韓　勇，郭立榮，賀　滟，劉萬力，王　梅，趙紅艷，何　婭

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

20-HETE對大鼠心肌缺血再灌注損傷中NADPH氧化酶活性及ROS生成的影響*

韓勇1，郭立榮2，賀滟1，劉萬力1，王梅1，趙紅艷1，何婭1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室，貴州 遵義563099)

目的 探討20-HETE加重大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的作用及機制。方法 雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(Con組)，缺血再灌注模型組(IR組)，IR+20-HETE合成酶抑制劑(HET0016)組，Con+HET0016組，每組12只，通過Langendorff灌流系統(tǒng)建立大鼠離體心肌缺血再灌注模型，全心缺血35 min再灌注40 min，PowerLab/8P系統(tǒng)實時監(jiān)測心肌力學(xué)指標(biāo)；灌流結(jié)束后取心肌組織TTC法檢測心肌梗死面積；DHE熒光探針法檢測活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量；Western blot檢測NADPH氧化酶亞基p47phox磷酸化水平；細(xì)胞色素C的還原法檢測NADPH氧化酶活性。結(jié)果 離體心臟缺血再灌注后，加入20-HETE合成酶抑制劑HET0016(1 μmol/L)后明顯改善了IR導(dǎo)致的心肌力學(xué)指標(biāo)下降，LVDP由IR組的(48.6±3.4)%升至(71.7±3.5)%，+dP/dtmax由(51.9±2.1)%升至(69±3.2)%，-dP/dtmax由(47.1±3.6)%升至(64.1±3.8)%(P<0.05)；IR+HET0016組心肌梗死面積比IR組減小了37.2%(P<0.05)。DHE熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)IR+HET0016處理組心肌組織中ROS含量比IR組降低了45.8%(P<0.05)；最后通過對NADPH氧化酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，HET0016顯著減少了IR引起的NADPH氧化酶p47phox亞基磷酸化水平及全酶活性的升高(P<0.05)。結(jié)論 20-HETE通過激活NADPH氧化酶誘導(dǎo)過量ROS的生成，加重心肌缺血再灌注損傷。

20-羥二十烷花生四烯酸；大鼠；心肌缺血再灌注損傷；活性氧簇；NADPH氧化酶

20-羥二十烷花生四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid, 20-HETE)是由細(xì)胞色素P-450(ω-羥化酶)催化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)生成的內(nèi)源性活性物質(zhì)，目前被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腎、腦等小動脈血管緊張度的重要因子[1-3]，但其對心臟功能的影響研究甚少。近年來有研究報道，在大鼠和犬的心臟中鑒定出CYP4A和4F表達(dá)，在心肌缺血再灌注損傷中，20-HETE水平明顯增加，心肌組織中CYP 4A、4F表達(dá)和活性顯著增強，應(yīng)用CYP ω-羥化酶抑制劑，如17 ODYA和DDMS，可改善再灌注后的心肌功能恢復(fù)，減少心肌梗死面積[4-5]。上述研究表明，20-HETE參與到了心肌缺血再灌注當(dāng)中，加重了再灌注后心肌損傷，但是其中確切的分子機制仍不明確。

在心肌缺血再灌注中，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是引起心肌缺血再灌注損傷的主要啟動因子[6-7]，但ROS生成的來源及具體機制尚待深入研究。因此，本研究的目的是在大鼠離體心臟缺血再灌注模型上，研究20-HETE對心肌功能及ROS生成的影響和機制，從而探究20-HETE加重再灌注后心肌損傷的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑雄性Wistar大鼠(220±20)g隨機分為正常對照組(Con組)，缺血再灌注模型組(IR組)，IR+20-HETE合成酶抑制劑(HET0016)組，Con+HET0016組，每組12只，實驗前標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)1周。

20-HETE購于Sigma公司，ROS檢測試劑盒及NADPH氧化酶活性檢測試劑盒購于南京建成生物制品公司，特異性p47phox和磷酸化p47phox抗體、HRP標(biāo)記的二抗購自Santa生物技術(shù)公司，其他試劑均采用化學(xué)分析純。

