3.2.3節(jié)方法提取揮發(fā)油并制備供試品溶液, 按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜法分析。記錄峰面積, 計算樣品含量。

2　結(jié)果

2.1方法專屬性供試品、對照品及陰性樣品色譜圖(見圖1)。色譜圖顯示, 對照品芳樟醇與內(nèi)標物樟腦分離良好, 出峰時間適宜; 樣品及由樣品提取的揮發(fā)油中其它成分對芳樟醇測定沒有干擾。芳樟醇對照品中加入內(nèi)標物樟腦, 芳樟醇和樟腦的保留時間分別為8.469、9.807 min, 山銀花露供試品溶液中加入內(nèi)標物樟腦, 測得相應的保留時間分別為8.431、9.794 min, 陰性樣品供試溶液色譜圖中無相應色譜峰。結(jié)果表明, 制劑處方中的輔料及色譜測定溶劑不影響芳樟醇及樟腦的定性和定量, 該分析方法具有較高的專屬性。

A: 芳樟醇對照品+內(nèi)標物(樟腦); B: 山銀花露揮發(fā)油+內(nèi)標物(樟腦); C: 山銀花陰性樣品。1: 芳樟醇; 2: 樟腦。圖1　氣相色譜圖

2.2線性關(guān)系以芳樟醇對內(nèi)標物濃度之比為橫坐標, 芳樟醇對內(nèi)標物的峰面積之比為縱坐標, 繪制標準曲線, 得出標準曲線回歸方程為y=66.455x+0.006 6(R2= 0.999 4), 表明在芳樟醇2.16～216 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3精密度同一濃度對照品供試溶液連續(xù)進樣6次, 芳樟醇對內(nèi)標物的峰面積比值的RSD=0.9%, RSD<2.0%, 表明該方法儀器精密度良好。

2.4重復性同批次樣品供試品溶液連續(xù)進樣6次, 芳樟醇對內(nèi)標物的峰面積比值的RSD=1.2%, RSD<2.0%, 表明該方法重復性良好。

2.5穩(wěn)定性供試品溶液配制后不同時間進樣, 芳樟醇對內(nèi)標物的峰面積比值RSD=1.9%, RSD<2.0%, 表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定, 方法穩(wěn)定性良好。

2.6加樣回收率加樣回收率結(jié)果見表1, RSD<2.0%, 表明本試驗方法準確可靠。

表1山銀花露中芳樟醇加樣回收率試驗數(shù)據(jù)

取樣量(mL)樣品含量(μg)加入量(μg)測得增量(μg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10024.2821.6021.0097.210024.2821.6021.5899.910024.2821.6021.5499.798.41.410024.2821.6021.0697.510024.2821.6020.8996.710024.2821.6021.4599.3

2.7樣品含量測定結(jié)果樣品含量結(jié)果見表2。

表2山銀花露中芳樟醇含量測定結(jié)果

樣品批號芳樟醇含量(μg/100mL)15102429.3315110724.2815111420.14

3　討論

芳香水劑為揮發(fā)油或其他揮發(fā)性芳香藥物的飽和或近飽和澄明水溶液, 露劑系指含揮發(fā)性成分的飲片用水蒸氣蒸餾法制成的芳香水劑[1-2]。本實驗中所制得的山銀花露為無色至淡黃色透明液體, 味道微甜, 帶有芳香氣味。因揮發(fā)油或揮發(fā)性物質(zhì)在水中的溶解度很小, 故芳香水劑中揮發(fā)性成分的濃度都很低, 因此本實驗參考有關(guān)文獻[14-17], 并結(jié)合產(chǎn)品和儀器實際情況, 采用氣相色譜法測定山銀花露中芳樟醇濃度。又由于氣相色譜法的進樣量一般僅數(shù)微升, 尤其當采用手工進樣時, 留針時間和室溫等對進樣量也有影響, 進樣誤差對結(jié)果的影響較大。為減少進樣等操作過程的誤差, 故采用內(nèi)標法定量。

已有文獻[8,18]研究結(jié)果表明, 山銀花中芳樟醇含量顯著低于金銀花, 而本文中自制山銀花露中芳樟醇的含量卻顯著高于文獻報道中以類似方法制備的金銀花露中芳樟醇的含量[13]。這很可能與測定中揮發(fā)油提取環(huán)節(jié)有關(guān), 本文所建立的方法中, 提取揮發(fā)油時, 在露劑中加入一定量的氯化鈉, 促進油水分層, 便于除去水分獲得揮發(fā)油, 使得揮發(fā)性成分提取更加完全。然而，當然也提示有必要通過更多研究來探索和確證山銀花中揮發(fā)性充分等效用成分與金銀花的異同。

山銀花露的開發(fā)研究, 對山銀花的綜合利用、相關(guān)產(chǎn)業(yè)的開發(fā)和地域經(jīng)濟的發(fā)展具有一定的參考價值[19]。質(zhì)量控制是其中主要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文采用氣相色譜法建立了山銀花露中芳樟醇含量的測定方法。結(jié)果表明該方法簡便、可靠、重復性強, 為山銀花露的質(zhì)量控制提供了試驗依據(jù)。該方法也可為其它制劑中芳樟醇等揮發(fā)性成分的檢測提供參考。

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[收稿2016-06-14;修回2016-07-16]

(編輯：王靜)

Determination of linalool in Flos Lonicerae distillate with gas chromatography

TangFushan,QinFei,WuQing,ZhouXumei

(School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To establish the gas chromatography method for determination of linalool in Flos Lonicerae distillate.Methods Flos Lonicerae distillate was prepared by steam distillation. The volatile constituents represented by linalool in Flos Lonicerae distillate were determinated by gas chromatography with camphor as internal standard. Agilent HP-5MS colummn (30 m×0.32 mm×0.25 μm﹚was used as stationary phase with programmed temperature from 70 ℃ to 250 ℃. The temperature of vaporizing chamber was set as 260 ℃. High purity nitrogen was used as carrier gas with a flow rate of 1 mL/min. The injection volume was set as 3 μL.Results The pharmaceutical adjuncts and the solvents did not disturb the determination. Good linearity could be found between the peak area ratio and the concentration ratio of linalool vs. internal standard at linalool concentration of 2.16～216 μg/mL with regression equation,y= 66.455x+ 0.006 6 (R2= 0.999 4). The average sample recovery rate of linalool was 98.4% with RSD of 1.4%.Conclusion The GC method could be used for quality control of Flos Lonicerae distillate for its specificity, good precision and high accuracy.

linalool; gas chromatography (GC); Flos Lonicerae; distillate; quality control

國家自然科學基金資助項目(NO：31460246)；貴州省科學技術(shù)基金資助項目(NO：黔科合J字[2013]2323);遵義醫(yī)學院博士科研啟動基金資助項目(NO：F-583)

周旭美，女，教授，碩士生導師，研究方向：藥物質(zhì)量標準建立及新藥研發(fā)，E-mail:546265853@qq.com。

R917

A

1000-2715(2016)04-0423-04