1.2方法

1.2.1動物模型建立大鼠使用烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，開胸取出心臟置于4 ℃的KH液(含肝素，50 U/mL)中修剪，將主動脈套管后置于Langendorff心臟灌流系統(tǒng)上，37 ℃下使用KH液(NaCl 118.0 mmol/L, NaHCO325.0 mmol/L, KCl 4.7 mmol/L, KH2PO41.2 mmol/L, MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L, CaCl22.0 mmol/L, glucose 11.0 mmol/L)進行主動脈逆行灌流。經(jīng)大鼠左心房插入左心室一個充水小球囊，另一端連接到壓力傳感器監(jiān)測心室內(nèi)壓變化。使用Powerlab/8P系統(tǒng)連續(xù)記錄左心室發(fā)展壓(LVDP)，左心室舒張末期壓(LVEDP)，左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dP/dtmax)。

1.2.2心肌缺血再灌注實驗方案37 ℃條件下，離體心臟缺血前灌流20 min平衡，HET0016組心臟在缺血前10 min灌流HET0016(1 μmol/L)，然后全心缺血35 min，再灌注15 min后檢測ROS水平，或者再灌注40 min后用于檢測NADPH氧化酶活性，或者再灌注120 min用以檢測心肌梗死面積。PowerLab/8P系統(tǒng)實時檢測缺血前及再灌后的左心室功能及血流動力學(xué)變化。

1.2.3心梗面積測定再灌注后的心臟在-20 ℃下冷凍1 h，切片(2～3 mm)放入含有1% TTC的磷酸鹽緩沖液中，37 ℃條件下孵育15 min染色，10%甲醛固定。梗死區(qū)通過測定染色區(qū)域(紅色，存活組織)和非染色區(qū)域(白色，壞死組織)面積占全部左心室面積比值后進行比較。

1.2.4心肌ROS水平測定ROS的生成使用對氧敏感的熒光探針DHE法測定，離體心臟再灌注15 min后，剪成100 mm3的小塊置入組織包埋劑中，液氮冷凍，冰凍切片(10 μm)后置于載玻片上，然后將切片在PBS緩沖液中使用DHE (1.6 μmol/L) 37 ℃避光孵育30 min，激光共聚焦顯微鏡下在488 nm激發(fā)光，560～660 nm濾波接收，獲取熒光照片。

1.2.5NADPH氧化酶p47phox亞基磷酸化水平測定離體心臟再灌注后，取大鼠左心室樣品(非梗死區(qū))約100 mg，液氮內(nèi)研磨，加入全細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，用勻漿機充分勻漿，冰上處理30 min，4 ℃ 12 000 g 離心15 min，取上清BAC法蛋白質(zhì)定量。NADPH氧化酶p47phox亞基磷酸化水平采用Western blot法測定，組織提取蛋白使用梯度SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干轉(zhuǎn)儀將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗p47phox(1∶1 000)、磷酸化p47phox(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。PBS洗膜后加入HRP標(biāo)記二抗(羊抗鼠 IgG-HRP，1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，ECL檢測試劑盒曝光，Quantity One蛋白條帶進行分析。

1.2.6NADPH氧化酶活性檢測NADPH氧化酶活性檢測采用對超氧化物歧化酶(SOD)敏感的NADPH氧化酶對細(xì)胞色素C的還原法，由心肌組織提取的全蛋白(終濃度1 mg/mL，100 μL)中加入細(xì)胞色素C(500 μmol/L)和NADPH(100 μmol/L)，分別在加入和不加入SOD(200 U/mL)情況下，室溫孵育30 min，550 nm波長下檢測吸光度，過氧化物產(chǎn)物含量(nmol/mg protein)通過不同吸光值進行比較計算，高鐵細(xì)胞色素C到亞鐵細(xì)胞色素C變化的摩爾吸光系數(shù)(ε) 21 000 M-1cm-1。

計，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HET0016對離體心臟缺血再灌注后心肌力學(xué)的影響應(yīng)用Powerlab/8P系統(tǒng)連續(xù)實時記錄大鼠離體心臟灌流過程中各組心臟血流動力學(xué)功能改變。與正常對照Con組相比，再灌注末期IR組心臟的各項心肌力學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)顯著下降，左心室發(fā)展壓(LVDP)下降至(48.6±3.4)%，左心室舒張末期壓(LVEDP)升高至(41.8±3.3)%，左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dP/dtmax)分別降低至(51.9±2.1)%和(47.1±3.6)%(P<0.05)。缺血前10 min灌注20-HETE合成酶抑制劑HET0016(1 μmol/L)后，相比于IR組再灌注末期心肌力學(xué)指標(biāo)明顯改善，LVDP上升至(71.7±3.5)%，LVEDP降至(32.1±4.5)%，±dP/dtmax分別提高至(69.0±3.2)%和(64.1±3.8)%(P<0.05)。Con對照組中加入HET0016后對心肌力學(xué)指標(biāo)影響不明顯(P>0.05，見圖1，表1)。

圖1　心臟灌流實時心肌功能記錄

組別缺血再灌注后(占缺血前平衡期百分比%)LVDPLVEDP+dP/dtmax-dP/dtmaxCon組95.0±2.35.4±1.493.3±1.989.4±1.8IR組48.6±3.4*41.8±3.3*51.9±2.1*47.1±3.6*IR+HET0016組71.7±3.5#32.1±4.5#69.0±3.2#64.1±3.8#Con+HET0016組93.9±3.36.2±2.491.1±3.990.3±2.7

*：P<0.05，與Con組相比；#：P<0.05，與IR組相比。

2.2HET0016對離體心臟缺血再灌注后心肌梗死面積的影響離體心臟全心缺血35 min再灌注120 min后，通過TTC染色法檢測心肌梗死面積。與正常對照組相比，再灌注后IR組心肌梗死面積達(dá)到了(39.8±2.3)%，而加入HET0016組有效減少了由于IR引起的梗死面積增加，心肌梗死減少至(29.6±2.4)%(P<0.05)。Con+HET0016組心肌梗死面積與正常對照組相比變化不明顯(P>0.05，見圖2)。

2.320-HETE對再灌注后心肌組織ROS生成的影響研究認(rèn)為ROS是引起缺血再灌注損傷的主要啟動因子，但其生成的來源及具體機制尚待深入研究。因此本研究應(yīng)用DHE熒光探針法檢測了HET0016對心肌再灌注后ROS生成的影響。與正常對照組相比，再灌注后IR組熒光強度由19增加至105；缺血前灌流液中加入HET0016(1 μmol/L)后心肌組織熒光強度為72，顯著低于IR組(P<0.05)；Con+HET0016組心肌組織熒光強度較正常對照組無明顯變化(P>0.05，見圖3)。

A：TTC染色法檢測所得心肌梗死面積；B：心肌梗死面積統(tǒng)計分析；*：P<0.05，與Con組相比；#：P<0.05，與IR組相比。 　　圖2　HET0016對離體心臟缺血再灌注后心肌梗死面積的影響

A：各組心肌組織熒光照片(200×)；B：熒光值統(tǒng)計分析；*：P<0.05，與Con組相比；#：P<0.05，與IR組相比。圖3　HET0016對再灌注后心肌組織ROS生成的影響

2.4HET0016對再灌注后NADPH氧化酶亞基p47phox磷酸化及全酶活性的影響有研究表明心肌缺血再灌注損傷中ROS過量生成與NADPH氧化酶激活有關(guān)，NADPH氧化酶由多種亞基構(gòu)成，其中p47phox亞基磷酸化是其被激活的關(guān)鍵步驟，因此本研究應(yīng)用Western Blot方法檢測了HET0016對NADPH氧化酶亞基p47phox磷酸化的作用，采用細(xì)胞色素C還原法檢測NADPH氧化酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，缺血再灌注后的IR組心肌組織中磷酸化的p47phox亞基由(22.5±2.3)%增加至(53.5±4.4)%；而當(dāng)應(yīng)用HET0016阻斷該進程中20-HETE合成后，心肌組織中磷酸化的p47phox亞基減少至(32.7±5.3)%，顯著低于IR組(P<0.05)；通過對NADPH氧化酶全酶活性檢測發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，再灌注后IR組心臟NADPH氧化酶活性由正常對照組的11.2升高至18.3；HET0016組心臟NADPH氧化酶活性降低至13.9，顯著低于IR組(P<0.05)；Con+HET0016組心肌組織中p47phox亞基磷酸化水平及NADPH氧化酶活性無明顯變化(P>0.05，見圖4)。

A：p47phox亞基磷酸化免疫印跡結(jié)果和p47phox亞基磷酸化統(tǒng)計分析；B：NADPH氧化酶活性統(tǒng)計分析；*：P<0.05，與Con組相比；#：P<0.05，與IR組相比。圖4　HET0016對NADPH氧化酶亞基p47phox磷酸化及全酶活性的影響

3　討論

近年來一些研究報道了在心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)中，冠狀靜脈血漿內(nèi)20-HETE水平含量增高，同時心肌組織中CYP ω-羥化酶活性顯著增強[4-5]。在大鼠離體心臟灌流中應(yīng)用非特異性CYP450酶的抑制劑(如氯霉素、西米替丁、磺胺苯吡唑等)，或者在缺血再灌注中應(yīng)用特異性CYP ω-羥化酶抑制劑(如17ODYA、DDMS)均可減少心肌再灌注后的損傷，與之相反，當(dāng)外源加入20-HETE后，可加重缺血再灌注損傷，降低了心肌再灌注后功能的恢復(fù)[4-5,8]。如上發(fā)現(xiàn)與本研究中20-HETE對離體缺血再灌注后的心臟功能影響結(jié)果相一致，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用20-HETE合成酶的特異性阻斷劑HET0016后，減少MIRI進程中20-HETE合成可明顯改善再灌注后心肌力學(xué)指標(biāo)，與IR組心臟相比較，IR+HET0016組心臟再灌注后心肌功能顯著恢復(fù)，再灌注結(jié)束時左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dP/dtmax)出現(xiàn)明顯回升，而左心室末期舒張壓(LVEDP)明顯下降；同時心肌梗死面積顯著減少(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明20-HETE參與到MIRI當(dāng)中，但是其加重再灌注后損傷、降低心肌功能的分子細(xì)胞機制尚需進一步探究。

眾多研究證明，ROS的過量生成在MIRI進程中發(fā)揮了主要作用，使用抗氧化劑清除ROS可明顯改善心肌再灌注后功能的恢復(fù)，被認(rèn)為是引起缺血再灌注損傷的主要啟動因子[6-7]。由于心臟中缺乏抗氧化酶，因此對于ROS的敏感性高于其他組織器官。一般認(rèn)為ROS從再灌注開始便產(chǎn)生，4～7 min后達(dá)到峰值，當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS后，可以損傷亞細(xì)胞組分，如降解膜磷脂，使蛋白質(zhì)過氧化損傷及攻擊DNA。這其中過量生成的ROS對細(xì)胞內(nèi)可收縮性蛋白的損傷可能直接導(dǎo)致了心肌收縮性能的下降。已有研究表明，心肌缺血后的肌鈣蛋白及肌動蛋白均發(fā)生了氧化損傷而影響缺血后的心肌的收縮功能[9-10]。這提示20-HETE造成心肌缺血再灌注后心肌血流動力學(xué)下降可能與其促進ROS生成增多、造成收縮相關(guān)蛋白氧化損傷有關(guān)。因此，本研究應(yīng)用DHE熒光探針法通過激光共聚焦顯微鏡，檢測了在MIRI進程中抑制20-HETE的合成后對離體心肌再灌后ROS生成的影響，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注誘導(dǎo)心肌組織內(nèi)ROS大量的生成，在此基礎(chǔ)上加入HET0016處理后，心肌組織中的ROS熒光強度顯著減少(P<0.05)。如上結(jié)果表明，在MIRI中，20-HETE誘發(fā)了心肌組織過量ROS的生成。

缺血再灌注中ROS生成主要來源于線粒體呼吸鏈、NADPH氧化酶、一氧化氮合酶等。在這些來源中，NADPH氧化酶不同于其他來源的復(fù)雜之處在于其生成ROS受到高度的調(diào)控。NADPH氧化酶由多個亞基構(gòu)成，包括位于胞膜上的gp91phox和p22phox結(jié)合而成的二聚體，另外包括位于胞質(zhì)內(nèi)的p47phox、p40phox、p67phox以及Rac2等亞基成分[11]，這其中p47phox亞基是NADPH氧化酶胞質(zhì)和胞膜各組分之間的連接蛋白，首先在一些刺激因素作用下，p47phox被磷酸化，進而與p67phox發(fā)生相互作用，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜上而激活NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS，因此p47phox磷酸化是NADPH氧化酶激活的關(guān)鍵步驟[12-13]。目前有研究報道MIRI進程中NADPH氧化酶的激活可誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的ROS而造成心肌過氧化損傷[11,14-15]。因此，為了探究在心肌細(xì)胞MIRI進程中，20-HETE誘導(dǎo)的ROS生成是否與其激活NADPH氧化酶相關(guān)，本研究檢測了MIRI中抑制20-HETE合成后對NADPH氧化酶活性以及p47phox亞基磷酸化作用的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，IR+HET0016組心肌組織中磷酸化的p47phox亞基顯著低于IR組(P<0.05)。通過對NADPH氧化酶全酶活性檢測也發(fā)現(xiàn)，再灌注后IR+HET0016組心肌組織NADPH氧化酶活性比IR組明顯降低(P<0.05)。如上結(jié)果表明，在MIRI進程中，20-HETE通過激活NADPH氧化酶的活性，從而誘導(dǎo)過量ROS的生成，最終加重心肌再灌注后的損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠離體缺血再灌注模型中，導(dǎo)致所述MIRI的機制與20-HETE提高p47phox磷酸化水平從而激活NADPH氧化酶，誘導(dǎo)過量ROS的生成有關(guān)，因此造成心肌功能下降，梗死面積增加，為臨床治療缺血性心肌病提供了一定的理論依據(jù)。

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[收稿2016-05-08;修回2016-06-16]

(編輯：王靜)

Effect of 20-HETE on NADPH oxidase activity and ROS production of rats with myocardial ischemia reperfusion injury

HanYong1,GuoLirong2,HeYan1,LiuWanli1,WangMei1,ZhaoHongyan1,HeYa1

(1. Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Morphological Laboratory, School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate the effect and mechanism of 20-HETE aggravates myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Methods Male Wistar rats were randomly divided into normal control group (Con), ischemia-reperfusion group (IR), IR+inhibitor of 20-HETE production (HET0016) group and Con+HET0016 group, with 12 rats in each group. Experiments were performed in isolated rat hearts subjected to 35 min of ischemia followed by 40 min of reperfusion in Langendorff preparations. Cardiac contractility was continuously recorded with the Powerlab/8P system. Myocardial infarct size was measured by TTC staining. The level of reactive oxygen species (ROS) was determined by DHE fuorescence. Phosphorylation of p47phox, a cytosolic component of NADPH oxidase, was detected by Western blot method. NADPH oxidase activity was evaluated by NADPH-dependent superoxide production examined using SOD-inhibitable cytochrome c reduction.Results At the end of reperfusion, administration of HET0016 (an inhibitor of 20-HETE production, 1 μmol/l) significantly ameliorated the inhibited cardiac function induced by IR, including augmented LVDP from (48.6±3.4)% to (71.7±3.5)%, +dP/dtmaxfrom (51.9±2.1)% to (69±3.2)% and -dP/dtmaxfrom (47.1±3.6)% to (64.1±3.8)% (P<0.05). Treatment of the heart with HET0016 significantly attenuated the IR-induced increase in cardiac infarct size by 37.2% (P<0.05). Compared with the IR group, IR+HET0016 treatment significantly reduced the IR-induced increase in DHE fluorescent intensity by 45.8% (P<0.05). Finally, HET0016 also decreased the phosphorylation level of p47phoxand depressed NADPH oxidase activity resepectively(P<0.05).Conclusion 20-HETE could stimulate NADPH oxidase-derived superoxide production, which aggravated IR-induced myocardial injury.

20-HETE; rat; myocardial ischemia reperfusion injury; reactive oxygen species; NADPH oxidase

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO：81460040)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目(NO：黔科合LH字[2014]7544)。

R542.2

A

1000-2715(2016)04-0366-06